木薯成熟種莖多倍體誘導(dǎo)及鑒定

陸柳英等

摘 要 以木薯品種SC205和新選048的成熟種莖為材料，利用秋水仙素對側(cè)芽進(jìn)行滴液法處理誘導(dǎo)多倍體，使用流式細(xì)胞儀鑒定木薯植株倍性，并通過形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)方法鑒定和分析多倍體、嵌合體和二倍體特征特性。結(jié)果表明：通過誘變處理獲得了木薯四倍體和嵌合體植株，四倍體和嵌合體植株與二倍體相比表現(xiàn)出最上部全展葉第1和第2葉葉形指數(shù)降低、葉片厚度增加，氣孔密度變小，葉綠體數(shù)目增加，氣孔長度、保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度增大，葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、葉綠素總量、SPAD值增高，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率增大。

關(guān)鍵詞 木薯；成熟種莖；秋水仙素；四倍體；嵌合體；流式細(xì)胞儀

中圖分類號 S533 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Taken the mature stems of cassava“SC205”and“XinXuan 048”as the explants， the method of inducing polyploid with colchicine treated in the mature stem buds by dripping was investigated. The ploidy of the mutants were explored with flow cytometry； and the morphological， the cytological and physiological characters of the diploid， tetraploid and chimeras were identified too. The tetraploid and chimeras obtained through induction， compared to the diploid， the top two fully expanded leaves of the tetraploid and chimeras were wider and thicker， with smaller stomatal density， increase of the number of chloroplasts， the width of stomata and guard cell， chlorophyll a， chlorophyll b， carotenoid content， total chlorophyll and SPAD values， and the increase of the net photosynthetic rate， stomatal conductance， intercellular CO2 concentration and transpiration rate.

Key words Cassava； Mature stems； Colchicine； Tetraploid； Cytochimeras； Flow cytometry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬，是三大薯類作物之一，熱區(qū)第三大糧食作物，在我國主要分布于廣西、廣東、海南、云南、福建等熱帶、亞熱帶地區(qū)。木薯用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)原料，如淀粉、變性淀粉、酒精等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、生物質(zhì)能源等諸多行業(yè)。生產(chǎn)上高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)木薯品種缺乏、單產(chǎn)低、比較經(jīng)濟(jì)效益低、加工原料短缺已成為制約廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)木薯品種選育顯得尤為必要。多倍體育種為木薯品種選育提供了一個重要途徑[1]。木薯多為二倍體，染色體數(shù)目為2n=36[2]，木薯是收獲營養(yǎng)器官（地下塊根）、以成熟種莖作為繁殖材料的無性繁殖作物，獲得的多倍體常表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，且可通過無性繁殖直接選擇固定[3]。

人工誘導(dǎo)植物多倍體的方法有生物學(xué)、物理和化學(xué)方法。其中，秋水仙素處理加倍染色體的方法由于誘變作用專一性強(qiáng)、突變廣譜、經(jīng)濟(jì)方便，目前應(yīng)用最為普遍。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體可分為田間誘導(dǎo)和離體誘導(dǎo)，而田間誘導(dǎo)處理方法主要有浸漬法[4]、滴液法[5]和注射法[6]，離體培養(yǎng)誘導(dǎo)處理方法主要有點(diǎn)滴法[7]、浸泡法和混培法[8]。國外對木薯多倍體的研究較早，1941年Graner[9]使用秋水仙素誘導(dǎo)木薯多倍體，鑒定到染色體數(shù)目為72條的四倍體材料，其中氣孔的平均長度為40 μm，而對照為28 μm。2006年Nassar[10]使用0.2%的秋水仙素溶液連續(xù)3次，每次間隔12 h，對包裹棉花的木薯腋芽進(jìn)行處理，篩選獲得了木薯多倍體植株。在國內(nèi)，早在1985年就有以甜種木薯6068為材料，采用混合化學(xué)誘變方法獲得穩(wěn)定的四倍體突變新品種的報道，四倍體新品種具有抗葉斑病、長勢旺、桿粗、結(jié)薯集中、早熟等特點(diǎn)，比對照品種增產(chǎn)30%～60%，干薯淀粉含量比對照高2.6%[11]。陳顯雙等[5]采用田間誘導(dǎo)方法，以4 g/L的秋水仙素，滴液法處理木薯植株腋芽生長點(diǎn)，獲得變異枝條。王建嶺[4]將木薯種莖出芽到芽長2 cm左右時的木薯嫩芽浸泡在裝有秋水仙素溶液的小離心管中進(jìn)行誘導(dǎo)處理，張健[8]對木薯離體培養(yǎng)材料的帶芽莖段、成熟子葉和叢生芽，用秋水仙素浸泡法和混培法誘導(dǎo)多倍體，均發(fā)現(xiàn)染色體加倍現(xiàn)象。

