脂肪酶催化茶油的抗氧化特征分析

摘" 要：茶油是一種具有極高營養(yǎng)價(jià)值和保健功效的食用植物油。該研究探討脂肪酶處理對(duì)茶油抗氧化特性的影響。結(jié)果顯示，脂肪酶可顯著提高茶油中游離脂肪酸含量，且通過氧化安定性測(cè)定，確認(rèn)該處理并未降低茶油的氧化穩(wěn)定性。此外，脂肪酶處理的茶油在DPPH和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)特定脂肪酶處理的茶油能有效抵御紫外線UVB對(duì)皮膚細(xì)胞的損傷。氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用和主成分分析（PCA）揭示脂肪酶能夠改變茶油的化學(xué)成分，特別是1∶1 000質(zhì)量比處理24 h的茶油，具有獨(dú)特的化學(xué)特性和細(xì)胞保護(hù)作用。分子對(duì)接分析顯示，茶油中的化合物可能通過抑制JNK和p38蛋白激酶來保護(hù)細(xì)胞。研究結(jié)果可為茶油的生物催化應(yīng)用和工藝優(yōu)化提供科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶油；抗氧化；光保護(hù)；分子對(duì)接；蛋白激酶

中圖分類號(hào)：TQ658" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2095-2945（2025）08-0052-07

Abstract： Tea oil is a highly nutritious edible vegetable oil with notable health benefits. This study investigated the impact of lipase treatment on the antioxidant properties of tea oil. The findings revealed that lipase significantly increased the free fatty acid content in tea oil， without compromising its oxidation stability， as confirmed by the oxidation stability assay. Furthermore， lipase-treated tea oil demonstrated enhanced antioxidant capacity in DPPH and ABTS radical scavenging assays. In cellular assays， lipase-treated tea oil effectively protected HaCaT cells from UVB-induced damage. Gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） and principal component analysis （PCA） indicated that lipase treatment altered the chemical composition of tea oil， especially in the sample treated for 24 hours at a 1∶1 000 mass ratio， which exhibited unique chemical properties and cell-protective effects. Molecular docking analysis suggested that certain compounds in tea oil may protect cells by inhibiting JNK and p38 protein kinases. These findings provide a scientific foundation for the biocatalytic application of tea oil and inform future process optimization.

Keywords： tea oil; antioxidant; photoprotection; molecular docking; protein kinase

紫外線是影響皮膚結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因素之一，其中的UVB輻射是引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷的關(guān)鍵因素。這種輻射不僅會(huì)損害皮膚的彈性纖維和膠原纖維，促成皺紋的生成，還會(huì)釋放羥基自由基，這些自由基能夠干擾細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，引發(fā)脂質(zhì)自由基的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[1]。紫外線照射主要是通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的途徑，促進(jìn)活性氧（ROS）的生成，進(jìn)而調(diào)節(jié)核因子NF-κB的表達(dá)[2]。MAPK是一個(gè)包含多種酶類的大家族[3]，主要包括3種類型：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun-末端激酶（JNK）和p38激酶。這些激酶在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過這些復(fù)雜的生物化學(xué)過程，紫外線對(duì)皮膚健康的影響得以全面展現(xiàn)。

