丁香酚誘導煙草抗青枯病的效果及促生作用

關鍵詞：丁香酚；煙草；青枯??；誘導抗性；酶活性

煙草青枯病是一種由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的細菌性病害，是煙草種植過程中的主要病害之一[1-2]。其初侵染源主要是病殘組織和土壤，種植過程中的各項農業(yè)操作均可能導致煙株根系受損，使病菌從根部傷口進行侵染。青枯雷爾氏菌侵染煙草后，會沿根系向上，進入到根系皮層細胞或薄壁組織，通過分泌細胞壁降解酶破壞植物細胞壁，再侵入到維管束組織，在其中增殖并分泌大量胞外多糖，進而阻塞和破壞寄主維管系統(tǒng)影響水分運輸，致使寄主枯萎和死亡[3]。傳統(tǒng)的以化學農藥為主的防治方式存在農藥殘留、有害物質積累等問題，因此，需要尋找對環(huán)境友好的土傳病害防治方式。

丁香酚是從植物中提取的一種有機酚，該物質低毒[4]、無殘留，對環(huán)境友好。丁香油的主要成分丁香酚，對玉米大斑、葡萄炭疽、番茄黑霉等植物常見病原菌存在較為明顯的抑制效果[5]，而且能夠破壞真菌細胞完整性、抑制真菌細胞能量代謝以及影響真菌轉錄水平，從而有效抑制三七根腐病菌，并提高鮮三七貯藏過程中的品質[6]。Bowers等[7]發(fā)現(xiàn)，丁香油與其他植物提取精油復配后，加入到接種有含煙草疫霉孢子的土壤中，處理21d后，煙草疫霉的種群數量減少98.4%，有效抑制煙草病害。余帥[8]通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，丁香精油（主要成分為丁香酚）對青枯菌等5種細菌具有明顯的抑菌效果。但目前僅有丁香酚對青枯菌的體外抑菌試驗，其對煙草本身的影響，以及對煙草青枯病的防控作用和防病機制尚不明確。本研究擬通過測定施加丁香酚與否的盆栽煙草的青枯病發(fā)病率、農藝性狀及防御相關物質和酶活性變化，探討丁香酚對煙草青枯病的防治效果和防控機理。

1材料與方法

1.1供試藥劑與儀器

丁香酚（純度≥99%），購自上海麥克林生化科技有限公司；DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；甲醇、無水乙醇、H2SO4均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；PBS、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TTC購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

恒溫箱（PYX-DHS500）購自中國上海躍進醫(yī)療器械廠；BIORADimark酶標儀購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；組合式高速振蕩培養(yǎng)箱ZQPZ-115S購自中國天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.2煙草品種

供試品種云煙87，由湖北省煙草科學研究院提供。

1.3試驗方法

1.3.1試驗菌株分離 取青枯病發(fā)病煙苗莖部0.5g，在無菌條件下制備為細菌密度為1×10?1的菌懸液，依次稀釋成1×10?2、1×10?3、1×10?4的菌懸液，吸取合適稀釋度的樣品100μL注入NA固體培養(yǎng)基平皿涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1d，重復3次。取單一菌落劃線分離、培養(yǎng)，將菌落形態(tài)相似且出現(xiàn)頻率多的微生物作為試驗菌種進行分離純化。

1.3.2試驗菌株鑒定 按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒方法提取細菌DNA，利用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），對藥物中分離菌落的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系為模板DNA1μL，正反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶Mix25μL，補充ddH2O至50μL。反應程序為95℃5min;95℃30s，53℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃10min。擴增產物由生工生物科技（上海）有限責任公司測序。將測序結果在NCBI網站上使用Blast進行同源性比較，下載同源性較高的序列采用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining方法，1000次Bootstrap檢驗后構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3試驗濃度確定 用少量無水乙醇溶解丁香酚再用0.3%吐溫?20的水溶液稀釋，配制成有效濃度為1、5、10μL/mL三種不同濃度的溶液，取每種溶液10mL，對煙苗進行灌根處理，以清水為對照。將煙苗放置在人工氣候箱（溫度25℃，濕度65%，光照14h/d）培養(yǎng)2d后，拍照并記錄煙苗生長狀況，確定適宜的濃度用于下一步試驗。

