煙草品種對辣椒脈斑駁病毒的抗性鑒定

關(guān)鍵詞：辣椒脈斑駁病毒；毒株；抗病性；煙草品種

煙草是云南、四川、貴州等省的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）和馬鈴薯Y病毒（potatovirusY，PVY）是各煙區(qū)的優(yōu)勢病毒；番茄斑萎病毒（tomatospottedwiltvirus，TSWV）和煙草曲葉病毒（tomatoleafcurlvirus，TLCV）在西南煙區(qū)和華南煙區(qū)常有為害[1]。此外，辣椒脈斑駁病毒（chilliveinalmottlevirus，Chi-VMV）近年在西南煙區(qū)和黃淮煙區(qū)的為害顯著上升。

ChiVMV為馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）確定種，自然寄主有辣椒、番茄、煙草、曼陀羅、醉魚草、藜屬植物等，靠蚜蟲取食和汁液摩擦傳播[2]。在中國，ChiVMV最初在陜西線辣椒和海南黃燈籠椒上被報(bào)道[3-4]，烤煙上最初在云南被報(bào)道[5]，現(xiàn)已蔓延至四川、重慶、貴州等植煙?。ㄊ校6-10]，是需引起重視的病毒。K326、G28、云煙87、云煙85、紅花大金元等烤煙品種均不抗病[11]。

ChiVMV不僅在辣椒和煙草間相互傳播，且?guī)Ф局虚g寄主和傳毒蚜蟲數(shù)量多、分布廣，導(dǎo)致病害蔓延較快、防控較難。篩選抗病資源和培育抗病品種是防控病毒病最有效的措施。鑒于國內(nèi)尚無抗ChiVMV烤煙品種的報(bào)道，本文采用分子生物學(xué)檢測和苗期摩擦接種的方法，研究了四川涼山和云南保山煙草ChiVMV分離物毒株、病害癥狀和主栽品種抗病性，以期為篩選抗病資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試植物材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）、具翼煙草（N.alata）、粘煙草（N.glutinosa）、三生煙（N.tabacumSamsunnn）、三生煙NN（N.tabacumSamsunNN）、革新三號、G140、紅花大金元、G28、亮黃、鐵耙子、Ti245、VAM、CV91、云煙85、NC95、K326、NC89、云煙87、中煙100、云煙105、云煙116、TI1203、X45，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所和云南省煙草公司保山市公司。

1.2煙草ChiVMV分離物的純化與擴(kuò)繁保存

2022—2024年于云南保山和四川涼山煙田內(nèi)，采集褪綠黃化圓形亮斑和皰斑皺縮的ChiVMV病葉，接種在三生煙NN或CV91上[11-12]，9～14d摳取接種葉上的黃圓亮斑，經(jīng)二次純化后接種于本氏煙上，7～10d取斑駁卷縮的上部葉，制備接種物或?70℃保存。

1.3外殼蛋白擴(kuò)增與毒株鑒定

根據(jù)已報(bào)道的ChiVMV四川瀘州煙草分離物（MK405594.1）的外殼蛋白序列，設(shè)計(jì)ChiVMVCP引物（F：5′-GCCGGAGAGAGAGTGTTGA-3′；R：5′-TATTCCCCGAACGCCAGCAGA-3′），產(chǎn)物大小861bp。對云南保山隆陽和四川涼山鹽源的ChiVMV病葉，分別進(jìn)行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、凝膠回收、克隆及測序。將序列提交NCBI進(jìn)行BLAST同源比對[5-10]。

1.4育苗設(shè)置、接種液制備與接種培養(yǎng)

于防蟲日光溫室中播種育苗，3～4片真葉時(shí)，假植到直徑8cm小花盆內(nèi)或25孔聯(lián)體塑料盤內(nèi)，每品種重復(fù)45株以上，隨機(jī)擺放于培養(yǎng)架上或育苗畦內(nèi)。

取1.2所述本氏煙斑駁卷縮的上部病葉，在研缽中研磨后，經(jīng)紗布過濾，按1g病葉加20mL（0.01mol/L、pH7.0）磷酸緩沖液，制備接種液。置于冰盒上保持侵染力。

待煙苗5～6片真葉時(shí)，在上部展開葉上勻撒少許600目石英砂。一手托葉片，另一手用棉棒蘸取適量接種液，順葉脈方向輕輕摩擦上部兩片展開葉，每蘸取1次接種1株[13]。接種后噴灑清水，25～27℃培養(yǎng)21d后調(diào)查。

1.5病級劃分與病情調(diào)查

依據(jù)ChiVMV病害癥狀和發(fā)生過程，參考煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[2，14]，制定ChiVMV病害嚴(yán)重度級別（表1）。

1.6結(jié)果計(jì)算與抗性評價(jià)

