藏豬IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表達

張飛燕，王振華，潘康成，唐慧琴，谷笑笑，李 偉

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，動物微生態(tài)研究中心，四川 成都 611130；2.成都農業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130)

類胰島素生長因子-1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)是從動物血清中發(fā)現(xiàn)的一種具有調控動物機體生長、發(fā)育和代謝的一個重要因子，主要介導生長激素發(fā)揮促生長作用[1]。IGF-1 為動物體內多功能生長因子，具有促進細胞對葡萄糖和氨基酸攝取與利用，增加糖原、脂肪和蛋白等的合成，刺激細胞遺傳物質的復制、細胞增殖分化、性腺分泌，促進產后動物泌乳以及新生動物的腸道發(fā)育[2-4]。IGF-1具有內分泌、旁分泌、自分泌特性，主要由肝臟合成分泌到血液中，依賴與IGFBPS家族基因的運載而提高IGF-1的半衰期，以及組織的偏向性而促進組織細胞的分化與增殖[5]。豬IGF-1基因位于體細胞的第5號染色體上，基因全長80 kb(含5個內含子和6個外顯子)，該基因具有高度的保守性，其成熟肽氨基酸序列與牛、人的相同，但與鼠有3～4個氨基酸相異[6-8]。研究表明，豬血漿中IGF-1 水平與體重及增重呈正相關，IGF-1基因可以作為影響動物生長發(fā)育的候選基因，該基因受到研究者的廣泛關注[9-10]。藏豬為地方特色品種資源，耐粗飼、肉質優(yōu)良、肌肉鮮紅、鮮嫩多汁、富含肌內脂肪，因此成為人們所追求的新型生態(tài)食品，且藏豬能適應高寒的放牧氣候和以放牧為主的低劣飼養(yǎng)條件，也是一種優(yōu)良的試驗用小型豬品種[11-12]，這些優(yōu)點使藏豬具有廣闊的應用前景，但其生長速度緩慢，屬選育程度極低的品種。IGF-1在調控藏豬生長發(fā)育、代謝上扮演了一個重要的角色，然而目前沒有關于藏豬IGF-1原核表達的報道。本研究首次對藏豬IGF-1成熟肽基因進行克隆，構建IGF-1成熟肽基因融合表達載體pET-32α-IGF-1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行初步表達，優(yōu)化表達條件，獲得IGF-1融合蛋白，為研究藏豬IGF-1成熟肽蛋白的生物學功能及在藏豬生長發(fā)育過程中的調節(jié)作用及功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 藏豬肝臟、質粒及菌株

豬肝臟采自四川農業(yè)大學實驗養(yǎng)殖場屠宰的健康成年藏豬；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE)、質粒pMD19-T、表達質粒pET-32α 均為四川農業(yè)大學動物微生態(tài)研究中心保存。

1.2 酶和試劑

RNA抽提純化試劑盒(動物組織)和PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Ni-NTA SefinoseTMResin試劑盒(上海生工公司)；T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒、QUuickCutTMEcoR Ⅰ和QUuickCutTMXhoⅠ(TaKaRa公司)，2×Taq Master Mix(北京康為世紀公司)；Rabbit anti-human IGF-1和HRP標記的Goat anti-rabbit IgG(武漢博士德公司)。

1.3 PCR引物

擴增藏豬IGF-I基因全長序列P1、P2引物[13]，擴增IGF-1成熟肽系列引物P3：5′- CGGAATTCGGACCTGAGACCCTCTGTGG-3′，P4：5′- CCGCTCGAGCATTCTGTAGTTCTTGTTTC -3′(下劃線分別為EcoR Ⅰ、XhoⅠ酶切位點，斜體部分為終止密碼子序列)，引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

1.4 藏豬肝總RNA提取及cDNA合成

取新鮮的藏豬肝臟組織50 mg，用液氮反復研磨成粉末，轉入1.5 mL EP管中，然后參照試劑盒說明書提取、純化肝組織總RNA，1%瓊脂糖電泳(AGE)檢查。以總RNA提取液3 μL為模板，反轉錄合成cDNA(反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min)。

1.5 pMD19-T-IGF-1質粒的構建與鑒定

以cDNA為模板，擴增IGF-1全基因(反應體系：cDNA 2 μL，10 pmol/μLP1、P2各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL；反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，57 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min)，預期產物612 bp。PCR產物純化回收后與pMD19-T載體連接，再轉化E.coliDH5α，陽性單菌落經PCR鑒定和測序鑒定，正確的克隆命名為pMD19-T-IGF-1。