本研究采用不同濃度秋水仙素對木薯成熟種莖側(cè)芽進(jìn)行棉花包裹滴液法處理，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定篩選變異芽以及多次截頂促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)法進(jìn)行嵌合體分離，獲得誘變材料，使用流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性，并通過形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)方法鑒定和分析木薯多倍體、嵌合體和二倍體的特征特性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為木薯品種SC205和新選048的成熟種莖，試驗(yàn)材料種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所木薯試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素誘導(dǎo)多倍體試驗(yàn) 2013年4月，將2個品種的木薯成熟種莖截成15～20 cm長的莖段，豎直扦插于塑料大棚內(nèi)珍珠巖基質(zhì)上，扦插深度7～10 cm。5 d后選擇優(yōu)良的、剛萌發(fā)的芽點(diǎn)用棉花包裹，并用配置好的秋水仙素溶液進(jìn)行滴液法處理，處理濃度分別為0（對照）、3、6、9 g/L，處理次數(shù)為2次，時間間隔12 h，第一次于下午6點(diǎn)進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個品種4個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15株，每株2個芽。

1.2.2 變異植株的形態(tài)學(xué)鑒定及形態(tài)學(xué)變異植株的統(tǒng)計 2013年5月，對試驗(yàn)材料根據(jù)葉片顏色、葉脈、葉形指數(shù)、葉片質(zhì)地等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，將葉片顏色加深、葉脈明顯、葉形指數(shù)變小、葉片質(zhì)地增厚等多倍體特征較明顯的植株確定為初步變異植株，初步統(tǒng)計形態(tài)學(xué)變異植株數(shù)。清除無變異植株和抹除無變異芽，并采用多次截頂促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)法[3]分離初步變異植株。2013年7月，將形態(tài)學(xué)觀察到葉片表型仍然保持較明顯多倍體特征的植株移栽到大田種植，繼續(xù)分離純化變異植株，將形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多倍體特征明顯且穩(wěn)定的植株確定為形態(tài)學(xué)變異植株，統(tǒng)計形態(tài)學(xué)變異植株數(shù)。

1.2.3 變異植株的流式細(xì)胞儀鑒定 2013年9月，選擇大田種植后多倍體特征表現(xiàn)較為明顯且穩(wěn)定的植株，參照Pfosser等[12]的方法，采集0.2 g未展開嫩葉，經(jīng)裂解、過濾、染色后，使用美國貝克曼公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀（Cell. Lab. Quanta. SC.）測定樣品細(xì)胞中DNA含量。根據(jù)DNA含量分布圖中峰值所在的相對熒光強(qiáng)度值判斷植株倍性：僅在相對熒光強(qiáng)度值約為在200的位置出現(xiàn)1個單峰，表明此植株為二倍體植株；僅在相對熒光強(qiáng)度值約為400的位置出現(xiàn)1個單峰，表明此植株為四倍體；在相對熒光強(qiáng)度值200～400的位置出現(xiàn)2個峰，表明此植株為嵌合體。

1.2.4 多倍體的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生理指標(biāo)鑒定

2013年10月，從形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)等方面對經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定所獲得的四倍體、嵌合體、二倍體進(jìn)行如下鑒定分析：測量最上部完全展開葉第1和第2葉裂葉長度、裂葉寬度（與主脈垂直的葉片最寬處）、葉厚（打孔測量10片葉厚度）；參考張健[8]的研究方法對氣孔保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定；采用95%乙醇提取法[13]測定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及葉綠素總含量；在晴天9 ： 00～11 ： 30采用LI-6400光合測定儀測定對照株及多倍體植株葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（E）；采用便攜式葉綠素儀SPAD-502PLUS測量葉片SPAD值。

