星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選穿琥寧固體脂質(zhì)微粒處方

張志勇，王鵬，何文生（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科，成都 610041；.核工業(yè)四一六醫(yī)院，成都 610051；.重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 4060）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法（CCD-RSM）是近年來常用的工藝優(yōu)選方法，比正交試驗(yàn)更簡化，比均勻設(shè)計(jì)法更全面。其實(shí)驗(yàn)精度高，雖然實(shí)驗(yàn)次數(shù)稍多，但模型更符合實(shí)際，能更準(zhǔn)確的反映出各因素對效應(yīng)的影響[1-2]。固體脂質(zhì)可提高藥物的生物利用度，具有較高的物理穩(wěn)定性，藥物泄漏慢，且毒性低。穿琥寧（PDS）是一種經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯酯化、脫水、成鹽而來的抗病毒和抗炎藥物[3]。但是，目前PDS制劑種類單一，且口服腸溶制劑的生物利用度低[4]。筆者采用CCD-RSM法優(yōu)選PDS固體脂質(zhì)微粒的處方，制備的PDS固體脂質(zhì)微?？刹捎梦牖蚱渌m宜給藥途徑，可降低不良反應(yīng)發(fā)生率，使臨床選擇多樣化，也可為PDS制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10 A Tvp高效液相色譜（HPLC）儀，包括CLASS-vp色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（日本島津公司）；XP205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TG16-WS臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；AS3120型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率:120 W，頻率:40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

PDS原料藥（廣漢市維康植化有限公司，純度:98.0%，批號:070228）；脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度:99.8%，批號:111598-200807）；藥用硬脂酸（湖州展望藥業(yè)有限公司，批號:20091108）；泊洛沙姆（德國BASF公司，規(guī)格:Lutrol F68，批號:WPEE587 E）；卵磷脂（美國Sigma公司，批號:P5638）；純化水由四川大學(xué)華西醫(yī)院制劑室提供，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 PDS固體脂質(zhì)微粒分散液的制備[5-6]

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備微粒。分別稱取處方量硬脂酸、卵磷脂，40Ⅸ水浴下溶于0.20ml三氯甲烷-乙醇（3∶1，V/V）混合液中，與60mg/ml的PDS水溶液快速渦旋混勻，超聲乳化2min后，直接將初乳分散到同溫度的5ml泊洛沙姆液中，超聲2min，形成復(fù)乳，再將復(fù)乳分散到15ml冰浴中的泊洛沙姆液中，繼續(xù)攪拌1 h，即得PDS固體脂質(zhì)微粒分散液，備用。

2.2 包封率的測定

2.2.1 色譜條件色譜柱:Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇∶水（0.05%KH2PO4，pH2.51）＝（65∶35，V/V）；流速:1.0ml/min；柱溫:30Ⅸ；檢測波長:251nm；進(jìn)樣量:5μl。。在此色譜條件下，理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，分離度不低于1.5。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽4.2mg，置于25ml量瓶中，添加空白固體脂質(zhì)微粒分散液（取不含PDS的各處方量輔料，按“2.1”項(xiàng)下方法制備）10ml，以50%甲醇稀釋，定容，0.22 μm微孔濾膜濾過。分別進(jìn)樣2、4、8、16、32、48μl，測定峰面積。以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，以脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝1052060 x－18949.44（n＝6，r＝0.9999）。結(jié)果表明，脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯的進(jìn)樣量在0.336～8.064μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品測定 由文獻(xiàn)可知，PDS于60Ⅸ乃至更高溫度下放置24h，含量降低＜5%[7]。故采用常溫離心法測定PDS固體脂質(zhì)微粒包封率。精密量取PDS固體脂質(zhì)微粒分散液2ml，置于2ml離心管中，以離心半徑為14 cm、8000 r/min離心10min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。在上述色譜條件下測定PDS含量，按下式計(jì)算包封率:包封率＝（加入PDS總量－介質(zhì)中游離PDS的量）/加入PDS總量×100%。

2.3 粒徑測定[8]