1.6 藏豬IGF-1成熟肽基因擴增及重組表達載體pET-32α-IGF-1的構建

以pMD19T-IGF-1為模板，進行藏豬IGF-1成熟肽基因的擴增(反應體系：2 μL pMD19T-IGF-1，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，10 μL 2×Taq Master Mix，6 μL ddH2O，反應條件同上)，擴增產物經1% AGE純化回收。將純化回收的IGF-1成熟肽PCR產物和載體PET-32α用EcoR Ⅰ和XhoⅠ 37 ℃ 雙酶切25 min (雙酶切體系為IGF-1/ PET-32α 50 μL，10×酶切Buffer 6 μL，EcoR Ⅰ 1 μL，XhoⅠ 1 μL)，將IGF-1酶切片段與PET-32α酶切產物16 ℃連接酶過夜連接，獲得重組質粒，將其轉化E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細胞后，涂布于LB 抗性平板(含Amp+ 100 μg/mL)，37 ℃恒溫需氧培養(yǎng)16～18 h。挑單個菌落，接種于LB肉湯(含Amp+)，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h，取菌液進行PCR鑒定，選取PCR鑒定為陽性的轉化子抽提質粒，EcoR Ⅰ和XhoⅠ 雙酶切鑒定，將菌落PCR鑒定與雙酶切鑒定正確的陽性克隆轉化子送上海生工測序鑒定。

1.7 誘導劑IPTG濃度及誘導表達時間的優(yōu)化

將重組菌BL21-IGF-1接種于LB肉湯(含Amp+)37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按1∶100比例轉種到LB肉湯(含Amp+)中培養(yǎng)至OD600=0.5時，加入IPTG溶液使終濃度分別為0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L誘導10 h，收集菌體進行全菌SDS-PAGE分析。同時，當重組菌BL21-IGF-1培養(yǎng)至OD600=0.5時，加入IPTG溶液使終濃度達上述優(yōu)化的濃度，誘導至6，8，10 h時，取1 mL菌液進行SDS-PAGE檢測分析。

1.8 表達產物的定位分析及Western Blot鑒定

按方法1.7優(yōu)化后的結果進行重組菌BL21-IGF-1培養(yǎng)及誘導表達，4 ℃ 12 000 r/min(Sigma 3k15 Inc)離心10 min，棄上清，用1/10體積的PBS(pH值8.0)重懸沉淀，加入適量裂解液，在冰浴下超聲破碎至溶液清亮。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min收集上清和沉淀，沉淀用PBS重懸。取少量上清液和沉淀重懸液，加入等體積的5×Loading Buffer，SDS-PAGE分析。破碎后離心收集的上清液中，加等體積的平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH值8.0)混勻，0.45 nm濾膜過濾，濾液按照上海生工公司Ni-NTA SefinoseTMResin Kit試劑盒使用說明操作。洗脫蛋白經10 kDa超濾管濃縮。將誘導表達和未誘導的產物與純化的融合蛋白先行SDS-PAGE分析，轉PVDF膜，再進行Western Blot分析，一抗為兔抗人IGF-1，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG。

2 結果與分析

2.1 藏豬IGF-1全基因及成熟肽序列的擴增

以抽提的藏豬肝組織RNA為模板，RT-PCR擴增IGF-1基因全長序列，擴增產物經1% AGE檢測，在約612 bp位置處出現(xiàn)與預期大小相符的單一條帶(圖1-A)。將目的片段擴增到克隆載體pMD19-T上，轉化大腸桿菌DH5α，并對轉化子進行菌落PCR鑒定(圖1-B)，獲得 5陽性克隆，陽性菌株送成都擎科梓熙生物技術公司測序，獲得堿基序列為612 bp，Blast在線比對與GenBank中豬IGF-1序列(登錄號DQ121132.1)同源性達100%，結果表明克隆成功。以P3/P4為引物，pMD19-T-IGF-1為模板擴增出的IGF-1成熟肽序列，在約315 bp的位置出現(xiàn)單一條帶，與預期相符(圖1-C)，未加模板的陰性對照未見條帶，說明已成功擴增了IGF-1成熟肽。

A.藏豬IGF-1全序列PCR產物； B. 菌落PCR鑒定； C. IGF-1成熟肽序列的PCR產物。M. 2 000 bp Marker；A:1. IGF-1全基因PCR產物；2.陰性對照；B:1～5.陽性菌株菌落PCR產物；C:1,2.IGF-1成熟肽序列的PCR產物；3.陰性對照。

