兩種促生菌對(duì)煙草生長(zhǎng)和根際土壤細(xì)菌群落的影響

關(guān)鍵詞：促生菌；根際土壤酶活性；細(xì)菌多樣性；細(xì)菌群落功能；煙草

煙草是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在全國(guó)各地廣泛種植。近年來(lái)，隨著煙田的連作種植、化肥和農(nóng)藥的大量使用，土壤出現(xiàn)了板結(jié)嚴(yán)重、理化性質(zhì)劣變、酶活性降低、微生物群落結(jié)構(gòu)改變等[1]一系列問(wèn)題，導(dǎo)致煙草生長(zhǎng)受限、病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重，產(chǎn)量和質(zhì)量下降。如何改善煙田土壤環(huán)境、提高煙草農(nóng)藝性狀成為目前煙草生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題。

印度梨形孢（Piriformosporaindica）是一種內(nèi)生真菌，可以定殖于多種植物根部[2]，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物生物量和品質(zhì)[3]，增強(qiáng)植物對(duì)生物與非生物逆境脅迫的耐受性[4]。比如，印度梨形孢促進(jìn)了擬南芥、大麥、甘薯、黃瓜等植物的生長(zhǎng)[5-8]，提高了水稻、煙草等植物的抗旱性[9-10]及番茄等植物的耐鹽性[11]，誘導(dǎo)了小麥對(duì)根腐病的抗性[12]。枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）廣泛存在于自然界中，能夠定殖于植物根際，具有促生、抗逆和抗病的重要作用[13]。研究表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生溶菌酶、嗜鐵素、抗生素等代謝物，直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[14]，還能夠提高土壤微生物多樣性，改善土壤特性，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和健康[15]。

研究表明，具有不同功能的有益微生物之間可以互補(bǔ)或協(xié)作，在一定程度上改善土壤性質(zhì)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢能夠促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，可以與AM真菌聯(lián)合使用提高煙草對(duì)干旱的抗性[17]；枯草芽孢桿菌Tpb55能夠增加煙草生物量[18]，提高根際土壤微生物多樣性[19]，還可以與棘孢木霉菌HG1共培養(yǎng)抑制煙草疫霉菌[20]。但是，印度梨形孢是一種植物根部?jī)?nèi)生真菌，枯草芽孢桿菌Tpb55分離自煙草葉片并能定殖植物根部[18，21]，兩者的定殖方式及促生機(jī)制有所不同，關(guān)于兩者協(xié)同處理對(duì)植物生長(zhǎng)和土壤細(xì)菌群落的影響尚不明確。為此，我們?cè)跍厥覘l件下進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，以云煙87為材料，分析印度梨形孢、枯草芽孢桿菌Tpb55及二者協(xié)同處理對(duì)煙草生長(zhǎng)、根際土壤酶活性、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，研究結(jié)果為有益微生物在煙草種植生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株 印度梨形孢（P.indica）由長(zhǎng)江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）Tpb55由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供；供試煙草品種為云煙87，由貴州省煙草科學(xué)研究院提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，蒸餾水1000mL。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nutrientagar，NA）：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。

以上培養(yǎng)基配方不加瓊脂即為本研究所使用的液體培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1煙草種植 采用常規(guī)育苗方法，待煙草種子萌發(fā)長(zhǎng)出2片真葉時(shí)移栽到花盆中（大田土壤與基質(zhì)1∶1混合，滅菌），置于26℃溫室，光照12h/d，生長(zhǎng)至4～5片真葉。

1.2.2印度梨形孢孢子懸浮液制備 將保存的印度梨形孢在PDA固體培養(yǎng)基上活化，5d后打取菌塊接種至100mLPDA液體培養(yǎng)基中，于28℃、200r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d，用勻漿儀將菌絲打碎，使孢子從菌絲上脫離，用無(wú)菌水調(diào)至孢子濃度為106個(gè)/mL，供煙草接種使用。

1.2.3枯草芽孢桿菌Tpb55菌懸液制備 將保存的枯草芽孢桿菌Tpb55在NA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于3mLNA液體培養(yǎng)基中，30℃、220r/min搖床振蕩培養(yǎng)12～16h，相同條件下再擴(kuò)大培養(yǎng)100倍，調(diào)整菌懸液活菌數(shù)為1×108cfu/mL，供接種使用。