依據(jù)公式（1）、（2）和（3）計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)（diseaseindex，DI）[13]和抗性指數(shù)（resistanceindex，RI）[15]。當(dāng)感病對照21d發(fā)病率達(dá)100%且病情指數(shù)DI0≥60時(shí)，采用病情指數(shù)DI評價(jià)待測煙草品種抗性，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：DI=0為免疫（HR），0lt;DI≤20為抗病（R），20lt;DI≤40為中抗（MR），40lt;DI≤60為中感（MS），60lt;DI≤80為感?。⊿），80lt;DI≤100為高感（HS）。當(dāng)感病對照21d發(fā)病率達(dá)100%，且病情指數(shù)40≤DI0lt;60時(shí)，采用抗性指數(shù)評價(jià)品種抗性，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：RIlt;?2為抗?。≧），?2≤RIlt;?1為中抗（MR），?1≤RIlt;?0.5為中感（MS），?0.5≤RIlt;0為感?。⊿），0≤RI為高感（HS）。感病對照21d發(fā)病率未達(dá)100%或發(fā)病率達(dá)100%但病情指數(shù)DI0lt;40時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果僅作輔助參考。

1.7抗病品種的檢測鑒定

同批次感病對照發(fā)病率達(dá)100%且病情指數(shù)達(dá)到40時(shí)，鑒定結(jié)果視為有效。對表現(xiàn)中抗以上級別的品種，重復(fù)鑒定2～3次，并于接種后10～14d取接種葉和上部系統(tǒng)侵染葉各1g，采用RT-PCR檢測病毒CP含量[7]。

2結(jié)果

2.1煙草感染ChiVMV的病癥及毒原純化保存

煙株感染ChiVMV后首先表現(xiàn)“褪綠黃化的圓形亮斑”，隨后病斑逐漸連片，呈現(xiàn)黃綠相間的斑駁花葉和皰斑皺縮。最后圓形亮斑連片、變褐枯死，葉脈變褐壞死。三生煙NN和CV91接種ChiVMV后9～14d出現(xiàn)褪綠黃化的圓斑時(shí)，摳取黃圓斑研磨為汁液后接種于本氏煙上。5～6葉期本氏煙接種后7～10d接種葉輕微下垂，系統(tǒng)侵染的心葉反卷皺縮，此時(shí)采集病葉冷凍保存（圖1）。

2.2煙草ChiVMV分離物的分子進(jìn)化

利用病毒外殼蛋白引物對云南保山和四川涼山的煙草ChiVMV病葉進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：ChiVMV病葉擴(kuò)增產(chǎn)物大小為861bp，與目的片段大小一致（圖2），該序列為CP基因編碼的287個(gè)氨基酸的外殼蛋白全長。提交NCBI序列比對顯示：涼山鹽源分離物與2022年貴州（OP589298.1）、2019年瀘州（MK405594.1）和2013年云南（JX088636.1）煙草分離物的序列一致性分別為97.60%、97.27%和81.40%。保山隆陽分離物與貴州、瀘州和云南煙草分離物的序列一致性分別為97.73%、97.40%和81.91%。

2.3煙草苗期接種ChiVMV的癥狀與品種抗性

在溫室內(nèi)，5～6葉期煙苗接種ChiVMV后其癥狀發(fā)展過程為：首先接種葉出現(xiàn)褪綠黃化，同時(shí)伴有黃化的圓形亮斑；隨后沿葉脈的黃化擴(kuò)展連片，整片葉表現(xiàn)黃化斑駁；最后黃圓亮斑變褐干枯，上部系統(tǒng)侵染葉出現(xiàn)黃化的圓形亮斑、黃化斑駁及皰斑皺縮（圖3）。

在供試的24份煙草種質(zhì)中，烤煙品種K326、NC89、中煙100、云煙87、G28、紅花大金元、云煙105、云煙116等，接種ChiVMV后表現(xiàn)不同程度感病。含N基因抗TMV的CV91、N.glutinosa和SamsunNN，以及攜帶va基因抗PVY的VAM，對ChiVMV均無顯著抗性。此外，野生煙N.alata和湄潭曬煙X45接種后出現(xiàn)輕微脈明和黃化斑駁，對ChiVMV分別表現(xiàn)中感和中抗（表2）。

2.4X45對ChiVMV的抗性檢測

對在苗期接種ChiVMV抗性鑒定中表現(xiàn)中抗的品種湄潭曬煙X45，以本氏煙和烤煙品種K326、G28等為感病對照，進(jìn)行重復(fù)鑒定，于接種后10～14d，取接種葉和系統(tǒng)侵染葉采用RT-PCR檢測外殼蛋白條帶，結(jié)果顯示：X45接種葉和系統(tǒng)侵染葉中存在病毒，但條帶亮度尤其是接種葉顯著弱于感病品種本氏煙和K326（圖4）。持續(xù)觀察至21～28d，X45部分植株系統(tǒng)侵染葉會出現(xiàn)ChiVMV的黃圓斑，但與感病品種相比，病程顯著遲緩，病癥顯著輕微。