2.2 重組表達載體pET32α-IGF-1構建與鑒定

回收的成熟肽基因片段與質粒pET-32α分別雙酶切后，連接酶連接，獲取重組質粒，轉化E.coli.BL21(DE3)，陽性菌株進行菌落PCR鑒定，另小量提取質粒后用EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定，均可得到約315 bp 的IGF-1序列片段，與預期產物一致(圖2)，質粒送公司測序鑒定，正確的轉化子命名為BL21-IGF-1。

2.3 誘導融合蛋白表達IPTG濃度的優(yōu)化

采用0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L 5種IPTG終濃度進行誘導重組菌BL21-IGF-1表達融合蛋白，SDS-PAGE分析。以未誘導重組菌為對照，發(fā)現(xiàn)在31 kDa大小處出現(xiàn)特異性條帶，當IPTG濃度從0.1 mmol/L升到0.5 mmol/L，融合蛋白的表達量明顯增加，但IPTG濃度在0.8～1.0 mmol/L時對融合蛋白表達量的影響不明顯(圖3)。因此，選擇IPTG的誘導濃度為0.5 mmol/L。

A. pET32α-IGF-1重組質粒的PCR鑒定；M. DL2000 Marker；1～4. 陽性克隆菌落PCR鑒定；B. pET32α-IGF-1重組質粒的雙酶切鑒定；M.DL15000 Marker；1. 重組質粒pET32α-IGF-1的EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定；2.重組質粒pET32α-IGF-1。

M. 標準蛋白分子量；1.未誘導；2～7.分別為0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L IPTG對融合蛋白IGF-1的誘導表達。

2.4 不同誘導時間的優(yōu)化

為了探索融合蛋白表達的最優(yōu)IPTG誘導時間，以未誘導的和空載體的菌液作對照，SDS-PAGE分析6，8，10 h融合蛋白表達量，結果顯示，在IPTG誘導的各個時間段，重組菌BL21-IGF-1均在31 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，并且隨著誘導時間的延長表達量增加，未經IPTG誘導和空載體菌在31 kDa處均未見有明顯條帶(圖4)，因此，選擇10 h作為IPTG誘導表達的最佳時間。

2. 5 pET32α-IGF-1融合蛋白表達的可溶性分析

將誘導表達的菌液經過超聲波破碎后，離心分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析，結果表明，IGF-1融合蛋白主要以包涵體的形式表達于菌體中，上清有少量的表達產物(圖5)。

M.標準蛋白分子量；1.未誘導；2. pET-32α空載體誘導；3-5.IPTG誘導表達時間為6，8，10 h。M.Marker of standard protein； 1. BL21-IGF-1 without IPTG induction； 2. pET-32α-BL21(DE3) with IPTG induction；3-5.Expression of pET-32α-IGF-1 with 6,8,10 h IPTG induction.

M.標準蛋白分子量；1.pET32α空載體的IPTG的誘導；2.未誘導；3.裂解上清；4.未誘導上清；5.裂解沉淀；6.未誘導沉淀。M.Marker of standard protein； 1. pET-32α-BL21(DE3) with IPTGinduction；2.Expression without IPTG induction；3.Supernatant of lysate；4.Supernatant without induction；5.Precipitation of lysat of lysate；6.Precipitation without induction.

2.6 融合蛋白純化及表達產物Western Blot鑒定

利用融合蛋白中的組氨酸標簽，通過固定化金屬親和層析來純化上清中的IGF-1蛋白，用洗脫液(含250 mmol/L)洗脫，洗脫液通過用10 kDa的超濾管濃縮得到純度較高的融合蛋白(圖6-A)。Western Blot鑒定結果，未誘導的重組菌BL21-IGF-1菌體超聲后上清和沉淀未出現(xiàn)特異性條帶，而誘導后的重組菌BL21-IGF-1菌體超聲破碎后的上清、沉淀以及純化后蛋白均出現(xiàn)了特異性條帶(圖6-B、C)。

