454測(cè)序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

段曌，肖煒，王永霞，賴泳紅，崔曉龍

(云南大學(xué)云南省微生物研究所，云南昆明650091)

微生物生態(tài)學(xué)是研究微生物與其周圍的生物及非生物環(huán)境的相互作用規(guī)律的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)研究是基于微生物的直接培養(yǎng)來分析環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的，微生物純培養(yǎng)及顯微技術(shù)作為鑒定微生物種群的手段有很大的局限性，因?yàn)榄h(huán)境中大多數(shù)微生物處于“存活但不能培養(yǎng)”(viable but nonculturable，VBNC)的狀態(tài)［1］。因此，不依賴于微生物純培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法正被廣泛地用于微生物生態(tài)學(xué)研究，即微生物分子生態(tài)學(xué)。20世紀(jì)90年代以來，微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)層出不窮，大大加速了微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展。近年來，第2代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得微生物生態(tài)學(xué)的研究更加深入和便捷。以Sanger法(雙脫氧核苷酸末端終止法)為代表的第1代測(cè)序技術(shù)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組的大量測(cè)序工作，但由于其成本高、速度慢、通量低等不足，已不能滿足后基因組時(shí)代的測(cè)序要求［2］。因此，第2代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。第2代測(cè)序技術(shù)主要包括454公司的GS FLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)［3］。目前，在微生物生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是GS FLX測(cè)序平臺(tái)。這種高通量低成本的測(cè)序方法為環(huán)境微生物多樣性研究提供了新的手段，大大推動(dòng)了環(huán)境基因組研究的快速發(fā)展，使得大規(guī)模的環(huán)境基因組研究相繼展開，大量的新的微生物種群和新的基因得以發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用454測(cè)序技術(shù)的研究論文每月數(shù)以百計(jì)地發(fā)表，本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究成果，對(duì)近年來運(yùn)用454測(cè)序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其研究前景進(jìn)行介紹。

1 454測(cè)序技術(shù)原理

GS FLX系統(tǒng)的測(cè)序流程概括起來就是“1個(gè)片段=1個(gè)磁珠=1條讀長(zhǎng)(One fragment=One bead=One read)”。特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠與獨(dú)特的短的DNA片段結(jié)合，并被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含1個(gè)磁珠和1個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。攜帶短的PCR產(chǎn)物片段的捕獲磁珠隨后放入只能容納1個(gè)磁珠的PTP板中進(jìn)行測(cè)序。放置在4個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的4種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入1個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放1個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下，釋放出光信號(hào)，并實(shí)時(shí)地被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有1個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)，由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。GS FLX系統(tǒng)在10 h的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過4～6億個(gè)堿基信息。除GS FLX系統(tǒng)提供的生物信息學(xué)工具外，目前也有很多程序包和數(shù)據(jù)庫可用于大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，如CAMERA［4］、Mothur［5］、FastUnifac［6］等。

2 454測(cè)序技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用

454測(cè)序技術(shù)適于對(duì)短序列的測(cè)序分析，其可重復(fù)性和精確性能與Sanger測(cè)序法相媲美，而速度和數(shù)據(jù)量卻大大提高，無需文庫構(gòu)建，沒有克隆的誤差，能最大程度地節(jié)約人力、物力。目前，該技術(shù)在土壤、海洋、活性污泥、廢水、食品、化妝品、礦井和鹽湖等環(huán)境微生物多樣性研究中都有應(yīng)用。

