肉桂精油的GC-MS成分分析及對(duì)霉菌的抑菌活性研究*

田雙娥,李思明,趙 晶,廖曉迪

(廣西民族博物館,廣西 南寧 530028)

肉桂為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum Trew)植物,別名玉桂、桂皮、桂枝、筒桂、桂,分布于廣西、廣東、海南、福建、臺(tái)灣、云南.肉桂油是從植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥皮、枝、葉中提取得到的揮發(fā)油,為黃色或者棕黃色的澄清液體,有肉桂的特異香氣,味甜,相對(duì)密度1.055～1.070,折光率1.602～1.614.[1]其主要化學(xué)成分為肉桂醛.不同提取方法、不同品種、不同樹齡、不同產(chǎn)地的樹皮得油率在0.44%～18.95%之間;葉、枝或枝葉的得油率在0.07%～2.90%之間;根的得油率在0.03%～0.08%之間;果實(shí)的得油率在0.72%～2.04%之間.[2]肉桂油具有廣譜的抗菌作用,對(duì)細(xì)菌、酵母和霉菌均有較強(qiáng)的抑菌活性.[3]

霉菌是絲狀真菌的俗稱,在自然界中以孢子方式繁殖和傳播.空氣中存在大量的孢子,隨著空氣中的顆粒物降沉?xí)皆谖奈锉砻?空氣中溫濕度的波動(dòng)較大,在溫濕度適宜的條件下,吸附在文物表面的孢子開始萌發(fā),霉菌的生長(zhǎng)繁殖意味著文物的劣化開始.賦存于博物館館藏文物展陳環(huán)境中的霉菌孢子的繁殖與博物館中紡織品、紙制品、漆木器、毛皮革等文物的霉變劣化有著密切的關(guān)系.研發(fā)空氣防霉抑菌劑,通過(guò)“潔凈”文物展陳環(huán)境,對(duì)于博物館展陳文物的微生物病害的預(yù)防具有重要意義.本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了植物源提取物肉桂精油的主要活性成分,并比較了肉桂精油及其主要活性成分肉桂醛對(duì)空氣來(lái)源的三種霉菌的抑菌效果.旨在為植物源空氣清潔劑在博物館中微生物病害的防治應(yīng)用提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 材料

肉桂精油,購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,采用水蒸氣蒸餾法獲取.肉桂醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,含量為95%.

三株供試的霉菌菌種分別為霉菌K01,霉菌K02,霉菌K03,均分離純化于廣西民族博物館的展廳空氣中.

主要實(shí)驗(yàn)器皿及用品：容量250 m L的三角錐形瓶、直徑90 mm的培養(yǎng)皿.

霉菌液體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)均為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器

本研究中所用儀器如表1所示.

表1 儀器名稱Tab.1 The name of the instrument

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油抑菌成分的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)肉桂精油的成分進(jìn)行分析.

氣相色譜儀條件：毛細(xì)管色譜柱HP-35MS 30 m×0.25 mm,0.25μm,載氣為氦氣.

程序升溫：初始柱溫50℃,保持5 min,然后以8℃/min升溫速率升至290℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度280℃;載氣為高純氦氣,流速1.0 m L/min;進(jìn)樣量為1 u L,分流比50：1.

質(zhì)譜條件：EI離子源;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍為35～400 amu;離子源300℃,質(zhì)譜接口溫度為250℃.

數(shù)據(jù)庫(kù)：采用標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST進(jìn)行相似度比對(duì).

1.3.2 抑菌活性研究

1.3.2.1 孢子懸液的制備

接種霉菌后的平板放入霉菌培養(yǎng)箱,28℃培養(yǎng)4～6天后將霉菌平板取出,用移液器吸取無(wú)菌去離子水輕輕地反復(fù)沖洗平板表面的孢子,將孢子液置于恒溫振蕩器中(200 r/min、28℃)充分振蕩30 min.使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)振蕩后的孢子懸液進(jìn)行計(jì)數(shù),最后使孢子的濃度控制在105～106 CFU/m L范圍內(nèi),并將其置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?孢子懸液使用前保存不超過(guò)7天.

