一例雞源mcr-1陽性大腸桿菌感染病例分析及耐藥特征研究

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A文章編號：1673-1085（2025）05-0062-06

大腸桿菌是導(dǎo)致雞感染性疾病最常見的細菌之一，可引起雞的敗血癥、氣囊炎、心包炎、腹膜炎及輸卵管炎等多種病癥，既可單獨發(fā)病，也能與其他病原體混合感染。該菌在雞群中即可垂直傳播，也可水平傳播，并能在雞體內(nèi)長時間持留[1-2]。雞大腸桿菌病全年均可發(fā)生，且雛雞最為易感，具有較高的發(fā)病率和死亡率，給雞養(yǎng)殖業(yè)造成不少的經(jīng)濟損失[3]。目前，抗生素仍是預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的重要手段，但長期且不合理的使用促進了大腸桿菌的耐藥性進化。在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域，多黏菌素曾被廣泛用于促進動物生長及預(yù)防細菌感染。然而，隨著多黏菌素的大量使用，問題逐漸浮現(xiàn)。細菌進化出了可水平轉(zhuǎn)移的多黏菌素耐藥機制mcr-1，這一機制的產(chǎn)生與多黏菌素的濫用緊密相連[4]。鑒于此，2016年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2428號公告，明確決定停止將硫酸黏菌素作為飼料添加劑用于動物促生長，力求通過政策手段遏制耐藥問題的惡化。

1材料與方法

1.1病例信息

本研究所用病例來自于濟南市某養(yǎng)雞場，35周齡海蘭褐蛋雞，部分雞只出現(xiàn)腹瀉、蛋殼粗糙以及輕微呼吸道癥狀，雞群中還伴有零星死亡現(xiàn)象，疑似大腸桿菌感染。剖檢死亡雞只，采集心臟、肝臟作為檢測病料。

1.2 試劑

無菌脫纖羊血培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；尿道菌顯色培養(yǎng)基，購自法國科瑪嘉公司；MHB肉湯、LB肉湯，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；抗菌藥物，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司。

1.3主要設(shè)備

生物安全柜（HR50-ⅡA2），購自海爾生物醫(yī)療股份有限公司；麥氏比濁儀（VITEKDENSICHEK），購自法國梅里埃公司；恒溫培養(yǎng)箱（BB150），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀，購自德國Bruker公司。

1.4 細菌分離培養(yǎng)及純化

剖檢病死雞，采集心臟、肝臟，在生物安全柜中用 75% 酒精對組織表面消毒，使用無菌剪刀將組織剪開，使用一次性無菌采樣拭子蘸取樣品，并涂抹在血瓊脂培養(yǎng)基一側(cè)，隨后用一次性無菌接種環(huán)從樣品涂抹處開始分區(qū)劃線。將平血倒置，放入 恒溫培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。挑取優(yōu)勢菌的單菌落，劃線于尿道顯色培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)16～18h 。

1.5細菌種屬鑒定

選取尿道顯色培養(yǎng)基上的紅色單菌落均勻涂抹在靶板上，依次加入 1μL 甲酸和基質(zhì)液，晾干后放入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀中鑒定。

1.6 藥物敏感性試驗

采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測試大腸桿菌分離株對14種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。具體步驟為：將對數(shù)生長期的菌液定量至麥氏比濁0.5，MHB肉湯稀釋100倍；在96孔板的第1＼～11列倍比稀釋抗菌藥物，第12列不加藥物，作為對照，體積 100μL ；每孔加入 100μL 稀釋菌液，震蕩混勻后放入 恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； ^18h 后讀取藥敏值，即從低濃度孔開始，第一個無肉眼可見菌體沉淀的藥物濃度即為MIC值，敏感性結(jié)果根據(jù)CLSI和EUCAST的標準判定。

1.7細菌基因組提取及測序

挑取大腸桿菌單克隆于1mLLB肉湯中， ，200rpm 震蕩培養(yǎng) 16～18h 后，按細菌基因組提取試劑盒說明書操作。將提取成功的基因組送至安諾優(yōu)達公司二代測序。