2.3.1 測定標(biāo)準(zhǔn) 按2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅨE項(xiàng)下粒度和粒度分度測定法中第一法，采用顯微鏡法測定PDS固體脂質(zhì)微粒粒徑及粒徑分布，計(jì)算目鏡測微尺每1小格的長度。不同目鏡倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格的長度分別為:4×目鏡下:10×30/9＝33 μm；10×目鏡下:10×68/50＝13.6 μm；40×目鏡下:10×1/3＝3.3 μm；100×目鏡下:10×3/22＝1.36 μm。

2.3.2 樣品測定 取PDS固體脂質(zhì)微粒分散液適量，用力搖勻后取少量樣品，滴到載玻片上，蓋以蓋玻片，防止氣泡混入，再在400～1000倍顯微鏡下檢視規(guī)定視野內(nèi)的總粒數(shù)，測定不少于500個粒徑，求平均值（Dav）。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選處方

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對處方影響較大的3個因素，即脂質(zhì)比（硬脂酸-卵磷脂，W1/O，A）、油相與內(nèi)水相體積比（SA/SPC，B）、外水相表面活性劑（即泊洛沙姆）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）為考察因素，以包封率、平均粒徑為評價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選工藝。因素與水平見表1；星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of Central composite design-response surface methodology

2.4.2 模型擬合 采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件對各因素、水平進(jìn)行多元線性與二項(xiàng)式擬合。多元線性方程為Y包封率＝35.92+12.74 X1+0.07 X2－63.34 X3（R2＝0.1336，P＞0.05）、Y平均粒徑＝1.43－ 1.38 X1+1.28 X2－ 0.26 X3（R2＝0.2031，P＝0.1062＞0.10）。根據(jù)t檢驗(yàn)，刪除P＞0.05的項(xiàng)，簡化模型，所得二項(xiàng)式方程為 Y包封率＝137.43 X1－67.49 X12+0.26 X22（R2＝0.4633，P＞0.05）、Y平均粒徑＝17.96 X1－11.23 X2+28.27 X3+3.99 X1X2－16.5 X1X3－1.17 X2X3－8.86 X12+0.76 X22（R2＝0.8513，P＜0.05）。根據(jù)擬合結(jié)果，二次項(xiàng)擬合線性相關(guān)系數(shù)均高于多元線性擬合，說明各因素與包封率和粒徑大小的關(guān)系更趨向于二次項(xiàng)關(guān)系，而非線性。平均粒徑的擬合二次項(xiàng)相關(guān)系數(shù)P值稍佳，但二者擬合多元線性相關(guān)性均較差，擬合方程不具有指導(dǎo)意義。故3個因素對包封率均具有一定影響，其中因素A、C對包封率影響最明顯。

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 根據(jù)二項(xiàng)式方程，應(yīng)用Origin 8.0軟件分別繪制包封率、平均粒徑與各因素的三維效應(yīng)面和二維等高線圖，見圖1。

由圖1可知，在包封率方面，因素B的影響較大，且比例在1∶1時(shí)出現(xiàn)極值，之后包封率出現(xiàn)一個平臺區(qū)；而因素A比例在3～5、10～11時(shí)，包封率出現(xiàn)極值；因素C在0.02%時(shí)包封率出現(xiàn)極值；因素A、C對包封率具有交互影響。在平均粒徑方面，本課題組要求粒子粒徑范圍為1～7.5 μm[9]。因素A、B、C對粒徑的影響都較明顯，因素B＞1.2時(shí)，對粒徑的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因素A、C對平均粒徑存在一定的影響，且二者對平均粒徑有交互影響。

根據(jù)三維效應(yīng)面和二維等高線，得到各因素的預(yù)測范圍。綜合考慮成本等因素，選取預(yù)測范圍內(nèi)各因素的最佳參數(shù)為A＝1.0、B＝8、C＝1.0，即油相與內(nèi)水相體積為0.2∶0.2，脂質(zhì)比為8∶1（m/m），泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。各因素最佳預(yù)測范圍見表3。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