過往研究揭示了植物界中的多樣化學(xué)成分，這些成分具備成為有效的光保護(hù)劑的潛力。例如，櫻花提取物展現(xiàn)出了其卓越的光保護(hù)功能[4]，它能夠降低活性氧和丙二醛的水平，同時(shí)提升抗氧化酶的活性，從而在抵御紫外線傷害方面發(fā)揮重要作用。此外，葡萄葉提取物已被證實(shí)能夠減輕DNA損傷[5]，為細(xì)胞遺傳物質(zhì)提供額外的保護(hù)層。魚腥草提取物中的槲皮素和高蘆丁[6]，通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，有效減少了紫外線誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧。茶油以其豐富的不飽和脂肪酸而著稱，還富含多種功效性物質(zhì)，包括角鯊烯、茶皂素、茶多糖、山茶皂苷、山茶苷、茶多酚、生育酚以及黃酮類化合物等，因此多篇研究顯示茶油具有抗氧化[7-8]、抗發(fā)炎[9]及防曬[10]等功效。脂肪酶主要作用是催化脂類的水解反應(yīng)[11]，能夠?qū)⑷视王ィ╰riglycerides）分解成甘油和游離脂肪酸，其可以應(yīng)用于植物油工業(yè)，經(jīng)脂肪酶處理后的植物油，可以提高脂肪的抗氧化性能[12]，改變植物油結(jié)構(gòu)中的脂肪酸[13]，提高對(duì)脂肪酶的親和力，使得抗氧化物質(zhì)在油脂中的分散更為均勻，從而有效地改善油脂的抗氧化性能，通過優(yōu)化催化過程對(duì)油脂成分進(jìn)行靶向修飾，來提高高品質(zhì)食品的潛力。

1" 儀器與材料

1.1" 儀器

氧化安定性測(cè)定儀（RapidOxy 100，Anton Paar，奧地利），離心機(jī)（MIKRO 220R，Hettich，德國），酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x，Molecular Devices，美國），細(xì)胞紫外輻照系統(tǒng)（Bio-Sun，Vilber Bio Imaging，法國），氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-7000B，Agilen，美國）。

1.2" 材料

脂肪酶，購自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

1.3" 試劑

DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），ABTS（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）），總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

2" 研究方法

2.1" 酶催化茶油處理

將脂肪酶以不同質(zhì)量比例（1∶1 000及1∶2 000）添加至茶油中。反應(yīng)體系由脂肪酶（在pH為7的25 mmol/L Tris緩沖液和150 mmol/L NaCl中溶解）、2.5%無水乙醇和0.5%吐溫80組成。在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，該反應(yīng)體系分別孵育6 h和24 h，以評(píng)估酶活性和催化效果。

2.2" 酸值滴定實(shí)驗(yàn)分析

參考GB/T 5510—2011《糧油檢驗(yàn) 糧食、油料脂肪酸值測(cè)定》方法進(jìn)行酸值滴定實(shí)驗(yàn)。配制0.01 mol/L氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準(zhǔn)滴定液，將4 mL反應(yīng)后的茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油置于錐形瓶中，加入4 mL的0.04%酚酞乙醇溶液，立即用氫氧化鉀-乙醇滴定液滴定至微紅色，30 s不褪色即可，記錄耗用的氫氧化鉀-乙醇滴定液的體積。

2.3" 過氧化值滴定實(shí)驗(yàn)分析

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》。配制正己烷-冰醋酸混合溶液，將1 g的茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油置于250 mL碘量瓶中，加入10 mL正己烷-冰乙酸混合液使其完全溶解，再加入1 mL飽和碘化鉀溶液震蕩反應(yīng)30 s后，置于暗處3 min，加入0.5 mL淀粉指示劑，滴定至溶液藍(lán)色消失為止。

2.4" 氧化安定分析

利用氧化安定性測(cè)定儀檢測(cè)茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油。溫度設(shè)置為100 ℃，填充壓力為700 kPa，反應(yīng)時(shí)間為2 h。

2.5" 抗氧化分析

配制0.25 mg/mL的DPPH母液，并將其稀釋至酶標(biāo)儀517 nm波長下測(cè)得吸光度為0.8～1.0之間的工作液，備用。取180 μL的DPPH工作液和20 μL的茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油（10、5、2.5、1.25 mg/mL）反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀波長為517 nm下測(cè)定吸光度。陰性對(duì)照采用DMSO。DPPH自由基清除率計(jì)算公式：自由基清除率（%）=（空白吸光度-樣品吸光度/空白吸光度）×100%。

采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）進(jìn)行分析。ABTS工作液預(yù)先進(jìn)行配制，使其在酶標(biāo)儀734 nm波長下測(cè)得吸光度為0.7±0.05時(shí)即可使用。取180 μL的ABTS工作液和20 μL的茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油（10、5、2.5、1.25 mg/mL）反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀波長為734 nm下測(cè)定吸光度。陰性對(duì)照采用DMSO。ABTS自由基清除率計(jì)算公式：自由基清除率（%）=（空白吸光度-樣品吸光度/空白吸光度）×100%。