3 討論與結論

本研究以藏豬肝組織總RNA為模板，通過RT-PCR成功擴增出IGF-1全長序列，長度612 bp，設計引物P3/P4，以pMD19-T-IGF-1為模板擴增出IGF-1成熟肽序列315 bp，定向插入pET-32α質粒中，經菌液PCR、EcoR Ⅰ/XhoⅠ雙酶切和測序鑒定，結果表明成功構建了pET-32α-IGF-1原核表達質粒。本試驗所選用的pET-32α，由于連有T7噬菌體轉錄系統(tǒng)，強大的T7啟動子受控于T7 RNA聚合酶，宿主細胞可提供T7 RNA 聚合酶，其合成mRNA速度快，是普通大腸桿菌合成mRNA速度的5倍；而攜帶pET-32α表達質粒受到充分誘導時，絕大多數(shù)細胞內的資源用于表達目的蛋白[14-15]。目前載體常用與本身溶解性高的多肽序列融合表達，或與催化二硫鍵形成的酶融合表達如硫氧還蛋白(Trx)，提高目的蛋白可溶性比例及活性[16-17]； His·Tag是常用的純化蛋白的融合標簽，可以將蛋白在完全變性條件下溶解，結合于固化的Ni2+樹脂而進行親和純化，從而提高蛋白純化效率[18]。孟星宇等[19]曾用Trx標簽成功表達了梅花鹿IGF-1融合蛋白，pET-32α是融合型原核表達載體，融合標簽為6×His Tag。因此，本試驗將成功克隆得到的IGF-1成熟肽序列并選用pET-32α質粒構建藏豬IGF-1成熟肽表達載體。重組大腸桿菌BL21-IGF-1加入IPTG誘導蛋白表達時，當IPTG誘導濃度從0.1 mmol/L增加到0.5 mmol/L，蛋白的表達量也隨之增加，0.8～1.0 mmol/L時，蛋白的表達量受誘導濃度的影響不大，考慮到IPTG的毒性以及IPTG與蛋白表達量的關系，確定IPTG的最佳誘導濃度為0.5 mmol/L。同時，發(fā)現(xiàn)蛋白表達量隨IPTG誘導時間延長而增加，誘導10 h時表達量最高，因此誘導時間10 h為最佳。pET-32α-IGF-1重組質粒在BL21(DE3)中誘導表達的蛋白大小約為31 kDa，與理論值一致。本試驗選擇的BL21(DE3)為蛋白酶缺陷形菌株，缺乏純化過程中降解蛋白的lon 蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶，實現(xiàn)目的蛋白在菌株中的穩(wěn)定表達。但在未誘導的重組菌和攜帶空載體的細菌誘導的對照組中，也出現(xiàn)與目的蛋白大小相近的雜蛋白，推測可能是大腸桿菌BL21(DE3)菌自身表達大小相似的蛋白所致。進一步對表達的融合蛋白進行Western Blot鑒定，結果發(fā)現(xiàn)，在誘導的重組菌菌體的破碎上清液和沉淀以及純化的融合蛋白中能檢測到分子質量約31 kDa有特異性蛋白條帶，而未誘導的菌體破碎上清液和沉淀均未出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結果相符，說明重組菌表達的融合蛋白是豬IGF-1成熟肽且具抗原抗體反應活性。

A.純化融合蛋白；M.蛋白標準分子量； 1.純化的融合蛋白洗脫液(含250 mmol/L 咪唑)；2～3.結合洗滌液(含10 mmol/L咪唑)；B.IGF-1重組蛋白的Western Blot鑒定；M.標準蛋白分子量；1.誘導菌體裂解沉淀；2.未誘導菌體裂解沉淀；3誘導菌體裂解上清；4.未誘導菌體裂解上清；C.純化目標蛋白。

通過目標融合蛋白可溶性分析試驗結果可知，蛋白主要以包涵體的形式存在，而在菌體破碎的上清液中仍有少量存在。破碎菌體上清液中的可溶蛋白的分離純化可操作性優(yōu)于包涵體蛋白，所以本試驗的目標蛋白純化是對重組菌菌體破碎的上清蛋白進行純化。有關IGF-1重組蛋白表達后的活性問題，樊汶樵[20]研究發(fā)現(xiàn),原核表達出來的IGF-1重組蛋白能顯著刺激魚的腎臟傳代細胞CIK細胞增殖，具有較強的生物活性。孟星宇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，原核表達出來的IGF-1重組蛋白能提升細胞的增殖速度。Zeng等[5]給豬注射牛或人的IGF-1，結果表明，IGF-1與豬的平均日增重有著較大相關性，豬的肌肉生長加快，肌肉中總蛋白和總的IGF-1 mRNA豐度上升。本試驗成功獲得了高純度的藏豬IGF-1成熟肽融合蛋白，為深入研究IGF-1融合蛋白生物學特性及其在畜牧業(yè)生產中的應用提供基礎理論依據(jù)。

通過RT-PCR成功擴增出藏豬IGF-1成熟肽基因序列，構建了表達質粒pET32α-IGF-1及獲得重組大腸桿菌BL21-IGF-1，成功表達了藏豬IGF-1成熟肽融合蛋白。