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)平板的制備

采用涂布平板法制備試驗(yàn)平板.將20 m L左右已滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基傾注于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中,水平靜置待培養(yǎng)基凝固,用移液器吸取0.1 m L孢子懸液后接種于平板,然后用涂布棒涂布均勻.

1.3.2.3 抑菌活性的測(cè)定

采用瓊脂平板打孔法.用無(wú)菌移液器槍頭(直徑為6 mm)在事先準(zhǔn)備的試驗(yàn)平板上打孔,用無(wú)菌尖頭鑷子挑去培養(yǎng)基小塊做成圓孔,并加入瓊脂打底然后往圓孔中滴入10μL肉桂精油或肉桂醛,每個(gè)處理分別重復(fù)3次.對(duì)照孔則加入等量的無(wú)菌水.將平板放置28℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天后測(cè)量直徑.

抑菌圈直徑判定肉桂精油及肉桂醛對(duì)霉菌的抑菌活性大小.抑菌圈直徑大于20 mm為極敏感,15～20 mm為高度敏感,10～15為中度敏感,6～10 mm為低度敏感;[4]抑菌圈直徑小于6 mm為無(wú)抑制作用者,視為不敏感.

1.3.2.4 抑菌圈直徑測(cè)量

試驗(yàn)平板培養(yǎng)好后取出,采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,以直徑(cm)表示抑菌圈的大小.采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P＞0.05表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05時(shí)表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01表示差距具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油的GC-MS化學(xué)成分分析

按照上述1.3.1色譜條件,對(duì)肉桂精油進(jìn)行檢測(cè)分析,獲得肉桂精油揮發(fā)性成分的總離子流圖,見(jiàn)圖1.由圖1可知,共分離出46種化合物,經(jīng)質(zhì)譜庫(kù)檢索與標(biāo)準(zhǔn)譜圖共同對(duì)照分析,共鑒定出40種化合物,占色譜總流出峰相對(duì)百分含量的98.749%.各種成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)按峰面積歸一化法計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表2.

圖1 肉桂精油GC-MS分析總離子流圖譜Fig.1 The TIC of GC-MS of essential oil from Cinnamom

表2 肉桂精油的化學(xué)成分及其相對(duì)含量Tab.2 The chemical components of essential oil from Cinnamom and their relative contents

由表2可知,在GC-MS鑒定的40種化合物中,占比最多的是醛類化合物共7種占總化學(xué)成分的84.147%,酯類化合物5種占6.169%,醇類化合物6種占1.184%,烯類化合物15種占總化合物1.177%,酮類1種占0.026%,其他6種化合物(氧化石竹烯、香豆素、六氫萘、龍腦、氧化肉桂酸、異香橙烯環(huán)氧化物)共占總化學(xué)物的6.046%.相對(duì)含量較高的化學(xué)成分有肉桂醛(81.10%)、乙酸肉桂酯(5.954%)、香豆素(5.689%)、苯甲醛(1.246%),共占總化學(xué)成分含量的93.989%.

2.2 真菌對(duì)肉桂精油及肉桂醛抗真菌敏感性的研究

采用瓊脂平板打孔法用抑菌圈直徑評(píng)價(jià)3種受試霉菌對(duì)肉桂精油和肉桂醛的抗菌敏感性,抑菌圈直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3瓊脂平板抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片見(jiàn)圖2.