2.6" 細(xì)胞存活率分析

利用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）進(jìn)行人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）測(cè)試。細(xì)胞以1×105/mL的濃度放入96孔板中，在37 ℃和5% CO2的條件下孵育24 h。將茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油（10、5、2.5和1.25 mg/mL）分別加入到細(xì)胞中進(jìn)行24 h的反應(yīng)，然后去除上清液。使用DMSO作為對(duì)照。接著，將含有10 ？滋L MTT（5 mg/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入到96孔板中的細(xì)胞，在37 ℃和5% CO2的條件下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的吸光度。

2.7" 預(yù)防細(xì)胞光損傷分析

利用HaCaT細(xì)胞進(jìn)行UVB紫外線的照射分析，將細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的條件下孵育過夜后，加入茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油反應(yīng)1 h，再將其置入細(xì)胞紫外輻照系統(tǒng)中照射300 mJ/cm2，于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再利用MTT法分析細(xì)胞存活率。

2.8" 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀實(shí)驗(yàn)分析

取0.1 g茶油產(chǎn)物以及未處理的茶油，用乙酸乙酯稀釋至100 ppm，取1 mL樣品加入0.2 g無水硫酸鈉，混合后靜置過夜去除水分，再以0.22 μm過濾即可進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。氣相色譜條件使用氮?dú)鉃檩d氣，以1 mL/min的流速通過色譜柱，樣品以1 μL注入系統(tǒng)。進(jìn)樣口設(shè)置為230 ℃，以利于樣品的氣化。樣品進(jìn)樣方式采用分流進(jìn)樣，分流比設(shè)定為30∶1。質(zhì)譜檢測(cè)部分，選擇電子轟擊電離（EI）電離模式，電子能量為70 eV。以全掃描模式和特征離子掃描模式鑒定目標(biāo)化合物。

2.9" 分子對(duì)接分析

使用分子對(duì)接程序AutoDock Vina （https：//autodock.scripps.edu/）預(yù)測(cè)化合物和JNK及p38蛋白之間可能的相互作用。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索JNK1蛋白（PDB ID：1UKI）及p38蛋白（PDB ID： 3ZS5）的晶體結(jié)構(gòu)，選擇其中一個(gè)作為對(duì)接靶點(diǎn)。對(duì)接前對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行預(yù)處理，包含去除水分子、刪除原始配體和添加氫?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。通過多次對(duì)接模擬確定最佳構(gòu)象。

3" 結(jié)果與分析

3.1" 茶油酸值及過氧化值滴定分析

酸值，亦稱為酸價(jià)，是衡量化學(xué)物質(zhì)（例如脂肪酸）或混合物中游離羧酸基團(tuán)含量的一種量化指標(biāo)[14]。這個(gè)指標(biāo)不僅反映了物質(zhì)的酸性強(qiáng)度，也是評(píng)估油脂品質(zhì)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)。而過氧化值是油脂中過氧化物含量的量化指標(biāo)，過氧化物是油脂氧化酸敗過程中的首要產(chǎn)物，過氧化值的升高也代表油脂氧化程度的加劇[15]。結(jié)果顯示，茶油在經(jīng)過脂肪酶處理后，酸價(jià)和過氧化值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖1）。隨著脂肪酶催化作用時(shí)間的延長，這2種指標(biāo)的增加更為顯著，與脂肪酶反應(yīng)24 h的茶油（1000-24及2000-24）都比反應(yīng)6 h明顯地高（1000-6及2000-6）。添加脂肪酶量較高（1000）的茶油，也比添加量低（2000）的高。此結(jié)果表明，脂肪酶確實(shí)與茶油發(fā)生了催化反應(yīng)，導(dǎo)致游離脂肪酸含量的增加。