1.3 統(tǒng)計分析

采用EXCEL、SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯成熟種莖腋芽經(jīng)秋水仙素處理后獲得的形態(tài)學(xué)變異情況

成熟種莖腋芽經(jīng)秋水仙素處理后，可觀察到部分萌發(fā)生長后的植株葉片發(fā)生了變異。如圖1所示，SC205和新選048的變異葉片（B、D）與對照（A、C）相比，主要表現(xiàn)出葉片顏色加深、葉脈明顯、葉片長寬比變小、葉片質(zhì)地增厚等。

秋水仙素誘導(dǎo)多倍體試驗(yàn)共處理SC205、新選048成熟種莖腋芽720個，獲得初步變異植株167株。其中，SC205的4個處理濃度0、3、6、9 g/L分別獲得初步變異植株0、43、22、18株，誘變率分別為0.0%、47.8%、24.5%、20.0%；新選048的4個處理濃度0、3、6、9 g/L分別獲得初步變異植株0、40、25、19株，誘變率分別為0.0%、44.4%、27.8%、21.1%。經(jīng)初步篩選和分離純化，將葉片表型多倍體特征仍較明顯的76株材料移栽到大田種植，其中SC205的3、6、9 g/L處理濃度分別獲得植株17、20、6株，新選048的3、6、9 g/L處理濃度分別獲得植株10、17、6株。大田種植后繼續(xù)分離純化變異植株，獲得形態(tài)學(xué)觀察多倍體特征表現(xiàn)較為明顯且穩(wěn)定的SC205誘變材料7份、新選048誘變材料6份，將此13份誘變材料及2個品種的對照（二倍體）植株，用于流式細(xì)胞儀鑒定。

2.2 變異植株的流式細(xì)胞儀鑒定

將大田中經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為多倍體的7株SC205變異植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性鑒定，其中SC205有1株在相對熒光強(qiáng)度值約為400的位置僅出現(xiàn)1個單峰（見圖2-S1），表明其為純合四倍體；有2株在相對熒光強(qiáng)度值200～400的位置出現(xiàn)2個峰（見圖2-S2），表明這2株為嵌合體；其他4株在相對熒光強(qiáng)度值約為200的位置僅出現(xiàn)1個單峰（見圖2-S3），表明這4株均為二倍體。將大田中經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為多倍體的6株新選048變異植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性鑒定；其中有3株在相對熒光強(qiáng)度值200～400的位置出現(xiàn)2個峰，說明這3株為嵌合體（見圖2-X1、X2）；其他3株在相對熒光強(qiáng)度值約為在200的位置僅出現(xiàn)1個單峰，說明這3株為二倍體（見圖-X3）。

2.3 多倍體的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生理指標(biāo)鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 由表1可知，SC205四倍體、嵌合體植株最上部完全展開葉第1葉的葉形指數(shù)分別為（4.73±3.46）和（3.64±0.64），第2葉的葉形指數(shù)分別為（4.54±1.85）和（3.62±0.77），顯著小于二倍體第1、第2葉葉形指數(shù)（9.23±0.40）、（9.33±0.55）。新選048嵌合體植株X1最上部完全展開葉第1、2葉的葉形指數(shù)（2.41±0.59）、（2.16±0.01）和嵌合體X2第2葉葉形指數(shù)（2.95±0.40）分別顯著小于二倍體第1、2葉葉形指數(shù)（3.76±0.33）、（3.84±0.12）；X2第1葉葉形指數(shù)（3.10±0.32）小于二倍體第1葉葉形指數(shù)但差異不顯著。S1、S2的葉厚值分別達(dá)到（1.52±0.15）、（1.50±0.16） mm，顯著大于二倍體S3的葉厚值（1.29±0.07） mm；X1的葉厚值為（1.39±0.05） mm，大于二倍體（1.33±0.05） mm但差異不顯著，X2葉厚值為（1.58±0.09） mm，顯著大于二倍體葉厚值。

