玉米ZmIMPα基因的生物信息學(xué)分析及其在鹽脅迫下的表達模式分析

關(guān)鍵詞：玉米；IMPα基因；生物信息學(xué)分析；鹽脅迫；原核表達載體；表達模式

中圖分類號：S153：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0001-10

土壤鹽堿化對植物生長發(fā)育造成嚴重影響，一般土壤含鹽量在0.2%～0.5%時對植物生長已經(jīng)不利，嚴重時導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量大幅下降，對全球糧食安全構(gòu)成威脅。根據(jù)全國第二次和第三次土壤普查數(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國土地包含有各類鹽堿地約9900萬公頃，約是世界鹽堿地面積的10%，目前還有蔓延趨勢，預(yù)計到2050年全球有50%的耕地面積面臨鹽堿化問題。但同時鹽堿地又是一種重要的土地資源，隨著對農(nóng)作物耐鹽新品種的培育和對鹽堿地的治理與改良，鹽堿地中可耕地面積逐漸增加。

核轉(zhuǎn)運蛋白（KAP）超家族由輸入蛋白α（im-portin α）家族和輸入蛋白p（importin β）家族組成，是一類廣泛分布于真核生物、結(jié)構(gòu)相對保守的蛋白。輸入蛋白α和β在細胞內(nèi)共同起作用，將核糖體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、RNA剪接因子、DNA修復(fù)因子和病毒衣殼蛋白等通過核孔復(fù)合體運輸?shù)胶藘?nèi)。輸入蛋白α家族主要由3個保守結(jié)構(gòu)域組成，其中，IBB結(jié)構(gòu)域能與import-in β亞基結(jié)合；ARM結(jié)構(gòu)域由10個串聯(lián)重復(fù)序列組成，能與含有核定位信號（NLS）的蛋白質(zhì)結(jié)合，把“貨物”蛋白運往核內(nèi)，而在這個過程中，GTP酶Ran被水解為RanGDP，為復(fù)合物的運輸提供了能量；第三個結(jié)構(gòu)域為C-端保守結(jié)構(gòu)域，與核內(nèi)輸出蛋白CAS相結(jié)合，使輸入蛋白α運往胞質(zhì)，重新進行下一輪的運輸。輸入蛋白α除了與輸入蛋白β共同運輸?shù)鞍淄?，也可以單獨運輸?shù)鞍?，例如運輸鈣調(diào)蛋白激酶Ⅳ或人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的Vpr蛋白；或者作為核輸入的負調(diào)節(jié)劑，例如Snail蛋白可與輸入蛋白β1結(jié)合，但輸入蛋白α也可與Snail蛋白結(jié)合，從而形成了競爭，降低運輸速度，最終負調(diào)控轉(zhuǎn)運復(fù)合物的形成。

輸入蛋白α在動物生理和病理活動中扮演著重要角色。IMPα1自身的IBB結(jié)構(gòu)域可以與ARM結(jié)構(gòu)域結(jié)合，精確且定向控制著蛋白的核運輸，因此其表達水平被認為是一種腫瘤細胞的標志物。輸入蛋白也與外來蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至宿主有關(guān)，有研究表明委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒衣殼蛋白的核定位信號通過與importinα結(jié)合轉(zhuǎn)運至細胞核中，在核內(nèi)完成組裝后感染宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

植物中輸入蛋白α也參與多種生理生化過程。孫瑩研究發(fā)現(xiàn)StCRK2與Stlmportinα2存在互作關(guān)系，推測Stlmportin α2很可能參與了馬鈴薯中水楊酸介導(dǎo)的抗病防御途徑：張敬奧研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥核轉(zhuǎn)運蛋白AtIMPα通過影響SA、JA通路以及質(zhì)外體胼胝質(zhì)積累來介導(dǎo)擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種的抗性：彭湘君的研究通過沉默輸入蛋白α3，導(dǎo)致番茄果實葉綠素降解加快和乙烯合成加速，并發(fā)現(xiàn)輸入蛋白α3通過調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、色素代謝等途徑介導(dǎo)番茄果實成熟衰老進程；Wang等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥維持細胞壁完整性的蛋白SWO1與IMPα1和IMPα2之間存在相互作用，IMPal和IMPα2雙突變體植株根系生長受到抑制且植株對鹽脅迫更加敏感。