2.1 454測(cè)序技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用

土壤由固體、液體和氣體3類物質(zhì)組成，土壤微生物一般包括細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物、病毒及類病毒。土壤微生物種類和數(shù)量隨成土環(huán)境及土層深度的不同而變化。Roesch等［7］利用454技術(shù)研究了位于西半球一個(gè)橫斷面的4類土壤中微生物的多樣性，結(jié)果顯示，這4類土壤中，最豐富的微生物類群是擬桿菌門(Bacteroidetes)、α-變形菌門和β-變形菌門。與農(nóng)業(yè)土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而森林土壤中的古菌多樣性較少。此研究證實(shí)，是否采取農(nóng)業(yè)化管理對(duì)于土壤中古菌和細(xì)菌多樣性的影響是顯著的。這一結(jié)論也得到了Campbell等的證實(shí)。Campbell［8］的研究表明，長(zhǎng)期施肥的北極凍土帶土壤微生物不僅多樣性較低，而且被其利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，這與土壤中所含碳氮的可利用性以及表層植物的變化有關(guān)。除了應(yīng)用于原核生物的研究，Lim等［9］也應(yīng)用454技術(shù)研究韓國(guó)黃海3個(gè)島嶼的土壤真菌多樣性。他們不僅發(fā)現(xiàn)此前未知的土壤真菌豐富的多樣性，還證明454測(cè)序技術(shù)也適于土壤真菌多樣性的研究。同樣，454測(cè)序技術(shù)在功能微生物的研究中也表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值。例如研究含高CO2土壤里微生物群落的結(jié)構(gòu)及功能［10］以及農(nóng)用土壤里氨單加氧酶基因(amoA)豐度［11］。這些研究更深刻地揭示了功能微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用。由此可見，應(yīng)用454測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤微生物的研究大大擴(kuò)展了對(duì)土壤微生物多樣性的認(rèn)識(shí)，大量未知的微生物及其在土壤中的功能得以了解，周圍土壤環(huán)境對(duì)微生物的影響作用得以證實(shí)，隨著454技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中將會(huì)起到越來越重要的作用。

2.2 454測(cè)序技術(shù)在海洋微生物多樣性研究中的應(yīng)用

海洋堪稱為地球上最龐大的恒化器，能承受巨大的沖擊(如污染)而仍保持其生命力和生產(chǎn)力，而微生物是其中不可缺少的活躍因素。盡管海洋中存在著豐富的微生物，但是研究手段的限制成為當(dāng)代海洋微生物學(xué)研究和海洋資源開發(fā)的障礙。所以，近幾年，許多科學(xué)家開始采用高通量測(cè)序法來研究海洋微生物。Sogin等［12］檢測(cè)深海和未探索的稀有生物圈(rare biosphere)，即位于大西洋東部海山中軸熱泉中的微生物多樣性。454測(cè)序結(jié)果顯示，大西洋海底和熱泉中的微生物比以前報(bào)道的數(shù)量要高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，并且微生物類群也比以前報(bào)道的要復(fù)雜得多。此未探索的稀有生物圈中的微生物是非常古老的，它們不僅可以提供新的基因組數(shù)據(jù)，在地球歷史的不同時(shí)期，還對(duì)地球的演變進(jìn)程產(chǎn)生過深刻的影響。Hube等［13］研究?jī)舌徑詈崛形⑸锒鄻有院头N群結(jié)構(gòu)，檢測(cè)到了許多細(xì)菌新類群，結(jié)果表明，這2眼熱泉微生物種群結(jié)構(gòu)的不同與當(dāng)?shù)氐牡乩砬闆r相關(guān)。由此說明獲取成千上萬條序列是有必要的，這將極大地促進(jìn)海洋微生物資源的開發(fā)。作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，珊瑚的健康向來受到研究者的關(guān)注。Gaidos等［14］采用454測(cè)序法，研究夏威夷島深海珊瑚礁微生物的群落空間結(jié)構(gòu)及其多樣性，發(fā)現(xiàn)最豐富的細(xì)菌類群是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門，最豐富的古菌類群是亞硝化侏儒菌目(Nitrosopumilales)、廣古菌門(Euryarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)。針對(duì)珊瑚礁與微生物之間的關(guān)系，Elizabeth［15］研究位于萊恩群島北部的4個(gè)環(huán)狀珊瑚礁島的微生物多樣性，分析微生物對(duì)珊瑚礁的影響作用。發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)珊瑚礁的生態(tài)系統(tǒng)功能具有顯著影響，是維持珊瑚健康生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。

