DPM1基因單核苷酸多態(tài)性與兒童過(guò)敏性紫癜的相關(guān)性

［摘要］目的探討DPM1基因單核苷酸多態(tài)性與兒童過(guò)敏性紫癜的相關(guān)性。方法選擇2021年4月—2022年3月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受診治的過(guò)敏性紫癜兒童156例作為病例組，另外選擇同期體檢健康的兒童152例作為對(duì)照組。根據(jù)患兒是否出現(xiàn)腹痛和關(guān)節(jié)疼痛的癥狀分為有腹痛亞組、無(wú)腹痛亞組和有關(guān)節(jié)痛亞組、無(wú)關(guān)節(jié)痛亞組；按照患兒是否伴有紫癜性腎炎將其分為紫癜性腎炎亞組與非紫癜性腎炎亞組。收集各組臨床資料，并從受試者外周血中提取全血DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術(shù)對(duì)DPM1基因的rs73909842位點(diǎn)進(jìn)行基因型鑒定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果病例組rs73909842基因型C/G、G/G、C/C頻率與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292～5.208，P＜0.05）；等位基因C頻率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162～4.337，P＜0.05）。rs73909842基因型及等位基因頻率在各臨床亞組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論DPM1基因rs73909842位點(diǎn)的SNP多態(tài)性與兒童過(guò)敏性紫癜的發(fā)病相關(guān)，等位基因C可能是其易感基因。

［關(guān)鍵詞］IgA血管炎；甘露糖基轉(zhuǎn)移酶類；多態(tài)性，單核苷酸；基因型；等位基因；基因頻率；兒童

［中圖分類號(hào)］R725.546［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Association between DPM1 gene single nucleotide polymorphism and Henoch-Schnlein purpura in childrenGAO Xin， ZHANG Qiuye， CHANG Hong， BAI Cui， WANG Dahai， SHAO Leping， LIN Yi （Department of Nephrology， Rheumatology and Immunology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the association between DPM1 gene single nucleotide polymorphism and Henoch-Schnlein purpura in children. MethodsA total of 156 children with Henoch-Schnlein purpura who were diagnosed and treated in The Affiliated Hospital of Qingdao University from April 2021 to March 2022 were enrolled as case group， and 152 healthy children who underwent physical examination during the same period of time were enrolled as control group. According to the presence or absence of the symptoms of abdominal pain and joint pain， the children were divided into abdominal pain group， non-abdominal pain group， joint pain group， and non-joint pain group; according to whether a child was comorbid with purpura nephritis， they were divided into purpura nephritis group and non-purpura nephritis group. Related clinical data were collected from each group; whole blood DNA was extracted from the peripheral blood of subjects， and the iMLDRTM multiplex SNP typing technique was used to determine the genotype of the rs73909842 locus of the DPM1; a statistical analysis was performed. ResultsThere were significant differences in the frequency of C/G， G/G， and C/C genotypes at the rs73909842 locus between the case group and the control group （χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292-5.208，Plt;0.05）， and there was also a significant difference in the frequency of C allele between the two groups （χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162-4.337，Plt;0.05）. There were no significant diffe-rences in the frequencies of genotypes and alleles at the rs73909842 locus between the above clinical subgroups. ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the DPM1 gene at the rs73909842 locus was associated with the onset of Henoch-Schnlein purpura in children， and allele C may be a susceptible gene.

