同位素稀釋HPLC-MS法測(cè)定爆米花中7種真菌毒素

摘 要：目的：采用同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種測(cè)定爆米花中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3這7種真菌毒素的方法。方法：樣品用甲酸-水-乙腈（1∶29∶70，體積比）溶液提取，經(jīng)稀釋、離心、過(guò)濾后，取上清液加入一定濃度13C標(biāo)記的真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)溶液，上機(jī)測(cè)定。結(jié)果：7種真菌毒素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)＞0.999，檢出限為0.3～50.0 μg·kg-1，回收率為72.5%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.04%～9.73%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，能夠滿足同時(shí)測(cè)定爆米花中多種真菌毒素的要求。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；真菌毒素；爆米花

Determination of Seven Mycotoxins in Popcorn by Isotope Dilution HPLC-MS

WANG Haiping， LI Shuang， LI Hui*， WANG Weiguang， QIN Peng

（Rizhao Center for Disease Control and Prevention， Rizhao 276826， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1， aflatoxin B2， aflatoxin G1， aflatoxin G2， fumonitoxin B1， fumonitoxin B2 and fumonitoxin B3 in popcorn by isotope dilution ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The samples were extracted from formic acid-water-acetonitrile （1∶29∶70， volume ratio） solution. After dilution， centrifugation and filtration， the supernatant was added into the internal standard solution of mycotoxin isotope labeled with a certain concentration of 13C. Result： The linear relationship of the seven mycotoxins was good， the correlation coefficient was greater than 0.999， the detection limit was 0.3～50.0 μg·kg-1， the recovery rate was 72.5% to 120.0%， and the relative standard deviation was 2.04% to 9.73%. Conclusion： The method is simple and sensitive， and can meet the requirements of simultaneous determination of fungal toxins in popcorn.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; mycotoxins; popcorn

黃曲霉毒素、伏馬毒素是對(duì)人體健康危害極大的真菌毒素，多具有肝臟毒性、神經(jīng)毒性、致癌性，并可能誘發(fā)免疫抑制類疾病[1-3]。爆米花作為一種很方便的零食，備受人們的喜愛(ài)。爆米花的食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。因此，建立爆米花中黃曲霉毒素、伏馬毒素的檢測(cè)方法非常必要。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為較先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，能提供化合物的分子結(jié)構(gòu)信息，具有靈敏度高、能有效去除干擾等優(yōu)勢(shì)[4-7]。本研究建立了適用于同時(shí)分析爆米花中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFT B2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFT G1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFT G2）、伏馬毒素B1（Fumonitoxin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（Fumonitoxin B2，F(xiàn)B2）和伏馬毒素B3（Fumonitoxin B3，F(xiàn)B3）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；伏馬毒素B1、B2、B3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，青島普瑞邦生物工程有限公司；同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（13C17-AFT B1、13C17-AFT B2、13C17-AFT G1、13C17-AFT G2），Romer國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；13C34-伏馬毒素B1、B2、B3（13C34-FB1、13C34-AFB2、13C34-AFB3），青島普瑞邦生物工程有限公司；甲酸和乙腈，均為色譜純，德國(guó)Merck公司；一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Altis超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo公司；ME204電子天平（精度0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多公司；CR21N低溫高速離心機(jī)，日本日立工機(jī)株式會(huì)社；Multi Reax混合器，德國(guó)海道夫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜級(jí)乙腈稀釋至0.5 μg·mL-1；將伏馬毒素B1、B2、B3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜級(jí)乙腈稀釋至10 μg·mL-1。

（2）混合真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)工作液。將各同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋到所需濃度，其中13C17-黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2濃度為0.01 μg·mL-1，13C34-伏馬毒素B1、B2、B3濃度為0.5 μg·mL-1。

（3）系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用20%乙腈-水溶液稀釋成不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作系列。其中，黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg·L-1和2.00 μg·L-1，伏馬毒素B1、B2、B3標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg·L-1和40.0 μg·L-1。

1.3.2 樣品前處理

稱量5 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲酸-水-乙腈（1∶29∶70，體積比），渦旋振蕩30 min，以10 000 r·min-1離心5 min。分取0.5 mL上清于1.5 mL離心管中，加入1.0 mL水，旋渦混勻后，在4 ℃以10 000 r·min-1離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。取180 μL處理好的樣品濾液于300 μL內(nèi)插管中，加入20 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液，混勻。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A：0.2%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL；色譜柱：Waters BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0～1.0 min，流動(dòng)相A維持在80%；1.0～4.0 min，流動(dòng)相A從80%降低至60%；4.0～10.0 min，流動(dòng)相A從60%降低至30%；10.0～11.8 min，流動(dòng)相A從30%減至0%；11.8～15.0 min，流動(dòng)相A從0%升至80%。

（2）質(zhì)譜條件。錐孔電壓：3.0 kV；加熱器溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣：800 L·h-1。各真菌毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將上述系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定，記錄儀器響應(yīng)值，以外標(biāo)濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)，以外標(biāo)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。以低濃度加標(biāo)樣品基線噪音的3倍信噪比計(jì)算方法檢出限。由表2可知，7種真菌毒素在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.2 加標(biāo)回收率和精密度

取陰性爆米花樣品，分別向其中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，7種真菌毒素的平均加標(biāo)回收率在72.5%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.04%～9.73%。

3 結(jié)論

本研究建立了同位素稀釋-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定爆米花中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏馬毒素B1、B2、B3的檢測(cè)方法。該方法的線性關(guān)系、檢出限、精密度及準(zhǔn)確度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于對(duì)爆米花中7種真菌毒素的定量檢測(cè)。

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作者簡(jiǎn)介：王海萍（1985—），女，山東日照人，碩士，主管技師。研究方向：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)。

通信作者：李慧（1977—），女，山東日照人，本科，副主任技師。研究方向：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)。E-mail： lengli009@163.com。