1.2.4試驗(yàn)處理 當(dāng)煙苗長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，在其根部土壤澆灌接種印度梨形孢孢子懸浮液，21d后灌根接種枯草芽孢桿菌Tpb55菌懸液。設(shè)3個(gè)處理和1個(gè)對(duì)照：?jiǎn)为?dú)接種印度梨形孢（PI，3mL印度梨形孢孢子懸浮液），單獨(dú)接種枯草芽孢桿菌Tpb55（Tpb55，3mL枯草芽孢桿菌Tpb55菌懸液），先接種印度梨形孢后接種枯草芽孢桿菌Tpb55（PI+Tpb55，1mL印度梨形孢孢子懸浮液+2mL枯草芽孢桿菌Tpb55菌懸液），以煙草根部接種無(wú)菌水為對(duì)照（CK，3mL無(wú)菌水）。重復(fù)3次。

1.2.5煙草生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 枯草芽孢桿菌Tpb55接種30d后測(cè)定煙草生長(zhǎng)指標(biāo)，各處理組和對(duì)照組分別取10株煙草，測(cè)定地上、地下部分的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等指標(biāo)。

1.2.6根際土壤收集 枯草芽孢桿菌Tpb55接種30d后取煙草根際土壤，各處理組和對(duì)照組（CK）分別取3株煙草，重復(fù)3次。小心將煙草整株拔出，輕輕抖去根部松散土壤，收集粘附在根表面的土壤，置于無(wú)菌密封袋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7土壤酶活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[22]測(cè)定根際土壤中蔗糖酶、脲酶及磷酸酶的活性。其中，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法，脲酶活性采用尿素比色法，磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法。

1.2.8高通量測(cè)序 參照E.Z.N.A.?soil試劑盒（OMEGA）說(shuō)明書(shū)提取根際土壤細(xì)菌基因組DNA，使用引物343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）對(duì)細(xì)菌的16SrDNA（V3-V4區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，檢測(cè)合格后進(jìn)行IlluminaMiSeq測(cè)序。數(shù)據(jù)質(zhì)控后進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operationaltaxonomicunits，OTU）聚類(lèi)及注釋?zhuān)⒗肞ICRUSt2進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。以上測(cè)序和分析均委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.2.9數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 使用MicrosoftExcel2023進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS29進(jìn)行差異顯著性分析，GraphPad10.2進(jìn)行圖表處理。

2結(jié)果

2.1兩種促生菌對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

枯草芽孢桿菌Tpb55處理30d后觀察各處理對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖1～2所示。與CK相比，經(jīng)PI、Tpb55、PI+Tpb55處理的煙株生長(zhǎng)健壯，葉面積增大，株高增加（圖1A）。觀察煙草根系（圖1B）發(fā)現(xiàn)，與CK相比，PI組主根長(zhǎng)度增加，側(cè)根增多，差異顯著；Tpb55組根系無(wú)明顯差異；PI+Tpb55組主根長(zhǎng)度增加，側(cè)根數(shù)量增多，根毛極其旺盛。測(cè)定煙草的生物量發(fā)現(xiàn)，與CK相比，PI、Tpb55、PI+Tpb55各組煙草的地上、地下部分干、鮮質(zhì)量均有所增加，其中PI+Tpb55組最大，PI、Tpb55組次之（圖2）。由此可見(jiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55均能促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，兩種促生菌協(xié)同使用效果最好。

2.2兩種促生菌對(duì)煙草根際土壤酶活性的影響

由圖3可以看出，兩種促生菌處理后，煙草根際土壤蔗糖酶、脲酶及磷酸酶活性均有不同程度的提高。處理30d時(shí)，處理組PI、Tpb55、PI+Tpb55的煙草根際土壤蔗糖酶活性分別是CK的1.27、1.58、1.63倍，達(dá)到顯著性差異（plt;0.05）；處理組PI、Tpb55、PI+Tpb55煙草根際土壤脲酶活性分別是CK的1.25、1.30、1.38倍，達(dá)到顯著性差異（plt;0.05）；處理組PI、Tpb55、PI+Tpb55煙草根際土壤酸性磷酸酶活性分別是CK的1.36、1.48、1.63倍，達(dá)到顯著性差異（plt;0.05）。由此可見(jiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55均能夠提高煙草根際土壤蔗糖酶、脲酶與磷酸酶活性，兩種促生菌協(xié)同使用效果最好。