圖1 三維效應(yīng)面與二維等高線圖A.脂質(zhì)比和油相與內(nèi)水相體積比對包封率的影響；B.泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油相與內(nèi)水相體積比對包封率的影響；C.泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脂質(zhì)比對包封率的影響；D.脂質(zhì)比和油相與內(nèi)水相體積比對粒徑的影響；E.泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油相與內(nèi)水相體積比對粒徑的影響；F.泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脂質(zhì)比對粒徑的影響Fig 1 Three-dimensional response surface and two-dimensional contour mapA.effects of W1/O and SA/SPC on entrapment efficiency；B.effects of concentration of poloxamer and W1/O on entrapment efficiency；C.effects of concentration of poloxamer and SA/SPC on entrapment efficiency；D.effects of W1/O and SA/SPC on particle size；E.effects of concentration of poloxamer and W1/O on particle size；F.effects of concentration of poloxamer and W1/O on particle size

表3 各因素最佳預(yù)測范圍Tab 3 The best estimation range of factors

按“2.4”項(xiàng)下優(yōu)選的處方稱取主輔料各適量，照“2.1”項(xiàng)下方法制備3批PDS固體脂質(zhì)微粒分散液，測定包封率和平均粒徑，并在顯微鏡下觀察其粒徑分布。工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4；粒徑分布圖見圖2；光學(xué)顯微鏡圖見圖3。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（）Tab 4 Results of validation test（）

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（）Tab 4 Results of validation test（）

批次1 2 3平均值包封率，%53.79±2.3355.12±1.7855.78±1.0154.90±1.01平均粒徑，μm 6.19±2.456.27±2.006.35±1.906.27±0.08

圖2 粒徑分布圖Fig 2 Distribution of particle size

圖3 光學(xué)顯微鏡圖Fig 3 Light microscopy

由表4、圖2、圖3可知，驗(yàn)證試驗(yàn)中，平均包封率、平均粒徑與星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面試驗(yàn)的最高值、平均值相當(dāng)；制備的微粒粒子形態(tài)良好，呈球形或近球形，粒徑較小，多數(shù)分布于10 μm以下，且基本呈正態(tài)分布，表明所選處方合理、可行，可用于制備PDS固體脂質(zhì)微粒。

3 討論

在進(jìn)行CCD-RSM試驗(yàn)時(shí)，各組粒子形態(tài)較好，多呈球形或近球形，分散情況良好。個別組出現(xiàn)粒徑較大者（第9組），但其包封率稍高。同時(shí)，其他粒徑稍大者，多數(shù)包封率較高。這可能是因?yàn)榱酱笳?，?fù)乳化過程較短，剛性囊壁迅速形成，藥物向外水相擴(kuò)散時(shí)間較短，致使包封率稍高。

PDS作為一種水溶性藥物，脂溶性很差，以復(fù)乳法制備固體脂質(zhì)微粒，藥物易向外水相擴(kuò)散而使包封率降低，油相中表面活性劑的濃度與外水相中表面活性劑的濃度是維持復(fù)乳穩(wěn)定的重要因素?？焖傩纬梢欢▌傂缘哪冶?，也是減少藥物向外水相擴(kuò)散的方法之一。同時(shí)，外水相中表面活性劑能顯著降低油相的表面張力，形成小粒徑微粒，表面活性劑濃度越小，復(fù)乳越不穩(wěn)定，易破乳致包封率降低。油相與內(nèi)水相的體積比對包封率與粒徑也有較大的影響。后續(xù)研究需對油相溶劑等因素進(jìn)行有針對性的篩選與改進(jìn)。

[1]吳偉，崔光華.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學(xué)中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，2000，27（5）:292.

[2]邱穎，朱玲，孫曉英.星占設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法與正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的比較及其在藥劑研究中的應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2011，23（2）:18.

[3]羅愛庭.中藥穿琥寧的晶體結(jié)構(gòu)研究[D].成都:四川大學(xué)，2006.

[4]王鵬，江云鷗，張志勇.穿琥寧體外穩(wěn)定性研究[J].中國藥房，2010，21（39）:3664.

[5]Jaspart S，Bertholet P，Piel G，et al.Solid lipid microparticles as a sustained release system for pulmonary drug delivery[J].Eur J Pharm Biopharm，2007，65（1）:47.

[6]李姜暉，王柏.乳化蒸發(fā)法制備固體脂質(zhì)納米粒[J].藥學(xué)進(jìn)展，2008，32（3）:127.

[7]羅巍偉.穿琥寧穩(wěn)定性與新制劑[D].成都:四川大學(xué)，2005.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄73.

[9]梁文權(quán).生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:87-89.