腦蛋白水解物-Ⅰ對D-半乳糖致PC12細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制

［摘要］目的探討腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）對D-半乳糖（D-Gal）致PC12細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制。方法將PC12細(xì)胞分為對照組（常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（D-Gal誘導(dǎo)）、低濃度組和高濃度組（在模型組基礎(chǔ)上分別給予60、120 mg/L的CH-Ⅰ）。利用β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色法檢測各組PC12細(xì)胞衰老率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，采用Western Blot方法檢測各組細(xì)胞中p-STAT3、TERT相對表達(dá)水平，采用PCR-ELISA法檢測各組細(xì)胞中端粒酶的活性。結(jié)果與對照組相比，模型組細(xì)胞衰老率和凋亡率顯著升高（tLSD=27.03、17.77，Plt;0.05），端粒酶活性顯著下降（tLSD=6.21，Plt;0.05）。與模型組相比，低、高濃度組SA-β-Gal細(xì)胞衰老率和凋亡率均明顯降低（tLSD=7.74～21.43，Plt;0.05），端粒酶活性均顯著升高（tLSD=2.01、2.49，Plt;0.05），細(xì)胞中TERT、p-STAT3相對表達(dá)水平顯著升高（tLSD=2.21～6.03，Plt;0.05）。結(jié)論CH-Ⅰ可能是通過促進(jìn)STAT3磷酸化，上調(diào)PC12細(xì)胞的TERT表達(dá)和端粒酶活性，從而減輕D-Gal誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老。

［關(guān)鍵詞］細(xì)胞衰老；PC12細(xì)胞；腦蛋白水解物-Ⅰ；半乳糖；端粒酶

［中圖分類號］R329.25［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Effect and mechanism of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ on senescence of PC12 cells induced by D-galactose" YANG Guangwen， NI Qinshuai， WANG Yuanming， ZHU Lin， QIAO Bing（Department of Radiology， The Sixth Peoples’ Hospital of Qingdao， Qingdao 266023， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ （CH-Ⅰ） on senescence of PC12 cells induced by D-galactose （D-Gal）. MethodsPC12 cells were divided into control group （routine culture）， model group （induced by D-Gal）， low concentration group （treated with 60 mg/L CH-I in addition to the treatment in the model group）， and high concentration group （treated with 120 mg/L CH-I in addition to the treatment in the model group）. SA-β-Gal staining was used to measure the senescence rate of PC12 cells in each group; flow cytometry was used to measure the apoptosis rate of cells in each group; Western blot was used to measure the relative expression levels of phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 （p-STAT3） and telomerase reverse transcriptase （TERT） in PC12 cells， and PCR-ELISA was used to measure the activity of telomerase in each group. ResultsCompared with the control group， the model group had significant increases in the senescence rate and apoptosis rate of cells （tLSD=27.03，17.77，Plt;0.05） and a significant reduction in telomerase activity （tLSD=6.21，Plt;0.05）. Compared with the model group， the low and high concentration groups had significant reductions in the senescence rate and apoptosis rate of SA-β-Gal cells （tLSD=7.74-21.43，Plt;0.05） and significant increases in telomerase activity （tLSD=2.01，2.49，Plt;0.05） and the relative expression levels of TERT and p-STAT3 in cells （tLSD=2.21-6.03，Plt;0.05）. ConclusionCH-Ⅰ may alleviate the senescence of PC12 cells induced by D-Gal by promoting STAT3 phosphorylation， upregula-ting the expression of TERT， and increasing telomerase activity.

［KEY WORDS］Cellular senescence; PC12 cells; Cerebroprotein hydrolysate-1; Galactose; Telomerase

隨著年齡的不斷增長，人類大腦中的神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，大腦體積逐漸減小，大腦呈衰老狀態(tài)，學(xué)習(xí)和記憶能力下降，阿爾茨海默?。ˋD）或帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的患病率可能逐漸增高[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，人腦內(nèi)端粒酶活性降低或者水平下降均可導(dǎo)致神經(jīng)元衰老和死亡，致認(rèn)知功能衰退[4]，同時(shí)腦損傷等因素也會顯著影響端粒酶的表達(dá)水平[5]。SHIM等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）是端粒酶的主要酶催化亞單位，可抑制AD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。目前關(guān)于緩解神經(jīng)元衰老或損傷的有效藥物或方法鮮有報(bào)道。腦蛋白水解產(chǎn)物-Ⅰ（CH-Ⅰ）是從豬腦中提取的多肽混合物，具有抑制神經(jīng)炎癥等作用[8]。研究顯示，CH-Ⅰ在腦卒中和AD等疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[9-10]。WU等[11]研究結(jié)果顯示，CH-Ⅰ具有抑制血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用，其作用機(jī)制與激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路有關(guān)；CH-Ⅰ還可通過提高端粒酶的活性從而抑制小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞衰老[12-13]，但以上作用機(jī)制均不甚明確。本研究通過D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建衰老模型，探究CH-Ⅰ的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器

PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株）購買于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。CH-Ⅰ注射液（#0190501-1，30 mg/支）購自河北智同生物制藥股份有限公司，D-gal（K1915124，純度≥99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色試劑盒（C0602）購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p-STAT3（Tyr705，AF3293）、β-actin（AF7018）抗體購自美國Affinity公司，TERT抗體（NB100-317）購買于美國Novus公司。酶標(biāo)儀（SYNERGYH1）購買于美國Bio-Tek公司，垂直電泳儀（PowerPacTMHC）購買于美國Bio-Rad公司，光學(xué)顯微鏡（IX-70）購買于日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀（CytoFLEXS）購自美國Beckman Coulter公司。

1.2SA-β-Gal染色檢測PC12細(xì)胞衰老率

PC12細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含有5%胎牛血清）中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，每孔按1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，分為對照組、模型組、低濃度組和高濃度組。對照組于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；模型組經(jīng)20 g/L的D-Gal誘導(dǎo)48 h成功后[14]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；低濃度組和高濃度組經(jīng)20 g/L的D-Gal誘導(dǎo)48 h成功后，分別加入60、120 mg/L的CH-Ⅰ繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)SA-β-Gal染色試劑盒說明書進(jìn)行染色后，于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞衰老率。衰老細(xì)胞率=（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞凋亡率

取各組處理結(jié)束的PC12細(xì)胞以2.5%胰酶（不含EDTA）消化后，4 ℃下1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再次4 ℃下1 000 r/min離心 5 min，棄上清液。嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明書操作要求進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，使用CytExpert軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4Western Bolt法檢測PC12細(xì)胞蛋白表達(dá)

取各組處理結(jié)束的PC12細(xì)胞，加入RIPA裂解液，靜置5 min裂解細(xì)胞，移至新的EP離心管中，冰上靜置15 min，以12 000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞當(dāng)中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離各組蛋白樣品，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，洗膜后加一抗（TERT 1∶500、p-STAT3 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然后加山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1.5 h。使用ECL發(fā)光液顯色，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5PCR-ELISA法檢測PC12細(xì)胞端粒酶活性

取各組處理結(jié)束的PC12細(xì)胞，向EP管中加入PCR-ELISA試劑盒自帶的裂解液，充分裂解細(xì)胞后，加入至含有端粒酶底物的試管中，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體儀器程序設(shè)置如下：預(yù)變性94 ℃ 30 s；變性94 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。以RNA酶滅活的裂解物為陰性對照，試劑盒獲得的提取物作為陽性對照。向上述PCR產(chǎn)物（50 μL）中加入變性試劑25 μL和雜交緩沖液25 μL（共100 μL）搖床振蕩孵育2 h，加入100 μL抗地高辛過氧化物酶溶液搖床振蕩30 min，隨后進(jìn)行TMB顯色液顯色。使用酶標(biāo)儀分別在波長450、690 nm處測定樣品的吸光度（A）值，并計(jì)算各樣本的相對吸光度值，以相對吸光度值作為端粒酶相對表達(dá)量即端粒酶活性，以相對吸光度值大于0.2為端粒酶陽性。相對吸光度值=（樣品A450nm－樣品A690nm）－（陰性對照A450nm－陰性對照A690nm）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞衰老率比較

對照組、模型組及低、高濃度組細(xì)胞衰老率分別為（15.67±2.08）%、（54.33±4.04）%、（42.33±2.76）%、（34.67±1.53）%，各組間比較差異有顯著性（F=121.00，Plt;0.05）；其中與模型組細(xì)胞相比較，對照組細(xì)胞以及低、高濃度組細(xì)胞衰老率均顯著降低（tLSD=7.74～27.03，Plt;0.05），與低濃度組相比較，高濃度組細(xì)胞衰老率顯著降低（tLSD=7.66，Plt;0.05）。見圖1，圖中箭頭指向的藍(lán)染細(xì)胞為衰老細(xì)胞。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較

對照組、模型組及低、高濃度組細(xì)胞凋亡率分別為（9.39±2.93）%、（43.90±5.31）%、（26.20±4.15）%、（20.27±3.20）%，各組間比較差異有顯著性（F=32.21，Plt;0.05）；其中與對照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率明顯增高（tLSD=17.77，Plt;0.05），而與模型組相比，低、高濃度組細(xì)胞凋亡率明顯降低（tLSD=8.25、21.43，Plt;0.05），低、高濃度組比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖2。