玉米（Zeamays）是重要的糧食作物，屬于中度耐鹽植物，土壤鹽堿化是造成其減產(chǎn)的主要因素之一。目前玉米KAP超家族基因中只有一個成員（importin-1）的功能被鑒定：Opaque2（O2）是一種重要的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，在玉米籽粒發(fā)育中可以促進蛋白的生物合成，importin -1可與其相互作用從而增加Opaque2的核定位能力。關(guān)于玉米KAP超家族其他基因的功能仍然未知。本試驗對玉米輸入蛋白α家族基因進行生物信息學(xué)分析，并克隆了一個玉米輸入蛋白α基因ZmIMPα，通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析其在鹽脅迫環(huán)境下的表達模式，同時構(gòu)建pET28a-ZmIMPα重組大腸桿菌菌株，分析菌株在鹽脅迫下的生長情況，以期深入探究ZmIMPα在玉米響應(yīng)鹽脅迫中的作用，并為深入研究輸入蛋白α家族基因的功能提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試玉米自交系B73、鹽敏感材料齊319和耐鹽材料81162種子由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米分子育種實驗室提供，試驗中用到的大腸桿菌DH5α菌株、BL21菌株和質(zhì)粒pCE2、pET28a也均由該分子育種實驗室提供。

試驗于2023年4—6月開展。選取飽滿的各品系玉米種子，經(jīng)過2%次氯酸鈉消毒并于常溫下泡發(fā)，將萌發(fā)后的種子種植在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米分子育種實驗室的培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為（25±2）℃，光照強度8000lx，16h光照、8h黑暗，空氣濕度70%。

1.2試驗所用引物

引物使用Primer Premier 5軟件設(shè)計，由擎科生物公司合成。引物序列如表1所示。

1.3試驗方法

1.3.1玉米IMPa基因家族的生物信息學(xué)分析通過NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov）、EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫（https：//plants.ensem-bl.org/index.html）下載玉米及擬南芥、小麥、高粱、水稻和二穗短柄草的全部蛋白序列、基因組注釋文件和全部DNA序列等。擬南芥的輸入蛋白α序列使用文獻中已確定的9個序列，ZmIMPα（PF16186、PF01749、PF00514）數(shù)據(jù)模型通過Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）下載；其余物種的輸入蛋白分別利用Blastp和HMM search查找（閾值設(shè)置為Elt;10^-5），將兩者的查找結(jié)果結(jié)合起來，通過基因注釋篩選最終序列。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析玉米IMPa編碼蛋白分子量、等電點；利用Plant-mPLoc（http：／／www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行亞細胞定位預(yù)測：利用MEGA 11中鄰接法構(gòu)建序列進化樹，并利用iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）進行美化；利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）分析序列保守基序，查找基序數(shù)量為10;利用NCBI中Batch-CD search分析序列保守結(jié)構(gòu)域信息。利用TBtools中Biosequence structure illustrator功能完成可視化。利用TBtools得到所有IMPα基因啟動子序列，提交PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件分析并利用TBtools進行可視化。

1.3.2 ZmIMPa基因在鹽脅迫后的表達分析 在三葉一心期時，利用200mmol/L NaCl 70 mL對齊319和81162幼苗進行灌根處理，分別在處理0、12、24、36h后取樣，放人盛有液氮的研缽中冷凍研磨。使用諾唯贊RNA提取試劑盒提取RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以玉米actin1為內(nèi)參，參考文獻[21]的方法，使用儀器Rotor-GeneQ采用三步法進行熒光定量PCR。PCR體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 1μL，ddH₂O 8.2μL。PCR程序：95℃10 min；95℃10 s，55℃30 s，72℃30s，40個循環(huán)。采用2-^-ΔΔCt相對定量法計算基因表達量，使用DPS軟件進行數(shù)據(jù)差異性分析。