［KEY WORDS］IgA vasculitis; Mannosyltransferases; Polymorphism， single nucleotide; Genotype; Alleles; Gene frequency; Child

兒童過(guò)敏性紫癜（Henoch-Schnlein purpura，HSP），是一種由IgA為主的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的小血管炎[1]，是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的系統(tǒng)性血管炎。該病冬季多見(jiàn)，發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[2]。目前認(rèn)為HSP并非單純的過(guò)敏性疾病，可能與感染、遺傳、食物、藥物、腸道微生態(tài)失衡等多種因素有關(guān)[3]。

HSP患兒IgA1分子絞鏈區(qū)半乳糖基化不全是HSP及紫癜性腎炎（HSPN）的重要發(fā)病機(jī)制[4]。半乳糖基化不全的異常IgA1分子無(wú)法及時(shí)被清除，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物的形成。循環(huán)免疫復(fù)合物會(huì)沉積于腎小球系膜組織上，從而引起HSP患兒腎臟損傷，繼而引起補(bǔ)體活化等一系列病理過(guò)程[5]。有研究表明，除半乳糖基化異常外，HSP患兒可能還存在其他類別的糖基化異常，比如甘露糖基化異常[6]。多萜醇磷酸甘露糖酶復(fù)合物（DPMS）是蛋白進(jìn)行甘露糖基化修飾過(guò)程中必需的一種酶，且在蛋白的甘露糖基化修飾中起關(guān)鍵作用。DPMS由多個(gè)亞基組成，DPM1是其主要的催化亞基，由DPM1基因編碼[7]。推測(cè)DPM1基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可能與HSP的發(fā)生相關(guān)。本研究擬對(duì)比HSP患兒與健康兒童DPM1基因rs73909842位點(diǎn)SNP的差異，以期從遺傳學(xué)角度探討DPM1基因與HSP以及HSPN之間可能的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象與分組

選取2021年4月—2022年3月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院確診的HSP患兒156例為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）和歐洲兒科風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（PReS）共同制定的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腎臟疾病者；②合并呼吸、消化、血液、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；③合并有腫瘤者；④合并自身免疫性疾病者；⑤臨床資料不完整者。同時(shí)選取152例同期體檢健康兒童為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：同一時(shí)間段內(nèi)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康且年齡、性別與病例組相匹配的兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期尿檢異常者；②合并感染者；③合并有其他系統(tǒng)疾病者；④肝、腎功能不全者；⑤臨床資料不完整者。病例組患兒男90例，女66例，年齡（8.10±3.30）歲，對(duì)照組兒童男86例，女66例，年齡（8.10±3.90）歲，兩組研究對(duì)象的性別、年齡相比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

病例組患兒確診后隨訪至少６個(gè)月，根據(jù)隨訪期間患兒的臨床表現(xiàn)分為如下亞組：根據(jù)是否出現(xiàn)腹痛分為有腹痛亞組62例，無(wú)腹痛亞組94例；根據(jù)有無(wú)關(guān)節(jié)疼痛分為有關(guān)節(jié)痛亞組74例，無(wú)關(guān)節(jié)痛亞組82例；根據(jù)是否合并HSPN分為HSPN亞組48例，非HSPN亞組108例。HSPN的診斷標(biāo)準(zhǔn)具體參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)制定的HSPN診治循證指南[9]。

1.2DPM1基因SNP位點(diǎn)的確定

通過(guò)1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)（www.internationalgenome.org）、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）篩選目標(biāo)SNP位點(diǎn)，設(shè)置目標(biāo)人群為中國(guó)北京漢族，最小等位基因頻率（MAF）≥0.05，最小連鎖不平衡相關(guān)程度（r2）≥0.8，由此方法篩選出rs2235739、rs2281282、rs7274624、rs73909842、rs2294902、rs7267115位點(diǎn)，隨后通過(guò)PLINK軟件對(duì)這6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控，設(shè)定SNP缺失率≤5%，哈迪-溫伯格平衡定律檢測(cè)無(wú)顯著偏離（P＞0.05），因此最終確定用于后續(xù)檢測(cè)的DPM1基因SNP位點(diǎn)為rs73909842。

1.3DNA提取及基因型檢測(cè)