2 結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀

患病雞精神萎靡不振，羽毛蓬亂，食欲減退，排黃白色或黃綠色稀糞，逐漸消瘦，輕微呼吸困難，產(chǎn)蛋減少，蛋殼質(zhì)量差，最終死亡。

2.2 剖檢病變

解剖病死雞，打開胸腔、腹腔，可聞到較大臭味；心包膜增厚，內(nèi)有心包積液，心包膜表面有黃色纖維素性滲出物附著，見圖1a；肺臟水腫、出血；肝臟表面有膠凍樣滲出物，見圖1b；腸壁變薄，十二指腸充血，盲腸鼓氣，直腸末端彌漫性出血；卵泡充血，卵黃破裂，見圖1c。

注：a.心包膜增厚；b.肝臟表面膠凍樣滲出物；c.卵泡充血、卵黃破裂。

2.3細菌分離鑒定

血瓊脂培養(yǎng)基上，生長出大量灰白色、表面濕潤、光滑、邊緣整齊的圓形菌落，純化后在尿道菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落，見圖2；質(zhì)譜鑒定為大腸桿菌，見圖3，命名為EC232。

2.4藥物敏感性結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果如表1所示。EC232為多重耐藥菌株，對9種受試抗菌藥物耐藥，其中氟苯尼考、氯霉素、四環(huán)素的MIC 值最高，均為 128μg/mL 多黏菌素的MIC值達到 8μg/mL ；該菌僅對阿米卡星、替加環(huán)素、頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸及美羅培南敏感。

2.5 耐藥基因

通過與ResFinder數(shù)據(jù)庫比對，EC232中鑒定出7大類17種已知耐藥基因，其中氨基糖苷類耐藥基因種類最多，達到7種，詳見表2。該菌攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1，同時也檢測出超廣譜β -內(nèi)酰胺酶（ESBLs）編碼基因 bla_CTX-M-65 。

2.6 mcr-1遺傳環(huán)境

mcr-1位于IncHI2型質(zhì)粒上，該基因下游為2型磷脂酸磷酸酶基因pap2和溶血素表達調(diào)節(jié)蛋白hha，相鄰兩側(cè)未發(fā)現(xiàn)IS插入序列，但在該基因下游33424bp處發(fā)現(xiàn)截斷的Tn3轉(zhuǎn)座子基因。序列比對發(fā)現(xiàn)，EC232的mcr-1contig與NCBIGenBank中多條序列的核苷酸同源性大于 99% 這些同源序列不僅來自于禽源分離株，也在人源分離株中檢出，如人醫(yī)臨床ICU大腸桿菌分離株的質(zhì)粒序列（pE-T84-1-mcr-1）、人血流感染來源肺炎克雷伯菌分離株的質(zhì)粒序列（pKP121-1-mcr）及人源沙門菌分離株的質(zhì)粒序列（pSC2017167-mcr-256k）。具體如圖4所示。

3討論

大腸桿菌是家禽消化道的共生菌，也是常見的條件致病菌，在禽只免疫力低下時可致病。大腸桿菌病常與新城疫[5]、傳染性法氏囊病[及傳染性支氣管炎[等病毒性傳染病發(fā)生混合感染，導(dǎo)致雞生產(chǎn)性能下降及死亡率升高，給養(yǎng)殖戶帶來經(jīng)濟損失。雞養(yǎng)殖中，常使用抗生素預(yù)防或治療大腸桿菌病，包括氟苯尼考、多黏菌素、阿莫西林、頭孢噻、慶大霉素等，這些藥物長期不合理使用，使雞源大腸桿菌產(chǎn)生了耐藥性，削弱了抗生素的治療效果[8。本研究分離株為多重耐藥菌株，對一半以上的受試抗生素耐藥，對常用抗生素氟苯尼考、四環(huán)素的MIC值高達 128μg/mL ，對慶大霉素、頭孢噻及復(fù)方新諾明的MIC值也均高于 32μg/mL 對多黏菌素的MIC達到了 8μg/mL ，超出耐藥折點3倍。