1.3.3 ZmIMPα基因的克隆 取三葉一心期的B73幼苗葉片，按1.3.2中的方法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的該基因（GenBank登錄號NC_050103.1）的CDS序列設(shè)計特異性引物（表1），以cDNA為模板進行體外擴增。擴增體系：2x Phanta Max Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，cDNA 1μL，ddH2O 20μL。PCR程序：95℃3 min；95℃15s，56℃15s，72℃48 s，35個循環(huán)；72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收，產(chǎn)物連接中間載體pCE2并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，隨后進行菌液PCR驗證及陽性克隆測序。

1.3.4原核表達載體pET28a-ZmIMPα的構(gòu)建 利用快切酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pET28a，以1.3.3中構(gòu)建的pCE2-ZmIMPa為模板，利用表1中一步克隆引物進行擴增并回收，通過一步克隆將回收產(chǎn)物連接至pET28a（pET28a 8L，回收產(chǎn)物1μ，Sx Ce Buffer 4μL，Exnase 2μL，ddH205μL），轉(zhuǎn)化BL21菌株并進行菌液PCR驗證。提取陽性克隆質(zhì)粒進行雙酶切驗證，驗證體系包括質(zhì)粒8μL、Xba Ⅰ1 μL、Sac Ⅰ lμL、10×buffer 2μL、無菌水8μL。

1.3.5 pET28a-ZmIMPα重組菌株BL21的鹽脅迫處理 分別配制含有0.6 mol/L和0.8mol/LNaCl的LB液體培養(yǎng)基，接種重組菌株和僅含有空載質(zhì)粒的菌株，待菌液OD600值為0.6～0.8時加入100mmol/L IPTG 100μL，過夜培養(yǎng)，以誘導(dǎo)蛋白表達；次日，在37℃搖床上以200r/min振蕩培養(yǎng)，每小時測定一次吸光度，共測定12h。使用Microsoft Excel 2021進行數(shù)據(jù)整理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1玉米IMPα基因家族生物信息學(xué)分析

2.1.1玉米IMPα家族基因鑒定 由表2可見，從玉米中鑒定出7個IMPa基因共15個轉(zhuǎn)錄本，其編碼蛋白的序列長度為297～625aa，分子量在32.5～64.0kDa之間，等電點（pl）為3.95～7.27。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，有10個IMPα蛋白同時在細胞質(zhì)和細胞核中定位到，其余5個僅定位在細胞質(zhì)中，這與輸入蛋白α的功能相符，即定位在細胞質(zhì)和細胞核的輸入蛋白α能與帶核輸入信號的“貨物蛋白”和輸入蛋白β相結(jié)合形成復(fù)合物，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)到細胞核的運輸：而只定位在細胞質(zhì)中的輸入蛋白α則僅通過與細胞質(zhì)中的其他蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮功能。

其中，Zm00001eb001150_TO01基因與其他IMPα基因不同，不屬于SPR1超家族，但其基因注釋標識為Importin subunit alpha-5，因此也將其歸類為輸入蛋白α家族成員之一。

2.1.2玉米IMPa家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析與序列比對 本研究分別從玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodium dis-tachyon）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定到7、13、5、4、5個和9個IMPα家族基因，分別有15、17、8、6、5個和9個轉(zhuǎn)錄本。利用鄰接法構(gòu)建其蛋白序列的系統(tǒng)進化樹（圖1），可以看出除Zm00001eb001150_T001單獨聚在一個分支外，其余IMPα蛋白被分為3個亞家族，這與前人的研究相符，即IMPα家族根據(jù)其主要氨基酸相似性可分為3個亞家族。3個亞家族中，最大的亞家族包含34個蛋白，而最小的亞家族僅有10個蛋白，6個物種的IMPα蛋白在各個亞家族中都有分布：玉米和擬南芥的IMPα蛋白主要集中在最大的亞家族內(nèi)，它們之間的相似性較高。其中，與本研究目的基因ZmIMPα（Zm0000leb346120_ T002）處于同一分支的成員里，擬南芥和小麥的相關(guān)基因最為豐富，尤其與Zm00001eb282820_T001、EES19061.1、XP_044460332.1、XP_044390729.1關(guān)系較近，它們可能具有相似的功能。通過DNAMAN比對部分序列，結(jié)果如圖2所示，其中紅色框為IMPa蛋白IBB結(jié)構(gòu)域的3個保守基序，具有結(jié)合核定位信號的功能。