3.2" 茶油氧化安定性能分析

通過使用氧化安定性測(cè)定儀，加速茶油的氧化過程，以此來評(píng)估脂肪酶催化作用后的茶油氧化穩(wěn)定性[16]。在實(shí)驗(yàn)中，將溫度控制在100 ℃，并設(shè)置填充壓力為700 kPa。經(jīng)過大約35 min的測(cè)試，觀察到茶油的壓力上升到了900 kPa（圖2）。經(jīng)過2 h的反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果顯示即使茶油經(jīng)過了脂肪酶的處理，壓力值并未出現(xiàn)下降。此結(jié)果表明，盡管脂肪酶催化作用可能促進(jìn)了游離脂肪酸的生成，但它并未對(duì)茶油的整體氧化安定性產(chǎn)生負(fù)面影響。

3.3" 茶油抗氧化效能分析

為了深入探究茶油經(jīng)過脂肪酶催化后的抗氧化特性，本研究將其反應(yīng)產(chǎn)物與DPPH和ABTS自由基進(jìn)行評(píng)估（圖3）。結(jié)果表明，脂肪酶催化作用顯著提高了茶油的DPPH自由基清除能力，尤其是在脂肪酶與茶油的質(zhì)量比為1∶2 000時(shí)，其清除效果表現(xiàn)出了優(yōu)異的趨勢(shì)。在ABTS自由基清除能力的測(cè)試中，當(dāng)茶油的濃度低于5 mg/mL時(shí)，其抗氧化效果并不明顯。然而，將茶油濃度提高到10 mg/mL，便觀察到與DPPH實(shí)驗(yàn)相似的現(xiàn)象，經(jīng)脂肪酶催化的茶油展現(xiàn)出了顯著的自由基清除能力。

圖2" 利用氧化安定性測(cè)定儀分析茶油與脂肪酶反應(yīng)后的氧化安定性

3.4" 茶油預(yù)防紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分析

紫外線對(duì)皮膚細(xì)胞具有一定的殺傷力，本實(shí)驗(yàn)在探究經(jīng)過與脂肪酶反應(yīng)后的茶油產(chǎn)物是否能夠維持細(xì)胞的存活并增強(qiáng)其對(duì)UVB輻射損傷的抵抗力。通過細(xì)胞活性測(cè)試和UVB照射后的細(xì)胞保護(hù)評(píng)估，確認(rèn)經(jīng)脂肪酶處理的茶油在皮膚護(hù)理和細(xì)胞保護(hù)方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量比例及反應(yīng)時(shí)間對(duì)于細(xì)胞都不具有殺傷力的影響，但經(jīng)UVB照射后，只有脂肪酶與茶油的質(zhì)量比為1∶1 000，反應(yīng)24 h的茶油產(chǎn)物，能夠有效保護(hù)細(xì)胞免于紫外線的傷害（圖4）。HaCaT細(xì)胞照射300 mJ/cm2的UVB后，其存活率降至54%，但隨著酶催化茶油產(chǎn)物的添加，HaCaT細(xì)胞存活率有增加的趨勢(shì)，在5 mg/mL濃度時(shí)，HaCaT細(xì)胞存活率可達(dá)82%。

3.5" 茶油成分分析

利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定茶油的成分，并利用主成分分析（PCA）識(shí)別不同茶油樣品之間的主要差異（圖5）。在主成分分析結(jié)果中，第一主成分（PCI）占據(jù)了總方差的72.3%，表明它是區(qū)分這些樣品的核心因素。特別值得注意的是，脂肪酶與茶油以1∶1 000的質(zhì)量比在反應(yīng)6 h后產(chǎn)生的茶油產(chǎn)物，在3次獨(dú)立重復(fù)的分析中顯示出較大的差異性。進(jìn)一步運(yùn)用Venn圖直觀地展示了不同茶油樣品間共有及獨(dú)有的化學(xué)成分。特別是茶油產(chǎn)物1000-24，由于其出色的細(xì)胞光保護(hù)作用，能有效抵御紫外線的傷害，Venn圖揭示了它含有17個(gè)獨(dú)特的化合物成分。此結(jié)果不僅突顯了1000-24樣品的獨(dú)特化學(xué)特征，也為其潛在的生物活性提供了科學(xué)依據(jù)。