Dos Santos等［16］為研究石油對(duì)紅樹林沉積物中微生物多樣性的影響作用，模擬石油泄漏，污染紅樹林沉淀物，然后進(jìn)行454測(cè)序。結(jié)果顯示，污染前后相比，污染后的紅樹林沉積物中微生物類群明顯較多，而γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)都廣泛存在。污染后的紅樹林沉積物中，Chromatiales和Haliea的數(shù)量減少2%～5%，海桿菌屬(Marinobacter)、海細(xì)菌屬(Marinobacterium)和解環(huán)菌屬(Cycloclasticus)的數(shù)量增多，該結(jié)果暗示，這些微生物都可以作為石油污染的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

除了原核生物，海洋中還含有數(shù)量巨大，多種多樣的病毒。Angly［17］對(duì)從4大洋的68個(gè)樣點(diǎn)采集到的樣品進(jìn)行454測(cè)序，分析得到了184個(gè)病毒群，這些病毒是典型的海洋病毒系，具有豐富的多樣性，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的病毒序列并不相似。病毒總體的多樣性非常高，大概有成百上千個(gè)物種，而且區(qū)域豐度隨著南北緯度而變化。

海洋微生物資源是一個(gè)十分巨大的有待深入開發(fā)的資源庫，采用高通量深度測(cè)序?qū)⑻峁└嗟暮Ｑ笪⑸镄畔?，這些信息在第2代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)前是很難獲得的，這為今后的海洋資源開發(fā)和持續(xù)利用奠定良好的基礎(chǔ)。

2.3 454測(cè)序技術(shù)在沼氣發(fā)酵和活性污泥微生物研究中的應(yīng)用

沼氣是可再生的清潔能源，既可替代秸稈、薪柴等傳統(tǒng)生物質(zhì)能源，也可替代煤炭等商品能源，而且能源效率明顯高于秸稈、薪柴、煤炭等。早在18世紀(jì)科學(xué)家們就開始研究沼氣了，對(duì)于發(fā)酵沼氣的微生物研究也越來越多。Jaenicke等［18］采用第2代454測(cè)序系統(tǒng)分析沼氣發(fā)酵罐中微生物的多樣性，檢測(cè)出之前未出現(xiàn)的Streptococcus(鏈球菌屬)、Acetivibrio(醋弧菌屬)、Garciella、Tissierella(泰氏菌屬)和Gelria，它們?cè)诎l(fā)酵罐中對(duì)于沼氣的形成起著重要作用。與之前采用第1代454測(cè)序系統(tǒng)研究沼氣發(fā)酵罐中微生物的多樣性結(jié)果相比，采用新1代454測(cè)序技術(shù)可以獲得更多的微生物組成信息。由于454測(cè)序技術(shù)的驚人發(fā)展速度，同樣的樣品進(jìn)行多次分析，可以提供更為豐富的結(jié)果。

活性污泥(active sludge)是微生物群體及它們所依附的有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)的總稱。Sanapareddy［19］對(duì)廢水處理廠的活性污泥提取的總DNA進(jìn)行454測(cè)序，這些序列只有0.3%組裝成有意義的重疊群。猜測(cè)其中117個(gè)大于500 bp的重疊群可能為轉(zhuǎn)座酶和蛋白。通過將所得的序列與已知微生物基因組進(jìn)行比較，得知污水處理廠中的絕大多數(shù)微生物與先前描述的分類單元親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Kwon等［20］運(yùn)用同樣的測(cè)序技術(shù)研究污水的懸浮樣本和IFAS system(Integrated fixed-film activated sludge system，集成固定膜活性污泥體系)膜上的微生物組成和多樣性。比較發(fā)現(xiàn)，懸浮樣本中最豐富的微生物類群是β-變形菌綱、γ-變形菌綱、擬桿菌門等，而FAS system膜上樣本中最豐富的微生物類群是放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等，系統(tǒng)發(fā)育表明樣本中微生物大都為稀有物種。這些研究中獲得的信息將為以后關(guān)于活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的研究以及對(duì)IFAS系統(tǒng)功能的了解奠定基礎(chǔ)。