2.1.3保守基序與保守結(jié)構(gòu)域分析 通過MEME網(wǎng)站獲得玉米IMPα家族蛋白序列的保守基序，基序查找設(shè)置為10，結(jié)合NCBI中得到的序列保守結(jié)構(gòu)域信息，利用TBtools中的Gene Struc-ture View進行可視化分析，結(jié)果（圖3）顯示，玉米IMPα家族蛋白之間保守基序差異不大，不同基因之間至少有2個保守基序相同，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的擬南芥IMPα基因家族在結(jié)構(gòu)和功能上都比較保守相一致。Motif 3和Motif 5分別位于N端和C端，可能分別是輸入蛋白α與輸入蛋白β結(jié)合的位點或結(jié)合CAS蛋白運出細胞核進行下一輪運輸?shù)奈稽c。

2.1.4啟動子順式作用元件分析 通過對玉米gff3文件提取得到所有IMPα基因的啟動子序列，用PlantCare分析發(fā)現(xiàn)，共有35種順式作用元件，包括赤霉素和脫落酸等植物激素響應(yīng)元件、低溫等非生物脅迫響應(yīng)元件、水楊酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、參與防御和壓力反應(yīng)的作用元件以及與分生組織表達相關(guān)的元件等，預(yù)示著這些IMPα基因可能在玉米逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。挑選其中有功能注釋的元件進行可視化分析，結(jié)果見表3和圖4。

2.2鹽脅迫下ZmIMPα基因的表達分析

用200 mmol/L NaCl處理三葉一心期玉米植株后，ZmIMPα在耐鹽材料81162中的表達量顯著上升，在脅迫24h達到最大值，為處理0h的1.79倍；而在鹽敏感材料齊319中，鹽脅迫后ZmIMPα的表達量顯著下降（圖5）。說明該基因在玉米中的表達受到鹽脅迫的顯著調(diào)控，而且在耐鹽材料中上調(diào)表達，在鹽敏感材料中下調(diào)表達。

2.3轉(zhuǎn)ZmIMPα基因大腸桿菌在鹽脅迫下的生長情況分析

2.3.1 ZmIMPα基因的克隆與鑒定 提取的玉米葉片RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可以清楚地看到3個條帶且RNA完整性較好（圖6A）。ZmIMPα基因的擴增結(jié)果如圖6B所示，該基因CDS全長1590 bp；由于引物采用M13 Primer Mix，菌液PCR的最終產(chǎn)物長度應(yīng)為1750 bp左右，由圖6C可見確實擴增得到1750 bp的條帶，而且其測序結(jié)果（圖7）也表明與NCBI公布的序列相似性為100%，證明準確克隆到ZmIMPα基因。

2.3.2重組載體pET28a-ZmIMPα的構(gòu)建 目的基因ZmIMPα連接pET28a后的菌液PCR結(jié)果如圖8A所示，重組質(zhì)粒pET28a-ZmIMPα的雙酶切（XbaⅠ、Sac Ⅰ）驗證結(jié)果如圖8B所示，證明目的基因已連接至原核表達載體。

2.3.3鹽脅迫下重組大腸桿菌的生長情況 將pET28a-ZmMPα重組菌株和pET28a空載菌株接種至分別含0.6 mol/L和0.8 mol/L NaCl的LB液體培養(yǎng)基上，于12h內(nèi)每小時測一次OD600值，繪制生長曲線，結(jié)果（圖9）顯示，在鹽脅迫下，含有空載質(zhì)粒的菌株能夠在含兩種濃度NaCl的培養(yǎng)基上正常生長，而含有重組質(zhì)粒pET28a-ZmIMPα的菌株生長速度受到明顯抑制，推測ZmIMPα可能在玉米耐鹽響應(yīng)時具有負調(diào)控作用。