3.6" 分子對(duì)接分析

紫外線照射能夠激活JNK和p38蛋白激酶，而這2種活化的蛋白激酶又可以進(jìn)一步促進(jìn)活性氧（ROS）的生成。這種連鎖反應(yīng)導(dǎo)致ROS水平上升，從而可能間接加劇細(xì)胞損傷，引發(fā)多種人類疾病[1]。鑒于酶催化茶油（1000-24）在預(yù)防細(xì)胞凋亡方面顯示出顯著效果，本研究旨在探究其特有化合物是否具有抑制JNK和p38蛋白的能力。采用AutoDock Vina軟件對(duì)酶催化茶油（1000-24）中的化合物與JNK1及p38蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行了分析（表1）。分析結(jié)果顯示，僅有4種化合物與目標(biāo)蛋白形成了氫鍵，分別是Octadecanoic acid，2，3-dihydroxypropyl ester、9，12-Octadecadienoic acid（Z，Z）-，phenylmethyl ester、Pentanoic acid， 3-methyl-4-oxo-和Sulfurous acid， 2-ethylhexyl nonyl ester。此外，Benzene， cyclobutyl-與JNK和p38蛋白的結(jié)合預(yù)測(cè)顯示存在π-π相互作用。從化合物與蛋白的結(jié)合能分析來看，Benzene， cyclobutyl-與JNK蛋白的結(jié)合能相對(duì)較低，表明其可能有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。同樣地，Benzene， cyclobutyl-、Octadecanoic acid， 2，3-dihydroxypropyl ester和9，12-Octadecadienoic acid （Z，Z）-， phenylmethyl ester與p38蛋白的結(jié)合能也較低，這表明它們可能在抑制p38蛋白的活化中發(fā)揮重要作用（圖6）。

4" 結(jié)論

茶油作為一種富含不飽和脂肪酸的珍貴植物油，已被證實(shí)具有卓越的抗氧化能力。這些不飽和脂肪酸能夠中和活性氧自由基，有效減緩甚至修復(fù)脂質(zhì)過氧化對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷[7-8]。此外，茶油中的酚類和黃酮類化合物也展現(xiàn)出了卓越的自由基清除能力，進(jìn)一步增強(qiáng)了其抗氧化特性[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酶催化處理的茶油（1000-24）能夠有效預(yù)防紫外線引發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。通過成分分析和分子對(duì)接技術(shù)，特別關(guān)注了3種化合物：Benzene， cyclobutyl-、Octadecanoic acid， 2，3-dihydroxypropyl ester和9，12-Octadecadienoic acid （Z，Z）-， phenylmethyl ester。這些化合物可能通過抑制JNK和p38蛋白激酶的活化，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。這些化合物分別代表了芳香族化合物、長鏈飽和脂肪酸酯和多不飽和脂肪酸酯。Octadecanoic acid， 2，3-dihydroxypropyl ester和9，12-Octadecadienoic acid （Z，Z）-， phenylmethyl ester可能通過脂肪酶催化的酯化反應(yīng)生成。而Benzene， cyclobutyl-的生成可能與脂肪酶的非特異性催化活性有關(guān)，或是由于底物結(jié)構(gòu)的特殊轉(zhuǎn)化，以及脂肪酶處理改變了茶油中脂肪酸的組成，間接影響了這些物質(zhì)的溶解度或提取效率。為了深入理解這些化合物的生成機(jī)制，未來的研究將探索具體的反應(yīng)途徑，以明確脂肪酶在這一過程中的作用?？傮w而言，本研究揭示了脂肪酶催化作用能夠提升茶油的抗氧化效果。然而，考慮到催化產(chǎn)物的疏水性質(zhì)，其產(chǎn)物的差異性也較大。因此，未來可以在催化工藝上進(jìn)行優(yōu)化，以期開發(fā)出具有更高穩(wěn)定性的酶催化茶油。

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