2.3兩種促生菌對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響

2.3.1根際土壤細(xì)菌群落的OTU聚類(lèi) 在相似度97%下將獲得的序列聚類(lèi)為OTU（OperationalTaxonomicUnits），結(jié)果如圖4。序列聚類(lèi)共得到21671個(gè)OTUs，處理組PI、Tpb55、PI+Tpb55煙草根際土壤OTUs數(shù)高于CK：共有細(xì)菌OTUs數(shù)為1960個(gè)，占總數(shù)的9.04%。PI處理組根際土壤特有的OTUs數(shù)為4591個(gè)，占總數(shù)的21.18%；Tpb55處理組根際土壤特有的OTUs數(shù)為3557個(gè)，占總數(shù)的16.41%；PI+Tpb55處理組根際土壤特有的OTUs數(shù)為4816個(gè)，占總數(shù)的22.22%。結(jié)果表明，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55不同處理增加了根際土壤細(xì)菌群落的多樣性，兩種促生菌協(xié)同使用效果最佳。

2.3.2根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性分析 利用Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性。由表1可知，兩種促生菌不同處理后煙草根際土壤中細(xì)菌Chao1指數(shù)大小順序?yàn)镻I+Tpb55gt;Tpb55gt;PIgt;CK，Shannon指數(shù)大小順序?yàn)镻I+Tpb55gt;Tpb55gt;PIgt;CK，Simpson指數(shù)大小順序?yàn)镻I+Tpb55

2.3.3根際土壤門(mén)水平的細(xì)菌群落組成分析 由圖5可知，不同處理煙草根際土壤中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadota）、放線菌門(mén)（Actinobacteriaota）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、黏球菌門(mén)（Myxococcota）、候選菌門(mén)（Patescibacteria）為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（相對(duì)豐度gt;1%）。雖然不同處理的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)大致相同，但與CK相比，PI、Tpb55、PI+Tpb55處理后的煙草根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度和群落組成存在明顯差異。其中，PI、Tpb55、PI+Tpb55處理后的根際土壤中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度比CK分別降低39.6%、8.3%和39.7%，芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度分別升高0.1%、26.7%和40%，放線菌門(mén)的相對(duì)豐度分別升高60.6%、12.1%和20.6%，酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度分別升高56.6%、13.3%和90%。更重要的是，PI+Tpb55處理后根際土壤中芽單胞菌門(mén)、Methylomirabilota、裝甲菌門(mén)（Armatimonadota）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrosporpta）、疣微桿菌門(mén)（Verrucomicrobiota）、遲桿菌門(mén)（Latescibacterota）、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)（Planctomycetota）相對(duì)豐度明顯高于CK、PI和Tpb55處理。

2.3.4根際土壤屬水平的細(xì)菌群落組成分析 由圖6可知，不同處理煙草根際土壤中，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、Vicinamibacteraceae為相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌屬。與CK相比，PI處理的土壤中Haliangium、Altererythrobacter、Vicinamibacteraceae相對(duì)豐度升高，芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬相對(duì)豐度降低；Tpb55處理的土壤中芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、Longimicrobiaceae相對(duì)豐度升高，F(xiàn)lavisolibacter、Altererythrobacter、Luteimonas相對(duì)豐度降低；PI+Tpb55處理的土壤中芽單胞菌屬、Vicinamibacteraceae、Haliangium相對(duì)豐度顯著升高，鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、溶桿菌屬顯著降低?？傮w而言印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55不同處理改變了煙草根際土壤中細(xì)菌群落組成。

2.3.5根際土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè) 根據(jù)不同處理煙草根際土壤細(xì)菌群落的OTUs豐度特征，利用PICRUSt2軟件預(yù)測(cè)細(xì)菌群落功能，與KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)、MetaCyc（MetabolicPathwaysFromallDomainsofLife）數(shù)據(jù)庫(kù)及COG（ClusterofOrthologousGroupsofproteins）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7所示。與CK相比，PI處理二級(jí)功能通路差異顯著的有9類(lèi)（plt;0.05，下同），以三羧酸循環(huán)（TCAcycle）、碳水化合物降解（Carbohydratedegradation）和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成（Secondarymetabolitebiosynthesis）為主；Tpb55處理二級(jí)功能通路差異顯著的有30類(lèi)，以氨基酸生物合成（Aminoacidbiosynthesis）、脂肪酸和脂質(zhì)生物合成（Fattyacidandlipidbiosynthesis）、碳水化物生物合成（Carbohydratebiosynthesis）、三羧酸循環(huán)（TCAcycle）及細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物合成（Cellstructurebiosynthesis）為主；PI+Tpb55處理二級(jí)功能通路差異顯著的有22類(lèi)，以氨基酸生物合成（Aminoacidbiosynthesis）、碳水化合物生物合成（Carbohydratebiosynthesis）、三羧酸循環(huán)（TCAcycle）及細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物合成（Cellstructurebiosynthesis）為主。與對(duì)照相比，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55處理后煙草根際土壤細(xì)菌群落的碳水化合物生物合成、氨基酸生物合成及細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物合成等功能基因豐度相對(duì)降低，而三羧酸循環(huán)、氨基酸降解（Aminoaciddegradation）、脂肪酸和脂質(zhì)生物合成、碳水化合物降解，以及胺和多胺生物合成（Amineandpolyaminebiosynthesis）等功能基因豐度相對(duì)提高。