所有研究對(duì)象空腹采集靜脈血2 mL，嚴(yán)格按照Flexi-gene DNA Kit（Qiagen）試劑盒操作步驟提取靜脈血中DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術(shù)檢測(cè)DNA樣本中rs73909842位點(diǎn)的所有基因型和等位基因，通過(guò)建立共顯性、顯性、隱性三種遺傳學(xué)模型，比較rs73909842位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在各組間是否存在差異。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 29.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（率）表示，各組間基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。SNP位點(diǎn)與各組之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度通過(guò)比值比（OR）及95%CI評(píng)估。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1病例組與對(duì)照組rs73909842位點(diǎn)基因頻率的比較

通過(guò)比較病例組與對(duì)照組的基因型頻率發(fā)現(xiàn)，在顯性模型中，相較于對(duì)照組，病例組患兒的C/G與G/G基因型頻率之和明顯降低，而C/C基因型頻率明顯升高（χ2=7.548，OR=2.593，95%CI=1.292～5.208，P＜0.05）。比較兩組兒童等位基因頻率發(fā)現(xiàn)，病例組患兒等位基因C頻率明顯升高，等位基因G頻率明顯降低，差異具有顯著性（χ2=6.053，OR=2.245，95%CI=1.162～4.337，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2各亞組患兒rs73909842位點(diǎn)基因頻率比較

有腹痛亞組與無(wú)腹痛亞組，有關(guān)節(jié)痛亞組與無(wú)關(guān)節(jié)痛亞組，以及HSPN亞組與非HSPN亞組患兒rs73909842位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3討論

HSP在兒童時(shí)期多見(jiàn)，每100 000例兒童中約有3～7例患病，好發(fā)年齡約為4～6歲[10]，男女比例約為1.51[11]。當(dāng)HSP患者體內(nèi)存在異常IgA分子時(shí)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗IgA的抗體，形成免疫復(fù)合物介導(dǎo)靶器官損傷[4，12]。糖基化修飾是機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)修飾的重要形式，機(jī)體內(nèi)與生命活動(dòng)相關(guān)的蛋白中有超過(guò)一半的蛋白質(zhì)需要在翻譯后進(jìn)行糖基化修飾[13]，免疫球蛋白分子也是如此。異常糖基化過(guò)程參與了多種病理過(guò)程，與多種腫瘤、傳染性疾病、遺傳性疾病以及自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14-15]。目前已知HSP患者IgA1分子部分鉸鏈區(qū)域出現(xiàn)O-連接聚糖的異常糖基化，主要表現(xiàn)為半乳糖基化不全，是導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并形成免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)[16]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，除半乳糖（Gal）外，HSP患兒血清中甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）濃度亦顯著高于正常兒童[6]，提示除Gal外，Man、GlcN、GalN相關(guān)的異常糖基化可能也參與了HSP的發(fā)生發(fā)展。

機(jī)體蛋白質(zhì)的甘露糖基化修飾是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其中DPMS起著最為關(guān)鍵的作用，也是這一過(guò)程的限速酶[17]。DPMS是產(chǎn)生甘露糖基供體的關(guān)鍵酶，用于糖基磷脂酰肌醇、N-聚糖以及蛋白O-和C-甘露糖基化。DPMS由三個(gè)亞基組成，包括DPM1、DPM2和DPM3。DPM1是DPMS的主要催化亞基，DPM2和DPM3是幫助DPM1穩(wěn)定表達(dá)并使其發(fā)揮催化活性的調(diào)節(jié)亞基[18]。DPM1基因異?？赡苡绊慏PM1的正常表達(dá)，從而影響甘露糖基化的過(guò)程。

