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    北京市平谷地區(qū)番茄枯萎病病原鑒定

    2011-08-07 09:43:24張大燕徐文元郭美霞曹坳程
    中國蔬菜 2011年1期
    關(guān)鍵詞:平谷枯萎病病株

    李 園 張大燕 徐文元 郭美霞 曹坳程

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京100193)

    枯萎病主要危害番茄(Lycopersicum esculentumMill.)、辣椒等作物的莖部維管束。發(fā)病初期,植株中、下部葉片在中午時(shí)呈褐色萎蔫,早晚恢復(fù)正常;隨病害發(fā)展,植株中、上部更多葉片開始發(fā)病萎蔫,但不脫落;至最后全株葉片萎蔫發(fā)黃,整株枯死。病癥有時(shí)僅出現(xiàn)在莖的一邊,或一片葉一邊發(fā)黃而另一邊正常。剖視莖、葉柄及果柄,可見其維管束均呈褐色。潮濕環(huán)境下,病株莖基部產(chǎn)生粉紅色霉(黃紹崗,1994;徐艷輝 等,2008)。病程進(jìn)展較慢,15~30 d才枯死,無乳白色黏液流出,有別于青枯病。發(fā)病率15%~20%,嚴(yán)重時(shí)植株全部枯死,對(duì)產(chǎn)量造成很大的損失(程愛昀,2010)。本試驗(yàn)對(duì)北京平谷地區(qū)的番茄枯萎病病株進(jìn)行分離、純化,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行診斷鑒定,以期為防治番茄枯萎病提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 番茄枯萎病病組織采集

    2010年 12月于北京市平谷區(qū)溫室進(jìn)行樣品采集,主要采集番茄病株的莖、葉部分 5~10株,將所采集的番茄病組織(圖1)保存于4 ℃ 冰箱備用。

    圖1 供試番茄枯萎病病組織

    1.2 番茄枯萎病病原分離與鑒定

    采用PDA+S培養(yǎng)基對(duì)采集到的番茄枯萎病病原菌進(jìn)行分離。培養(yǎng)基成分:1 000 mL滅菌水,38 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂,5 g瓊脂,0.05 g硫酸鏈霉素。病原菌的分離培養(yǎng)采用常規(guī)組織分離法,從病株根部切下3 mm×3 mm×1 mm的小塊,放入70%酒精消毒30 s,然后轉(zhuǎn)入1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,用無菌水清洗3次,置于PDA+S培養(yǎng)基上,在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)7 d(鄭莉 等,2006)。培養(yǎng)皿內(nèi)觀察病菌形態(tài)。

    1.3 菌絲體收集及DNA提取

    在無菌操作臺(tái)上,用刀片輕輕刮下培養(yǎng)皿中病原菌菌絲,并將其收集至 EP管中。采用TakaRa試劑盒進(jìn)行DNA提取。

    1.4 PCR鑒定

    PCR 反應(yīng)體系(50 μL):5 U·μL-1Taq酶 0.25 μL,10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μL;2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4 μL;10 ng模板 DNA 1 μL;10 μmol·L-1ITS1/ITS4引物各 1 μL;滅菌雙重蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 mim;95 ℃變性30 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè),電壓85 V,電泳時(shí)間30 min,Bio-rad凝膠成像儀進(jìn)行觀測(cè)、拍照。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)在GeneBank中進(jìn)行Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列比對(duì),分析序列同源性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄枯萎病病原菌

    如圖2所示,對(duì)采集到的番茄枯萎病病原進(jìn)行分離培養(yǎng)后得到的菌落呈圓形,菌絲細(xì)絨狀,蓬松。菌落呈白色或邊緣白色,向內(nèi)逐漸變成粉紅色。

    圖2 番茄枯萎病病原菌菌落

    對(duì)番茄枯萎病病原菌菌落進(jìn)行顯微鏡鏡檢,該病原菌大型分生孢子鐮刀形,無色,彎曲,2~5個(gè)隔膜,多數(shù)為3個(gè)隔膜,大小為(19~45)μm×(2.5~5.0)μm,基部具足細(xì)胞;小型分生孢子橢圓形或卵形,無色,單孢或雙孢,大小為(5~26)μm×(2.0~4.5)μm;厚垣孢子球形,多數(shù)單孢,平滑或皺縮,頂生或間生。初步認(rèn)定該病原菌為鐮刀菌。

    2.2 番茄枯萎病病原分子鑒定

    番茄枯萎病病原 ITS-PCR鑒定結(jié)果如圖3所示,條帶大小為500~700 kb,清晰單一,PCR產(chǎn)物直接送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

    2.3 序列信息及比對(duì)結(jié)果

    測(cè)序結(jié)果顯示,ITS序列全長為538 bp,GeneBank中 Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示,與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)序列同源性高達(dá) 100%;另一份樣品測(cè)序結(jié)果顯示,ITS序列全長為 534 bp,GeneBank中 Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示,與串珠鐮刀菌(Fusarium proliferatum)序列同源性高達(dá)99%。

    圖3 番茄枯萎病病原ITS-PCR鑒定結(jié)果

    3 小結(jié)

    經(jīng)過病原菌的分離純化、形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定,初步結(jié)果表明北京市平谷地區(qū)番茄枯萎病主要由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)侵染所致。另外也可能存在串珠鐮刀菌(Fusarium proliferatum)的復(fù)合侵染。

    程愛昀.2010.大棚番茄枯萎病的診斷和防治新技術(shù).中國瓜菜,(1):45-46.

    黃紹崗.1994.番茄枯萎病及其防治方法.廣西植保,(3):29-30.

    徐艷輝,李燁,許向陽.2008.番茄枯萎病的研究進(jìn)展.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),39(11):128-134.

    鄭莉,朱秋珍,馮自立,黃俊斌.2006.草莓枯萎病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),45(2):194-196.

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