由此可見，2個品種的四倍體和嵌合體植株與二倍體相比，第1、2葉葉形指數(shù)降低，葉厚增加。

2.3.2 解剖學(xué)鑒定 由表2可知，SC205四倍體S1、嵌合體S2的氣孔密度分別為（18.1±3.5）、（18.1±1.2） 個/視野，二倍體S3的氣孔密度為（24.3±2.6）個/視野；新選048嵌合體X1、X2氣孔密度分別為（15.7±2.5）、（16.9±1.9） 個/視野，二倍體X3的氣孔密度為（20.9±1.8） 個/視野。四倍體、嵌合體及二倍體葉片下表皮的氣孔形態(tài)如圖3所示，SC205四倍體、嵌合體的氣孔密度顯著小于二倍體（圖3-S1、S2、S3），新選048嵌合體的氣孔密度顯著小于二倍體（圖3-X1、X2、X3）。

SC205四倍體S1、嵌合體S2的氣孔長度分別為（12.13±2.53）、（12.15±1.80） μm，氣孔寬度分別為（12.13±2.53）、（12.15±1.80） μm，葉綠體數(shù)分別為（7.8±2.0）、（6.2±0.8） 個/保衛(wèi)細(xì)胞，顯著大于二倍體S3的氣孔長度（9.22±1.56） μm、氣孔寬度（2.22±0.47） μm和葉綠體數(shù)（5.1±0.6） 個/保衛(wèi)細(xì)胞；S2保衛(wèi)細(xì)胞長度（22.77±1.76） μm顯著大于S3保衛(wèi)細(xì)胞長度（20.23±2.38） μm；S1保衛(wèi)細(xì)胞寬度（5.10±0.56） μm顯著大于S3保衛(wèi)細(xì)胞寬度（4.26±0.58） μm。新選048嵌合體X1、X2的氣孔長度（11.44±2.40）、（11.64±2.39） μm大于二倍體X3氣孔長度（10.90±1.87） μm，差異不顯著；X1、X2的保衛(wèi)細(xì)胞長度分別為（21.23±2.78）、（22.38±2.48） μm，顯著大于X3的保衛(wèi)細(xì)胞長度（19.15±1.95） μm。四倍體、嵌合體及二倍體葉片下表皮保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體形態(tài)如圖4所示，四倍體的葉綠體數(shù)明顯多于嵌合體和二倍體（見圖4-S1、S2、S3），嵌合體的保衛(wèi)細(xì)胞長度明顯大于二倍體（見圖4-X1、X2、X3）。

由此可見，2個品種的四倍體和嵌合體植株與二倍體相比，氣孔密度變小，氣孔長度、保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度增加，葉綠體數(shù)目增加。

2.3.3 生理指標(biāo)鑒定 由表3可知，SC205四倍體S1、嵌合體S2的葉綠素a含量分別為（3.04±0.21）、（3.04±0.07） mg/g，葉綠素b含量分別為（0.97±0.07）、（0.97±0.04） mg/g，類胡蘿卜素含量分別為（0.57±0.03）、（0.56±0.02） mg/g，葉綠素總量分別為（4.00±0.28）、（4.01±0.11） mg/g，SPAD值分別為（57.43±1.96）、（51.43±1.97），均顯著高于二倍體S3的葉綠素a含量（2.17±0.09） mg/g、葉綠素b含量（0.58±0.02） mg/g、類胡蘿卜素含量（0.45±0.02） mg/g、葉綠素總量（2.74±0.11） mg/g、SPAD值（42.27±0.72）。新選048嵌合體X1的葉綠素a含量（2.69±0.17） mg/g、葉綠素b含量（0.74±0.06） mg/g、葉綠素總量（3.44±0.22） mg/g、SPAD值（46.27±1.46）大于二倍體X3的葉綠素a含量（2.46±0.05） mg/g、葉綠素b含量（0.70±0.02） mg/g、葉綠素總量（3.17±0.07） mg/g、SPAD值（40.70±2.08），差異均不顯著；X1類胡蘿卜素含量（0.63±0.06） mg/g顯著大于X3類胡蘿卜素含量（0.52±0.01） mg/g；嵌合體X2的葉綠素a含量（3.28±0.19） mg/g、葉綠素b含量（0.89±0.04） mg/g、類胡蘿卜素含量（0.64±0.05） mg/g、葉綠素總量（4.17±0.23） mg/g均顯著大于二倍體X3，SPAD值（48.33±5.39）大于二倍體但差異不顯著。

由此可見，2個品種的四倍體和嵌合體植株與二倍體相比，葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、葉綠素總量、SPAD值均增加。