此前，被稱作“最后防線”藥物的多黏菌素常被添加在飼料中用于促進畜禽生長和預(yù)防細菌感染，直到可轉(zhuǎn)移性多黏菌素耐藥基因mcr-1的出現(xiàn)，迫使人們重新審視這一用法的合理性。mcr-1可由多種質(zhì)粒攜帶，以IncI2、IncX4、IncHI2型質(zhì)粒最為流行，本研究分離株mcr-1基因位于IncHI2質(zhì)粒上。在該基因兩側(cè)通常存在插入序列，如ISApl1，通過形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子的方式介導(dǎo)mcr-1轉(zhuǎn)移，但也有部分mcr-1兩側(cè)無插入元件。Snesrud等[推斷，這可能是mcr-1為維持在菌體中穩(wěn)定存在而丟棄了插入元件。更糟糕的是，mcr-1基因常與多種重要耐藥基因共存，如ESBLs基因、碳青霉烯酶基因等[10]，導(dǎo)致菌株對多種抗生素耐藥。數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌是mcr-1的常見細菌宿主之一，在食品動物中十分常見[10]。有研究認為，mcr-1基因的全球擴散可能與基于食物鏈的傳播途徑有關(guān)[1]。序列比對發(fā)現(xiàn)，本研究菌株EC232mcr-1兩側(cè)序列與人源菌株核苷酸一致性可達 99% 以上，菌株不局限于大腸桿菌，也包括沙門菌和肺炎克雷伯菌等，這意味著mcr-1的宿主十分廣泛，跨種傳播風(fēng)險較高。

綜上所述，致病性大腸桿菌耐藥性問題已日趨嚴重，如不采取應(yīng)對措施將會使養(yǎng)殖業(yè)逐步陷入無藥可用的境地，造成更為巨大的經(jīng)濟損失，也會對人類健康構(gòu)成威脅。停止盲目用藥、盡可能避免預(yù)防性用藥是首要措施；其次要加強對養(yǎng)殖場污水、污物排放的監(jiān)管，降低耐藥菌、耐藥基因污染環(huán)境的風(fēng)險；同時，應(yīng)實施科學(xué)的生物安全管理制度，降低大腸桿菌致病風(fēng)險[12]。

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Case Study and Antibiotic Resistance Profiling of an mcr-1 Positive Escherichia coliInfection in Chickens

WANG Yao12，LI Yujie2，LI Bo² ，WANG Guisheng2，SHENG Yingxia，SONG Shikail [1.PoultryResearch Institute，ShandongAcademyofAgriculturalScience，Jinan25ooo，China; 2.ShandongAnimal DiseasePreventionand Control Center（ShandongProvincial Zoonotic Disease SurveillanceCenter），Jinan 250i00，China; 3.ShandongProvincialAnimal HusbandryGeneral Station，Jinan25oloo，Chinal

Abstract：With the increasing intensification of poultry farming，the incidence and difficulty of prevention and control of colibacillsis have increased accordingly.The number of chickens dying from colibacillosis in China each year is enormous，resulting in severe economic losses.In February 2023，a strain of mcr- I -positive multidrug-resistant Escherichia coli was isolated from the viscera of a dead chicken.This strain carries 17 antibiotic resistance genes and is resistant to gentamicin，florfenicol，chloramphenicol，tetracycline，ceftriaxone，cefotaxime，polymyxin， ciprofloxacin，and trimethoprim ?^- sulfamethoxazole.Sequence analysis revealed that mcr-1 is located on the IncHI2 plasmid，with its flanking sequences highly homologous to those of humanderived E.coli，Salmonella，and Klebsiellapneumoniae.The emergence of critical antibiotic resistance genes such as mcr-1 in chicken-derived pathogenic E .colinot only posesa threat to thehealthy development of the poultry industry but also elevates the risk of antibiotic-resistant bacteria and genes spreading to humans along the chicken product production chain.

Keywords：Chicken;Escherichia coli;mcr-1