表3 肉桂精油及肉桂醛對(duì)供試菌的抑菌圈直徑Tab.3Antimicrobial activity(inhibition zone)of the tested molds to cinnamon oil and cinnamaldehyde

圖2 肉桂及肉桂醛對(duì)供試霉菌抑菌圈照片F(xiàn)ig.2 Photos of inhibition zone test注：A1～A2分別為肉桂和肉桂醛對(duì)K01的抑菌圈,B1～B2分別為肉桂和肉桂醛對(duì)K02的抑菌圈,C1～C2分別為肉桂和肉桂醛對(duì)K03的抑菌圈

由表3知,肉桂精油和肉桂醛對(duì)三種受試霉菌的抑菌圈直徑均大于20 mm,抑菌圈直徑與抗菌活性成正比,表明三株霉菌對(duì)肉桂及肉桂醛的抑菌活性極度敏感.經(jīng)瓊脂孔平板打孔法抑菌圈實(shí)驗(yàn)比較可知,加入10μL劑量時(shí),肉桂醛對(duì)每一種真菌的抑制作用均比肉桂精油的抑菌作用強(qiáng),可能是肉桂精油中肉桂醛含量(81.100%)較低肉桂醛的緣故.

肉桂醛是一種黃色黏稠狀液體,分子結(jié)構(gòu)為一苯基團(tuán)連接一個(gè)丙烯醛.大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,肉桂醛對(duì)真菌、菌絲及毒素和細(xì)菌、芽孢都有較好的抑制效果.[5-8]可以廣泛地應(yīng)用于肉制品防腐,罐頭殺菌,水果、蔬菜、牛奶、果汁飲料的保鮮以及新型食品包裝材料等方面.肉桂醛的抑菌機(jī)理可通過(guò)多方面影響微生物的正常代謝活動(dòng)起作用,且抑菌作用與肉桂醛的濃度有關(guān),而呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.[9-10]Shen等人[11]的電鏡掃描結(jié)果直觀地表明,肉桂醛導(dǎo)致細(xì)菌外觀形態(tài)發(fā)生明顯變化,對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖直接產(chǎn)生抑制作用;而透射電鏡下觀察結(jié)果表明,肉桂醛對(duì)微生物的影響不僅在外觀形態(tài),還能對(duì)其內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生作用;透射電鏡下觀察結(jié)果還表明,肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的影響表現(xiàn)為使其二者分別發(fā)生細(xì)胞解體、裂解、細(xì)胞質(zhì)泄露和細(xì)胞膜壁分離、細(xì)胞溶解、細(xì)胞質(zhì)泄露及濃縮.研究表明,相對(duì)于細(xì)菌而言,肉桂醛對(duì)真菌的抑菌能力更強(qiáng).[12]鄔麗紅等人[13]研究了肉桂醛對(duì)煙曲霉菌生物膜的體外作用,結(jié)果表明,肉桂醛對(duì)煙曲霉菌具有抗菌活性,亞抑菌濃度的肉桂醛對(duì)生物膜具有一定的破壞作用,其中濃度越高作用越強(qiáng).張赟彬等人[14]對(duì)肉桂醛對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了抑菌殺菌研究,結(jié)果表明,抑殺作用機(jī)理可能是因醛基是親水基團(tuán),易吸附于細(xì)菌或真菌表面的親水基,從而穿入細(xì)胞壁破壞其多糖結(jié)構(gòu),最終發(fā)揮抑殺的作用.戴向榮等人[15]的研究報(bào)道,肉桂精油首先能使霉菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜出現(xiàn)異常,再改變胞內(nèi)的大分子空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致霉菌新陳代謝紊亂,從而抑制霉菌的生長(zhǎng).王丹等人[16]采用體外熏蒸抑菌試驗(yàn)研究了肉桂精油對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),鏈格孢菌(Alternaria alternata)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)三種主要致病菌的抑制效果,試驗(yàn)表明,肉桂精油對(duì)以上3種優(yōu)勢(shì)病原菌均有較好的抑制效果,其最小抑菌濃度(MIC)分別為60μL/L,30μL/L和30μL/L;通過(guò)掃描電子顯微鏡可以看出,與對(duì)照組相比,經(jīng)肉桂精油處理的3種病原菌菌絲形態(tài)均受到嚴(yán)重破壞,發(fā)生凹陷、皺縮、粗糙等一系列變形現(xiàn)象.