SNP是指DNA中單個(gè)核苷酸變異引起的序列改變，是人類群體表型變異的主要來(lái)源[19]。許多遺傳性疾病、癌癥和免疫系統(tǒng)疾病都與基因序列中的突變密切相關(guān)，因此SNP檢測(cè)在疾病診斷、治療等方面具有重要參考價(jià)值[20]。近些年來(lái)，與HSP發(fā)病相關(guān)的SNP位點(diǎn)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。XU等[21]的研究發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913的多態(tài)性與HSP易感性顯著相關(guān)；YU等[22]的研究發(fā)現(xiàn)MCP1/CCL2基因多態(tài)性與HSP易感性相關(guān)，RANTES/CCL5基因多態(tài)性可能與HSP嚴(yán)重程度和HSPN的發(fā)生有關(guān)。檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，人類基因組中DPM1基因的多態(tài)性位點(diǎn)共有161個(gè)，但目前為止尚無(wú)DPM1基因多態(tài)性位點(diǎn)與疾病易感性相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)檢索1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)（www.internationalgenome.org）、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）篩選SNP位點(diǎn)，從而最終選定rs73909842作為本研究的目標(biāo)SNP位點(diǎn)。采集所有研究對(duì)象的外周血樣本并提取DNA，使用iMLDRTM多重SNP分型技術(shù)檢測(cè)病例組和對(duì)照組DPM1基因rs73909842位點(diǎn)所有基因型和等位基因，比較各組間基因型頻率和等位基因頻率是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，病例組患兒DPM1基因rs73909842位點(diǎn)的G/G與C/G基因型頻率之和明顯降低，C/C基因型頻率明顯升高，并且病例組患兒等位基因C頻率高于對(duì)照組、等位基因G頻率低于對(duì)照組，故推測(cè)DPM1基因rs73909842位點(diǎn)SNP與HSP的易感性有關(guān)，攜帶DPM1基因rs73909842位點(diǎn)等位基因C的兒童發(fā)生HSP的風(fēng)險(xiǎn)性升高，提示rs73909842位點(diǎn)等位基因C可能是HSP的危險(xiǎn)因素之一，而等位基因G可能為保護(hù)性因素。比較有腹痛亞組與無(wú)腹痛亞組、有關(guān)節(jié)痛亞組與無(wú)關(guān)節(jié)痛亞組、HSPN亞組與非HSPN亞組患兒rs73909842位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)顯著差異，提示本研究尚未發(fā)現(xiàn)DPM1基因在SNP與HSP的臨床表現(xiàn)之間存在相關(guān)性。

rs73909842位于DPM1基因3′端側(cè)翼序列。側(cè)翼序列是指基因第一個(gè)和最后一個(gè)外顯子外側(cè)不被轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)，分為5′端側(cè)翼序列和3′端側(cè)翼序列，其上有許多調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、RNA裂解信號(hào)等，調(diào)控基因的表達(dá)[21]。有研究表明CTLA4基因近端3′側(cè)翼區(qū)域的等位基因變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生密切相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，病例組患兒的DPM1基因rs73909842位點(diǎn)的G/G與C/G基因型頻率之和明顯降低，C/C基因型頻率明顯升高，因此可以推測(cè)DPM1基因rs73909842位點(diǎn)多態(tài)性可能通過(guò)改變位于3′端側(cè)翼區(qū)的基因調(diào)控序列進(jìn)而影響DPM1基因的表達(dá)，但還需要進(jìn)行更加深入的研究，以闡明DPM1基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)。

綜上所述，DPM1作為參與甘露糖基化反應(yīng)的重要亞基，其基因多態(tài)性與兒童時(shí)期HSP的發(fā)生緊密相關(guān)。DPM1基因rs73909842位點(diǎn)等位基因C可能是兒童HSP易感的危險(xiǎn)因素，而等位基因G則為保護(hù)性因素。該位點(diǎn)基因多態(tài)性可能通過(guò)改變3′端側(cè)翼區(qū)的基因調(diào)控序列，影響基因表達(dá)從而致患者甘露糖基化異常，形成異常糖基化的IgA1分子作為自身抗原與特異性抗體相結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物無(wú)法被及時(shí)清除而致病。目前DPM1基因rs73909842位點(diǎn)的功能相關(guān)性模型尚未建立，仍需進(jìn)一步研究。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL27001）。所有受試患兒家屬均簽署知情同意書。

作者聲明：所有作者均參與了研究設(shè)計(jì)；高鑫、林毅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）