由表4可知，SC205四倍體S1的氣孔導(dǎo)度為（0.34±0.09） μmol/（m2·s）、胞間CO2濃度為（252.40±11.45） μmol/mol 、蒸騰速率為（4.40±0.52） μmol/（m2·s），顯著高于二倍體S3的氣孔導(dǎo)度（0.22±0.08） μmol/（m2·s）、胞間CO2濃度（229.75±13.82） μmol/mol、蒸騰速率（3.32±0.84） μmol/（m2·s）；S1的凈光合速率（20.29±2.67） μmol/（m2·s）高于S3的凈光合速率（16.31±3.90） μmol/m2·s，差異不顯著；嵌合體S2的4項光合生理指標(biāo)平均值均高于二倍體，差異不顯著。4項光合生理指標(biāo)平均值表現(xiàn)為S1（四倍體）>S2（嵌合體）>S3（二倍體）。

3 討論與結(jié)論

秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的同源多倍體常伴隨植物形態(tài)、解剖、生理、栽培特性等方面改變，如葉片變厚變大、葉色加深、葉綠素含量增加、花變大、果實(shí)變大、維管束變大、抗逆性增強(qiáng)、生物量或生物有效成分增加等[14-15]。本研究結(jié)果表明，四倍體、嵌合體植株與二倍體相比，表現(xiàn)出最上部全展葉第1和第2葉葉形指數(shù)降低、葉厚增大，氣孔密度變小，葉綠體數(shù)目增加，氣孔長度、保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度增大，葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量增高的特點(diǎn)，與安飛飛[16]、張健[8]、王建嶺[4]等在木薯多倍體鑒定試驗(yàn)中的研究結(jié)果一致。另外，紫錐菊四倍體與對照二倍體相比，氣孔、花粉、花和種子更大，菊苣酸、綠原酸含量明顯增加[17]，董娟等[18]發(fā)現(xiàn)大葉鐵線蓮四倍體比二倍體植株葉片SPAD值增大，祁傳磊等[19]發(fā)現(xiàn)大青楊三倍體的最大凈光合速率比二倍體高出21%，而本試驗(yàn)的研究結(jié)果也說明了四倍體和嵌合體植株與二倍體相比，生物有效成分增加、光合特性增強(qiáng)。

通過流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞核DNA含量可用于植物倍性鑒定，它不僅可以準(zhǔn)確的測定細(xì)胞是否進(jìn)行了染色體加倍，還可測定出染色體加倍和未加倍的細(xì)胞數(shù)比例[20-21]，如X1中四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞數(shù)量比約為11 ∶ 5，X2中四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞數(shù)量比約為4 ∶ 5，因此，2個嵌合體植株的四倍體細(xì)胞所占比例X1大于X2。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，如檢測結(jié)果顯示是四倍體，檢測得到的應(yīng)是純合的四倍體植株，而檢測結(jié)果顯示為嵌合體或二倍體時，則需要繼續(xù)進(jìn)行嵌合體分離。就無性繁殖作物而言，嵌合體分離通常采用兩種方式：組織連續(xù)切割分離法和葉片不定芽再生技術(shù)[22]。王娜等[23]利用組織連續(xù)切割分離法對嵌合體進(jìn)行3～4次的繼代分離，獲得了同質(zhì)多倍體，有效防止了回復(fù)突變。秋水仙素離體誘導(dǎo)積雪草組培苗獲得的倍性嵌合體經(jīng)過不同代數(shù)培養(yǎng)被逐漸分離出來[24]。筆者下一步將繼續(xù)對嵌合體材料分離純化，一方面繼續(xù)采用多次截頂促側(cè)芽萌發(fā)法在田間進(jìn)行，另一方面通過采集嵌合體側(cè)芽進(jìn)行離體培養(yǎng)，將組培苗中觀察到的變異株進(jìn)行連續(xù)繼代增殖，進(jìn)而分離獲得純合率高的木薯多倍體植株。另外，還需繼續(xù)種植獲得的四倍體植株，并對其綜合性狀進(jìn)行鑒定評價，進(jìn)而篩選高產(chǎn)高淀粉含量的木薯新品系。

致 謝 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所冷青云助理研究員提供了流式細(xì)胞儀鑒定方面的寶貴經(jīng)驗(yàn)和建議，在此表示感謝！

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