中國(guó)肉桂油(Cassia oil(Cinnamomum cassia Blume))、肉桂皮油/油樹脂(Cinnanon bark oil/oleoresin(Cinnamomaum spp.))和肉桂醛(Cinnamic aldehyde)均被我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》列入允許使用的食品天然香料和允許使用的食品用合成香料名單,[17]即在正常的劑量范圍內(nèi)使用肉桂精油和肉桂醛,人類的身體健康不會(huì)受到威脅.但用于博物館的文物保護(hù)中作為殺蟲抗菌防霉劑時(shí)還應(yīng)考慮植物精油及活性提取物對(duì)文物本底的安全性,王克華等人[18]的研究表明,不同植物源提取物對(duì)紙張及顏料的顏色存在不同影響,香茅醛的熏蒸對(duì)紙張及顏料的顏色沒(méi)有色差影響,而檸檬醛對(duì)紙張基本無(wú)色差影響、對(duì)顏料色差存在一定程度影響,肉桂醛對(duì)顏料的色差存在一定程度的影響、對(duì)紙張色差則影響較大.

肉桂油及其活性成分的天然抗菌作用使其廣泛應(yīng)用于食品基質(zhì)中進(jìn)行殺菌防腐等方面.植物精油來(lái)源廣泛,還具有揮發(fā)性高、生物降解性良好、基質(zhì)中殘留低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),在文物保護(hù)的抑菌防霉殺蟲等生物病害防治工作中備受青睞.國(guó)內(nèi)多家博物館單位如上海市博物館、[19]南京博物院、[20]重慶中國(guó)三峽博物館[21-22]等進(jìn)行了植物源提取物防霉抑菌殺蟲等方面的研究.此外,植物精油的復(fù)配能增強(qiáng)抑菌效果并降低各自的使用濃度.汪青青等人[23]利用分級(jí)濃度抑制指數(shù)(FIC)評(píng)價(jià)了肉桂精油和八角精油聯(lián)合使用后的抗菌作用,結(jié)果表明,二者聯(lián)合使用可以增強(qiáng)抗菌效果,降低各自的使用濃度,從而減弱用作保鮮劑時(shí)對(duì)果蔬感官特性的負(fù)面影響.楊柳等人[24]研究肉桂精油、丁香精油及其復(fù)配后的抑菌效果及在香腸中的應(yīng)用,結(jié)果顯示：肉桂精油和丁香精油按1∶1復(fù)配抑菌效果較好,作用時(shí)間增長(zhǎng),抑菌效果明顯,添加精油后的香腸與普通香腸比,菌落總數(shù)和p H均較低.以酚類、醛類、醇類、酮類等為抑菌活性物質(zhì)的植物源提取物均有明顯的抗菌活性,在抑菌防霉方面具有開發(fā)潛力.

3 結(jié)論

本文使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)分析肉桂精油,共鑒定出肉桂精油的化學(xué)成分主要40種,相對(duì)含量最多的種類是醛類物質(zhì),肉桂醛是肉桂精油的最主要活性物質(zhì).其中相對(duì)含量較高的幾種成分依次為肉桂醛含81.1%,乙酸肉桂酯5.954%,香豆素5.689%,苯甲醛1.246%,約占鑒定出化學(xué)成分的93.989%.

肉桂精油是一種天然的抗霉菌劑,對(duì)三種供試霉菌的瓊脂平板打孔法抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑菌圈直徑均遠(yuǎn)大于20 mm,肉桂醛是肉桂精油的主要抗菌成分,對(duì)霉菌的抗菌效果顯著.經(jīng)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,相同劑量(10μL)的肉桂醛抑菌效力比肉桂精油的強(qiáng).結(jié)果表明,肉桂精油對(duì)霉菌具有顯著的抗菌作用,其主要化學(xué)成分肉桂醛是其主要的抑菌活性成分.肉桂精油及肉桂醛作為植物源提取物應(yīng)用于文物預(yù)防性保護(hù)中的霉菌和細(xì)菌污染等微生物病害防治中具有良好的發(fā)展前景.