1.3.4盆栽誘抗效果評價 參考劉蕾等[9]方法稍加修改。用1μL/mL丁香酚對生長一致的“三葉一心”煙苗進行灌根處理，每株灌根10mL，以清水為對照，每處理重復6次。在灌根后第3天向煙苗根部加入青枯雷爾氏菌發(fā)酵液10mL，菌含量1×108CFU/mL，然后將煙苗放置在人工氣候箱（溫濕度、光照周期同1.3.3）培養(yǎng)15d，每5天記錄發(fā)病情況，按照公式（1）和（2）計算病情指數和相對防效[10]，標準參考GB/T23222—2008[11]。

其中DI是病情指數，G是發(fā)病煙株病情級別，D是G級別的發(fā)病煙株數目，T是煙株的總數目；CE是生防效果，DICK是對照組病情指數，DIT是處理組病情指數。

1.3.5農藝性狀測定 施加丁香酚15d后，測量煙苗的葉長、葉寬、株高和莖圍，標準參考YC/T142—2010[12]。

1.3.6生理生化指標測定 煙草處理方法同1.3.4。分別取灌根后0、15d的煙草葉片用于測定光合色素含量，根系用于測定根系活力；取灌根后0、5、10、15d的葉片測定其余生理生化指標。

葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量參照劉嫻等[13]方法測定；根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[14]；葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、硝酸還原酶酶（NR）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、MDA和H2O2含量均采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒進行測定。

1.4數據處理

使用Excel2016軟件整理數據，使用DPS9.01軟件分析數據，LSD（最小顯著性差異）多重比較法（plt;0.05）進行數據方差分析，使用Origin2021軟件作圖。

2結果

2.1試驗菌種分子生物學鑒定

將純化目標菌的16SrDNA序列在NCBI中進行BLAST比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示與Ralstoniasolanacearum（Genbankaccessionnumber：ON247041.1）聚為一支，自展值達到99（圖1），確認目標菌株為青枯雷爾氏菌，命名為R.solanacearumLF-17（Genbankaccessionnumber：PP868-626）。

2.2試驗濃度確定

清水和3種不同濃度丁香酚溶液處理后，煙苗生長情況如圖2所示。清水處理和1μL/mL丁香酚處理后的煙苗差別不大，5μL/mL丁香酚處理后的煙苗莖部出現(xiàn)損傷，10μL/mL的丁香酚處理后煙苗除莖部外，葉片也略有損傷。綜上，確定灌根時所用丁香酚濃度為1μL/mL。

2.31μL/mL丁香酚對煙草青枯病的防效

盆栽結果顯示，1μL/mL丁香酚處理可以顯著降低煙草青枯病的病情指數（圖3），在接種青枯雷爾氏菌后的第5、10、15天，處理組的病情指數分別為1.66、22.37和40.09，顯著低于CK組的10.98、62.31和86.15，相對防效分別達84.87%、64.10%和53.46%。

2.4丁香酚對煙草農藝性狀的影響

施加丁香酚15d后，煙苗葉長、葉寬、株高、莖圍較CK組均有提升，分別增加48.80%、35.06%、22.44%、8.98%（表1），說明丁香酚可以促進煙草的生長。

2.5丁香酚對煙草葉片光合色素的影響

CK組與丁香酚處理組的葉片光合色素含量變化如圖4所示。施加丁香酚15d后，處理組的葉片光合色素含量均顯著高于CK組。其中處理組葉綠素a含量為2.59mg/g，較CK組提高48.06%；葉綠素b含量為1.56mg/g，較CK組提高47.17%；類胡蘿卜素含量為0.47mg/g，較CK組提高77.87%。

2.6丁香酚對煙草根系活力和硝酸還原酶活性的影響

丁香酚處理15d后，煙株根系活力值為277.43μg/（g·h），較CK組提高49.25%。NR酶活性在處理過程中呈不斷上升趨勢，且在15d時達最大值1.99U/g，相較于CK組顯著提高65.42%（圖5）。