3討論與結(jié)論

核膜將細胞質(zhì)與細胞核分成兩個功能區(qū)域，保障了生命活動準確有序的進行。輸入蛋白α、β運送帶有核定位信號的“貨物”通過核孔復(fù)合體進入細胞核，從而完成信息交流。目前發(fā)現(xiàn)的輸入蛋白α的生物學(xué)功能主要是在抗病方面：研究發(fā)現(xiàn)核質(zhì)運輸特別是蛋白質(zhì)輸入在植物先天免疫中發(fā)揮重要作用；水稻OsWRKY62、Os-WRKY76和稻瘟病菌效應(yīng)子通過新型核定位信號與OsIMala相關(guān)聯(lián)后被運輸至細胞核，以負調(diào)節(jié)防御反應(yīng)；擬南芥中，IMPA2是立枯絲核菌的非宿主抗性基因，能夠喚起水楊酸途徑（SA）介導(dǎo)的早期免疫田；擬南芥AtIMPA接種丁香假單胞桿菌（PstDC3000）后，AtIMPα突變體中茉莉酸甲酯途徑和水楊酸途徑的合成相關(guān)基因表達受到抑制，外源MeJA處理下突變體根長較野生型受到更明顯抑制，推測輸入蛋白α可能參與到植物生長發(fā)育以及水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的抗病途徑中。輸入蛋白β被報道參與擬南芥非生物脅迫，例如擬南芥AtKPNB1基因，作為擬南芥importin β1的同源物，在ABA信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，其無效突變增加了子葉發(fā)育過程中對脫落酸（ABA）的敏感性，而其失活顯著增強植株耐旱性；SAD2是一種輸入蛋白β家族蛋白，擬南芥sad2突變體比野生型更耐受UV-B輻射。但關(guān)于輸入蛋白α參與非生物脅迫的研究報道較少，因此對其進行研究有助于深入了解輸入蛋白家族功能機制。

本研究從玉米中鑒定出7個輸入蛋白α家族基因，共15個轉(zhuǎn)錄本，并對其進行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，這些基因編碼蛋白的序列長度為297～625aa，分子量在32.5～64.0 kDa之間，等電點在3.95～7.27之間，其中10個蛋白同時在細胞質(zhì)和細胞核中定位到，其余5個蛋白僅在細胞質(zhì)中定位到。另外，利用玉米、擬南芥、小麥、水稻、高粱、二穗短柄草的IMPα家族成員進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明，不同物種的IMPα家族基因數(shù)目不同，可能是因為IMPα基因在不同物種中的進化程度不同；除2m00001eb001150_T001單獨聚在一個分支外，其余ZmIMPα蛋白被分為3個亞家族，主要與擬南芥和小麥的IMPα蛋白聚在一起。啟動子區(qū)順式作用元件的分析結(jié)果顯示，在玉米IMPα基因啟動子區(qū)含有多種與激素響應(yīng)、器官特異性、干旱和低溫等非生物脅迫響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件，推測其可能在玉米激素和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

有研究報道，擬南芥SWO1基因突變體在鹽脅迫下根伸長受到抑制，而SW01蛋白的核轉(zhuǎn)運需要IMPA1和IMPA2，因此impa1和impa2雙突變體在鹽脅迫下根的生長也受到了抑制。本研究成功克隆出一個ZmIMPα基因，熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，鹽脅迫下，ZmIMPα基因在耐鹽玉米中表達量顯著上升，在鹽敏感玉米中幾乎不表達；構(gòu)建其原核表達重組菌株，在含NaCl的培養(yǎng)基中生長受到明顯抑制。因此推測ZmIMPα可能在玉米幼苗響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮負調(diào)控作用。

輸入蛋白具有運輸?shù)鞍?、維持蛋白穩(wěn)定性的功能，結(jié)合本試驗經(jīng)驗，推測通過找到ZmIMPα的互作蛋白，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)來探索ZmIMPα在鹽脅迫下的功能可能是一種有效方法。目前關(guān)于擬南芥輸入蛋白α/β在植物激素途徑中調(diào)節(jié)作用的研究取得了較大進展，這為深入了解輸入蛋白家族基因在其他調(diào)控路徑中的功能提供了方向。