2.4 454測(cè)序技術(shù)在食品和化妝品微生物中的應(yīng)用

隨著454測(cè)序技術(shù)的成熟，該技術(shù)的運(yùn)用范圍越來越廣。Li等［21］采用454測(cè)序技術(shù)研究中國(guó)傳統(tǒng)酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌與真菌的多樣性。檢測(cè)到的細(xì)菌分屬于15個(gè)科，多于91%的16S rRNA基因序列歸屬于乳酸桿菌科;真菌分屬于6個(gè)科，60%的真菌ITS1(Internal transcribed spacer region 1)序列歸屬于酵母科。Lopez-Velasco等［22］采用454測(cè)序技術(shù)，研究菠菜在冷藏前后所含微生物的變化。得知菠菜冷藏后包含了許多與冷藏前不同的微生物類群，冷藏后微生物群落的豐富性、多樣性、均一度都降低。Telias［23］采用2種不同的水資源，即地下水和地表水，灌溉西紅柿研究其表面微生物的多樣性。454結(jié)果顯示，與地表水相比，地下水中細(xì)菌的多樣性更為豐富，采用這2種水資源對(duì)西紅柿噴灑灌溉不會(huì)對(duì)西紅柿表面細(xì)菌群落組成產(chǎn)生影響，即西紅柿表面細(xì)菌群落組成無差異。目前，隨著454測(cè)序技術(shù)的不斷完善，以其強(qiáng)大的信息量作為優(yōu)勢(shì)，與日常生活息息相關(guān)的各類食品開始被嘗試采用此技術(shù)對(duì)其所含微生物進(jìn)行檢測(cè)。Maiuta等［24］運(yùn)用454測(cè)序技術(shù)研究化妝品制劑碳酸鈣中微生物多樣性。結(jié)果表明，化妝品制劑碳酸鈣中不存在金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、大腸埃希菌(Escherichia coli)。此研究不僅可以用于確定化妝品制劑碳酸鈣中微生物的多樣性，還明確了化妝品或原材料中指示微生物的存在。這一研究確保一些潛在的重要微生物在危險(xiǎn)評(píng)估中不被遺漏，為以后化妝品制劑碳酸鈣中微生物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

2.5 454測(cè)序技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

近幾年，454測(cè)序技術(shù)開始被運(yùn)用于極端環(huán)境微生物的研究，Hollister［25］采用該方法研究La Sal del Rey鹽湖底部沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)。與克隆方法相比，454測(cè)序發(fā)現(xiàn)了許多新的類群。結(jié)合這2種方法，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性。此研究不僅證實(shí)了微生物群落結(jié)構(gòu)與所在湖泊位置、磷、有機(jī)碳濃聚物及pH值有密切關(guān)系，而且顯示了運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)研究復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的價(jià)值。除此之外，Edwards［26］對(duì)美國(guó)明尼蘇達(dá)州Soudan礦井中2個(gè)位點(diǎn)的水和沉積物的宏基因組進(jìn)行分析，此2個(gè)位點(diǎn)地理位置鄰近而化學(xué)和水文地質(zhì)差異顯著。454測(cè)序結(jié)果顯示，2個(gè)位點(diǎn)的微生物代謝能力差異顯著，大多數(shù)微生物的新陳代謝能力與所在環(huán)境的地化條件有關(guān)，該礦井中的微生物群落與其他環(huán)境中的微生物群落是完全不同的。