2.3各組細(xì)胞中端粒酶活性比較

對照組、模型組和低、高濃度組細(xì)胞的端粒酶活性分別為1.15±0.19、0.65±0.17、0.77±0.16、0.85±0.19，各組間比較差異具有顯著性（F=4.32，Plt;0.05）；其中與對照組相比，模型組細(xì)胞端粒酶活性顯著降低（tLSD=6.21，Plt;0.05），與模型組相比較，低、高濃度組細(xì)胞端粒酶活性顯著升高（tLSD=2.01、2.49，Plt;0.05），低、高濃度組比較差異無顯著性（P＞0.05）。

2.4各組細(xì)胞中TERT、p-STAT3蛋白相對表達(dá)水平比較

對照組、模型組和低、高濃度組細(xì)胞的TERT蛋白相對表達(dá)水平分別為0.34±0.12、0.16±0.06、0.25±0.05、0.27±0.06，p-STAT3蛋白相對表達(dá)水平分別為0.64±0.09、0.51±0.07、0.81±0.09、0.92±0.10，各組間比較差異具有顯著性（F=7.65、9.24，Plt;0.05）；其中與對照組相比較，模型組細(xì)胞中的TERT和p-STAT3蛋白相對表達(dá)水平顯著降低（tLSD=2.61、2.36，Plt;0.05）；與模型組比較，低、高濃度組細(xì)胞中TERT和p-STAT3蛋白相對表達(dá)水平均顯著升高（tLSD=2.21～6.03，Plt;0.05）；低濃度組與高濃度組無顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

3討論

PC12細(xì)胞是目前用于研究神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制及藥物對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的理想細(xì)胞模型。D-Gal是一種還原糖，動物實(shí)驗(yàn)中長期高濃度給藥后可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為半乳糖，而半乳糖又可以增加活性氧自由基（ROS）的生成。HONG等[15]的研究顯示，D-Gal在PC12細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的異常聚集可能會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的衰老。因此，本研究以D-Gal誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞衰老模型，結(jié)果顯示，給予PC12細(xì)胞D-Gal處理后，PC12細(xì)胞衰老率顯著增加，這與既往的研究結(jié)果相似[16]。

XING等[17]研究顯示，CH-Ⅰ在年齡相關(guān)性疾病的治療中具有類神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。為了研究CH-Ⅰ對衰老神經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制，本研究采用SA-β-Gal染色檢測CH-Ⅰ是否具有影響PC12細(xì)胞衰老的作用，結(jié)果顯示CH-Ⅰ可以明顯地降低D-Gal誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老率，提示CH-Ⅰ可以緩解神經(jīng)元細(xì)胞衰老。為了進(jìn)一步研究CH-Ⅰ對PC12細(xì)胞凋亡的影響，本研究使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示CH-Ⅰ可以顯著地抑制D-Gal誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示CH-Ⅰ對D-Gal誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和凋亡具有一定的保護(hù)和抑制作用。

既往研究證實(shí)，端粒酶在腦衰老（如AD）中有重要作用，TERT是端粒酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)節(jié)亞基。在SD大鼠腦缺血損傷模型中，通過誘導(dǎo)神經(jīng)元中的TERT表達(dá)，可以顯著降低大鼠缺血性神經(jīng)元的損傷程度[18]。臨床病理研究顯示，在AD患者的海馬神經(jīng)元中，端粒酶活性和TERT水平均顯著降低[19]。由此推測通過恢復(fù)端粒酶活性和提高TERT表達(dá)水平，也許能夠阻止神經(jīng)元的老化。目前，利用神經(jīng)損傷模型以探究端粒酶和TERT在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用已取得了一定的進(jìn)展[20-21]。新近研究也顯示，通過藥物影響端粒酶活性可以起到一定的抗衰老作用[22-23]。為了研究CH-Ⅰ對衰老神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制，本研究又進(jìn)行了PCR-ELISA和Western Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高濃度組中PC12細(xì)胞的端粒酶活性顯著增高，TERT表達(dá)水平顯著升高，提示CH-Ⅰ可能是通過增強(qiáng)TERT表達(dá)和提高端粒酶活性而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。既往研究表明，TERT受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，STAT3與TERT的調(diào)控密切相關(guān)，其磷酸化后可促進(jìn)TERT表達(dá)，增加端粒酶活性[24]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高濃度組PC12細(xì)胞中p-STAT3蛋白相對表達(dá)水平顯著升高，這提示CH-Ⅰ提高衰老PC12細(xì)胞中端粒酶活性可能是通過促進(jìn)STAT3蛋白磷酸化，繼而上調(diào)TERT的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，CH-Ⅰ可以減輕D-Gal誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡，其具體作用機(jī)制可能與促進(jìn)STAT3磷酸化，進(jìn)而上調(diào)PC12細(xì)胞中TERT表達(dá)水平和端粒酶活性有關(guān)。本研究為CH-Ⅰ用于衰老相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)，并為CH-Ⅰ的臨床應(yīng)用提供了新思路。

作者聲明：楊光文、朱琳、喬兵參與了研究設(shè)計(jì)；楊光文、王圓明、朱琳、倪欽帥參與了論文寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）