3討論

本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55單獨(dú)處理均促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，增加地上/地下部分的干、鮮質(zhì)量，提高根際土壤中蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性，且兩種促生菌協(xié)同處理效果更加顯著。印度梨形孢可通過(guò)直接向根系運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也可以將不可用資源轉(zhuǎn)化為可用化合物提供給植物，促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收[23]?？莶菅挎邨U菌作為植物促生菌，在改善土壤環(huán)境、提高作物抗逆、促進(jìn)作物生長(zhǎng)等方面都有良好成效[24]。有研究表明，兩種有益微生物混用可能會(huì)產(chǎn)生較好的協(xié)同作用[25]。例如，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55混合接種時(shí)，土壤中蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性明顯提高，將土壤中復(fù)雜有機(jī)化合物降解為更易吸收的小分子，為煙草生長(zhǎng)提供足夠的碳、氮和磷素等營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，從而更好促進(jìn)煙草生長(zhǎng)。

有益微生物不僅能夠影響植物生長(zhǎng)，還能夠改變土壤中的微生物群落。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55處理均增加了煙草根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量、豐富度和多樣性，且協(xié)同使用的效果更加顯著，表明兩種促生菌提高了根際土壤細(xì)菌群落多樣性和功能多樣性，改善了土壤的生態(tài)功能，從而對(duì)煙草生長(zhǎng)起到了積極的作用[26]。一方面，微生物接種于土壤后，在植物根系表面和內(nèi)部定殖，并與根際土壤細(xì)菌之間競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和養(yǎng)分，必然會(huì)影響細(xì)菌群落的豐富度和多樣性[27]；另一方面，接種外源微生物后，影響了植物根系分泌物的產(chǎn)生，也導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落組成發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55處理后的煙草根際土壤與對(duì)照組土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群大致相同，但處理組中的芽單胞菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等相對(duì)豐度明顯升高，這與前人的研究結(jié)果基本一致[28-29]。

芽單胞菌門(mén)具有固氮、抑制病原菌、分解有機(jī)物等功能，能夠維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡和促進(jìn)植物生長(zhǎng)[30]，放線菌門(mén)可產(chǎn)抗生素、酶和有機(jī)酸等，其含量高低可作為土壤健康狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)[31]，鞘氨醇單胞菌屬可以穩(wěn)定土壤功能多樣性，改善植物生產(chǎn)力和健康[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55不同處理增加了上述有益微生物菌群的豐度，同時(shí)使煙草根際土壤細(xì)菌群落的氨基酸合成代謝通路豐度最高，為植物吸收更多的氨基酸提供了競(jìng)爭(zhēng)力[33]。此外，兩種促生菌還提高了煙草根際土壤細(xì)菌群落三羧酸循環(huán)、氨基酸降解、脂肪酸和脂質(zhì)生物合成、碳水化合物降解及胺和多胺生物合成等功能的基因豐度，特別是進(jìn)一步激發(fā)了細(xì)菌群落的三羧酸循環(huán)功能。

綜上所述，印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55不同處理改變了煙草根際土壤酶活性，也影響了根際土壤細(xì)菌群落的多樣性、組成、結(jié)構(gòu)和功能。再結(jié)合不同處理煙草的生長(zhǎng)指標(biāo)來(lái)看，兩種促生菌協(xié)同使用更顯著促進(jìn)了煙草生長(zhǎng)。本研究表明，兩種促生菌的使用改變了根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度，優(yōu)化了根際土壤細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)，增加了促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物種類(lèi)和豐度，激發(fā)了有利于有益微生物生長(zhǎng)的功能，這可能是促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的機(jī)制之一。后續(xù)將進(jìn)一步探索印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55協(xié)同作用機(jī)制，為有益微生物的復(fù)配提供理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

印度梨形孢和枯草芽孢桿菌Tpb55單獨(dú)或協(xié)同處理提高了煙草地上、地下部分的干、鮮質(zhì)量，增強(qiáng)了根際土壤蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性，促進(jìn)了煙草生長(zhǎng)，兩者協(xié)同使用效果更好。兩種促生菌不同處理豐富了根際土壤細(xì)菌多樣性，改變了細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)，提高了細(xì)菌群落三羧酸循環(huán)等功能基因豐度。