科學(xué)家們相信，極端微生物是這個(gè)星球留給人類獨(dú)特的生物資源和極其珍貴的研究材料。開展極端微生物的研究，對(duì)于揭示生物圈起源的奧秘，闡明生物多樣性形成的機(jī)制，認(rèn)識(shí)生命的極限及其與環(huán)境的相互作用的規(guī)律等，都具有極為重要的科學(xué)意義。454測(cè)序技術(shù)為極端環(huán)境微生物的研究也帶來了極大的便利，使得那些極端環(huán)境中的稀有微生物得以被描述，為了解生命極限和微生物適應(yīng)機(jī)制，以及嗜極微生物資源的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)語與展望

到目前為止，大量的研究者應(yīng)用454測(cè)序技術(shù)對(duì)多種環(huán)境樣品的微生物多樣性進(jìn)行了深入研究，這些研究大大增長(zhǎng)了人類對(duì)微生物的存在和種類的認(rèn)識(shí)。針對(duì)不同的研究對(duì)象，454測(cè)序技術(shù)不僅為研究提供了大量數(shù)據(jù)，證實(shí)研究對(duì)象所含微生物具有較高的多樣性，而且還建立了一種研究復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)里的微生物多樣性方法。云南大學(xué)云南省微生物研究所始終致力于極端環(huán)境微生物資源的挖掘。目前，結(jié)合傳統(tǒng)克隆文庫法和454測(cè)序技術(shù)深入系統(tǒng)地研究云南多種高鹽環(huán)境中微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)454測(cè)序技術(shù)獲得了大量克隆方法無法檢測(cè)到的新的細(xì)菌類群和古菌類群，而所需的時(shí)間縮短到原來的1/3，獲得的數(shù)據(jù)量是同等經(jīng)費(fèi)下采用克隆方法所得數(shù)據(jù)量的近50倍，建立了應(yīng)用454測(cè)序技術(shù)研究極端高鹽環(huán)境的方法體系。

截止到2011年9月，羅氏公布了1 400多篇利用Genome Sequencer系統(tǒng)的、經(jīng)同行評(píng)議發(fā)表的高水平論文［27］。這些文章中許多發(fā)表于Nature、Science、Cell、Genome Research、PNAS等高水平雜志上。研究人員正利用454測(cè)序的高準(zhǔn)確率和超長(zhǎng)序列讀長(zhǎng)來迅速獲得高質(zhì)量DNA序列。這些研究跨越了測(cè)序應(yīng)用的多個(gè)方面，包括比較基因組學(xué)的從頭測(cè)序和重測(cè)序;小分子RNA研究;宏基因組測(cè)序;轉(zhuǎn)錄組圖譜分析(包括全轉(zhuǎn)錄組拼接和表達(dá)圖譜);染色體結(jié)構(gòu)和表觀遺傳學(xué);有關(guān)稀有變異檢測(cè)的超深度測(cè)序;研究古老DNA;微生物大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究等。

多種多樣的應(yīng)用彰顯出454測(cè)序系統(tǒng)應(yīng)對(duì)重要研究領(lǐng)域的能力。但由于該技術(shù)剛剛起步因此也存在一些有待改善的問題，如在測(cè)定一連串相同核苷酸時(shí)容易產(chǎn)生錯(cuò)誤;由于其依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測(cè)，與其他第2代測(cè)序技術(shù)相比，其試劑價(jià)格相對(duì)較高。同時(shí)，序列讀長(zhǎng)較短也是限制該技術(shù)應(yīng)用的原因之一。

雖然存在許多不足，454測(cè)序技術(shù)仍以其強(qiáng)大的測(cè)序能力滲透到生命科學(xué)研究的方方面面，包括那些此前無法用測(cè)序來解決的領(lǐng)域。在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，憑借著454測(cè)序技術(shù)各方面的優(yōu)勢(shì)，終究將成為未來研究環(huán)境基因組的主導(dǎo)測(cè)序技術(shù)，同時(shí)，隨著454技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)將為微生物生態(tài)學(xué)研究注入新的動(dòng)力，成為微生物生態(tài)學(xué)研究新的亮點(diǎn)，大大加速微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，增長(zhǎng)人類對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的認(rèn)識(shí)，為人類探索廣袤的微生物資源提供無限遐想。

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