3討論

ChiVMV是辣椒和煙草上的重要病毒種類之一，各國學(xué)者已在NCBI上發(fā)布多個(gè)分離物的核苷酸序列。亞洲區(qū)有印度、韓國和中國3個(gè)分支，且分支的地域性顯著[3]。2023年陳越等[10]依據(jù)CP序列的聚類分析表明，不同國家地區(qū)（意大利，印度，韓國，中國的云南、四川和貴州等）和寄主（辣椒、煙草、滇重樓、龍葵等）的52個(gè)ChiVMV分離物聚為3個(gè)類群（I、II、III），其中云南、貴州、四川分離物緊密聚集，顯示種群分化主要受地理分布影響，而非寄主種類。ChiVMV在煙草上不僅蔓延迅速，且種群遺傳分化差異顯著，2024年姜寧[16]報(bào)道ChiVMV在云南煙草上存在兩種癥狀類型，即輕花葉及卷葉癥狀的輕癥株系和黃圓斑及壞死皺縮的重癥株系。本文中保山隆陽和涼山鹽源煙草分離物序列與2022年貴州[10]和2019年瀘州[7]報(bào)道的煙草分離物同源性達(dá)97.27%～97.73%，序列一致性較高，均表現(xiàn)為褪綠黃化的圓形亮斑；而與2013年云南[6]報(bào)道的表現(xiàn)黃綠相間輕花葉及卷葉癥狀的煙草分離物同源性為81.40%～81.91%，序列一致性明顯偏低，顯示ChiVMV不同株系間存在癥狀和序列差異。文中采集的四川涼山鹽源和云南保山隆陽煙草ChiVMV室內(nèi)接種，均引起煙草葉片黃圓斑及壞死癥狀，與田間采集癥狀相符；亦與已報(bào)道的云南[16]、四川瀘州[7]和貴州黔西南[10]煙草分離物在烤煙生長中后期引起葉片黃圓斑及壞死癥狀的重癥株系相同（圖1），未采集檢測到云南煙草上引起葉片黃綠相間輕花葉及卷葉癥狀的輕癥株系。

篩選抗病資源和選育抗病品種是克服ChiVMV對煙草為害的最有效方法。已有研究表明：植物對Potyvirus病毒的大部分隱形抗病基因?yàn)閑IF4E家族的等位基因，eIF4E少數(shù)關(guān)鍵位點(diǎn)變異使其編碼蛋白功能喪失或以病毒VPg無法識別的方式存在，導(dǎo)致病毒不能復(fù)制[17]。

國內(nèi)外尚無抗ChiVMV煙草種質(zhì)的報(bào)道。品種抗性鑒定表明，VaVa/nn型感PVY/感TMV品種（K326、云煙85、云煙87、紅花大金元）和vava/nn型抗PVY/感TMV品種（NC55、NC102、TN86、TN90），均高感ChiVMV[11]。這與本研究中K326、云煙85、云煙87、紅花大金元、VAM對ChiVMV表現(xiàn)感病的結(jié)果一致（表1）。有研究顯示，N基因通過水楊酸信號誘導(dǎo)了超敏反應(yīng)，增強(qiáng)了植物對ChiVMV的系統(tǒng)抗性：SamsunNN在接種后5d表現(xiàn)出較高的敏感性，而PetiteHavanaSR1nn在20d表現(xiàn)出較高的敏感性[18]。本研究中N基因型品種CV91和SamsunNN表現(xiàn)感病，Samsunnn亦表現(xiàn)感病，但未進(jìn)行敏感性的定量差異檢測。此外，湄潭曬煙X45接種ChiVMV后表現(xiàn)中抗，RT-PCR檢測顯示接種葉和系統(tǒng)葉中有病毒，但含量顯著弱于感病品種本氏煙和K326（圖4），其抗性機(jī)制尚需研究。

在煙草苗期接種病毒的試驗(yàn)中，病毒株系、寄主苗齡、培養(yǎng)溫度、接種壓力等諸多因素，均會影響病害癥狀[19]，不同的試驗(yàn)材料和抗病性鑒定方法，可能對同一品種的抗性得出有差異的評價(jià)[3，15]。在煙草品種抗病性鑒定中通常設(shè)置感病對照，且其病情指數(shù)達(dá)到60時(shí)的鑒定結(jié)果視為有效[13]。而在不同批次的ChiVMV接種鑒定中，存在接種后14～21d感病對照發(fā)病率100%；但病害嚴(yán)重度不高且持續(xù)培養(yǎng)亦不會升高，導(dǎo)致病情指數(shù)略小于60的情況。對于這類數(shù)據(jù)，本文引入抗性指數(shù)進(jìn)行評價(jià)，系統(tǒng)表述了煙草品種對ChiVMV的抗病性鑒定方法，并篩選到中抗品種湄潭曬煙X45，研究結(jié)果有助于抗病資源的鑒定和應(yīng)用。

4結(jié)論

ChiVMV是云南和四川煙草的主要病毒種類之一，其侵染煙草的典型癥狀為葉片上出現(xiàn)褪綠黃化的圓形亮斑，近年在西南煙區(qū)和黃淮煙區(qū)的為害顯著上升。ChiVMV種群分化的地域特征明顯，表現(xiàn)黃圓斑癥狀的云南、四川、貴州煙草分離物的序列相似度較高。主栽烤煙品種對ChiVMV均無明顯抗性，湄潭曬煙X45中抗ChiVMV，可推薦作為抗病育種的重要資源。