2.7丁香酚對煙草抗逆相關酶活性、MDA和H2O2含量的影響

施加丁香酚后，POD、SOD、PPO和PAL的酶活性隨著處理時間延長呈不斷上升趨勢，且均顯著高于CK組。在15d時各酶的活性達到最大值，POD活性為25.99U/（g·min），高出CK組123.44%；SOD活性值為8.53U/（g·min），高出CK組46.89%；PPO活性值為1.00U/（g·min），高出CK組104.20%；PAL含量為11922mg/（g·h），高出CK組46.89%。

MDA和H2O2的含量在丁香酚處理過程中也呈現(xiàn)上升的趨勢，但均顯著低于CK組。在15d時處理組的MDA含量為1.51μmol/g，較CK組降低30.43%；H2O2含量為0.84μg/g，較CK組降低55.58%（圖6）。

3討論

丁香酚具有抗癌、抗炎、抗病毒等作用，還對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等細菌以及鏈格孢菌、灰霉菌等真菌具有廣譜且較強抑制作用[15]。林勇等[16]從常見中藥材中發(fā)現(xiàn)丁香提取液對青枯雷爾氏菌有明顯的抑菌效果，通過GC-MS鑒定其有效抑菌成分為丁香酚。本研究結果也表明，丁香酚對煙草青枯病具有良好的防控作用，1μL/mL的丁香酚灌根處理能顯著降低青枯病的病情指數，防效達53.46%。

植物光合色素主要包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素，是植物葉片光合作用的物質基礎，其含量高低能反映植物的生長狀況和葉片光合能力[17]。本研究中施加丁香酚后煙葉的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量均顯著增加，說明丁香酚可以通過提高光合色素含量來增強葉片對光能的利用效率，從而促進煙草的生長發(fā)育。

根系活力是植株根系生理活性強弱的直接表征[18]；NR是植物體內硝態(tài)氮還原的限速酶，其活性會影響煙草的氮代謝能力，而根是吸收硝態(tài)氮的主要器官，根吸收的硝態(tài)氮通過NR轉化為亞硝態(tài)氮供給植物生長[19]。本研究表明，丁香酚可以提高煙草的根系活力和NR活性，促進煙株根系發(fā)育。

當青枯雷爾氏菌侵染煙草時，煙草體內活性氧和自由基的合成與分解平衡被打破，活性氧和自由基在煙草細胞內累積[20]。H2O2是一種活性氧分子，對植物體同時具有保護和毒害的雙重作用，低濃度時可以作為信號分子參與植物脅迫響應，而當植物細胞內H2O2濃度較高時則會對細胞產生毒害作用，會氧化細胞膜，對細胞膜造成損害，氧化的最終產物為MDA[21]。有研究報道丁香酚具有氧自由基的清除作用[22]，本研究也發(fā)現(xiàn)施加丁香酚后，可以提高煙草抗氧化相關酶POD和SOD的活性，減少煙草細胞內H2O2和MDA的含量，消除煙草在青枯雷爾氏菌侵染壓力下產生的過量自由基和活性氧，有效保護細胞膜，提高植物的抗氧化能力。

PPO和PAL是植物體內重要的防御酶，酚類物質經PPO氧化為醌類而發(fā)揮抗菌作用[23]。PAL是苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶，它催化苯丙氨酸轉化為肉桂酸，然后在其它酶的作用下轉化為香豆素類、黃酮類和木質素等次生產物，這些產物在抵抗病原體和植食性昆蟲的侵害方面具有重要的作用[24]。本研究中煙草葉片的PPO和PAL活性在施加丁香酚后均顯著提高，這與臍橙經丁香提取液處理后的結果相似[25]，表明丁香酚能夠明顯誘導煙草對青枯雷爾氏菌的抗性。

4結論

使用濃度為1μL/mL丁香酚處理煙草3d后接種煙草青枯菌，接種15d時對煙草青枯病的防效達53.46%。丁香酚處理通過提高煙株葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量來促進光合作用，通過提高根系活力和NR活性來促進根系發(fā)育，進而促進煙草的生長，可以誘導煙草對青枯雷爾氏菌的抗性，提高煙草POD、SOD、PPO和PAL的活性并降低MDA和H2O2的含量。