2022—2024年食品微生物能力驗證的結(jié)果分析探討

摘 要：能力驗證是保障實驗室質(zhì)量控制的有效方法，定期參加能力驗證能夠提高檢驗員的技術(shù)操作能力和分析水平，為實驗室建設(shè)提供保障。依據(jù)能力驗證指導(dǎo)書和食品微生物學(xué)檢驗的相關(guān)要求對能力驗證的樣品進行檢測。經(jīng)評價，3次能力驗證，6個考核結(jié)果|Z|值均小于2.0，結(jié)果為滿意，證明本實驗室具備食品中金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母、菌落總數(shù)的檢測能力。

關(guān)鍵詞：能力驗證；金黃色葡萄球菌；霉菌和酵母；菌落總數(shù)

Analysis and Discussion on the Results of Food Microbial Capability Validation from 2022 to 2024

SHAO Yue， LIU Yongze， LU Furong， LI Jie

（Yingkou Food and Drug Testing Center， Yingkou 115000， China）

Abstract： Capability verification is an effective method to ensure laboratory quality control. Regular participation in capability verification can improve the technical operation ability and analytical level of inspectors， and also provide guarantees for laboratory construction. According to the guidelines for proficiency testing and the relevant requirements of food microbiological testing， the samples for proficiency testing shall be tested. After evaluation， 3 proficiency tests were conducted， and 6 assessment results showed |Z| values less than 2.0， indicating satisfaction. This proves that our laboratory has the ability to detect Staphylococcus aureus， mold， yeast， and total bacterial count in food.

Keywords： capability verification; Staphylococcus aureus; mold and yeast; total number of bacterial colonies

金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，可導(dǎo)致人的多種疾病，嚴重危害人體健康。霉菌和酵母均屬于真菌，具有很強的代謝能力。相關(guān)研究表明，如果長期食用霉菌和酵母超標的食品，會誘發(fā)癌癥。菌落總數(shù)指細菌總量，包含多種樣態(tài)的細菌，可用于評估食品樣品中微生物污染的嚴重程度及其衛(wèi)生質(zhì)量。人體長期食用菌落總數(shù)超標的食物，可能會引起胃腸道疾病[1]。因此，常選擇金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母、菌落總數(shù)作為食品質(zhì)量安全指標。為此，微生物實驗室定期參加能力驗證至關(guān)重要，這對于人員能力評價、方法驗證、數(shù)據(jù)或結(jié)果準確性評價等方面均具有非常重要的意義[2]。本文對2022—2024微生物實驗室連續(xù)3年的能力驗證進行論述，以為實驗室質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本次實驗收到了6份待測樣品，其中，2022年

中國檢驗檢疫科學(xué)院測試評價中心發(fā)放ACAS-PT1339（2022）食品中金黃色葡萄球菌能力驗證樣品2份，編號為22-C540和22-Q626；2023年中國檢驗檢疫科學(xué)院測試評價中心發(fā)放ACAS-PT1588（2023）霉菌和酵母計數(shù)能力驗證樣品2份，編號為23-T787和23-T269；2024年華測檢測認證集團股份有限公司發(fā)放能力驗證樣品2份，編號為LNSCJG-24-02 268和LNSCJG-24-02 331。

1.2 材料和試劑

Baird-Parker瓊脂平板、凍干血漿、血平板、BHI肉湯、孟加拉紅（亦稱虎紅）瓊脂、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（Plate Count Agar，PCA），所有試劑均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉（分析純），批號為20220927，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無菌水，實驗室自制，由純水機（UPH-IV-207）制備。

1.3 儀器和設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（BSP-250型與BSP-400型），上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；霉菌培養(yǎng)箱（DMJ-250C）、立式壓力滅菌器（YXQ-75G），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；恒溫水浴鍋（HH-ZK6），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；生物安全柜（HR1500-IIA2），青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品前處理

依據(jù)參試指導(dǎo)書，對樣品進行預(yù)處理。開啟樣品封裝后，迅速向西林瓶內(nèi)注入適量稀釋液，待樣品完全融解，通過移液器將溶液吸取并轉(zhuǎn)移至無菌容器內(nèi)，用剩余稀釋液多次沖洗西林瓶內(nèi)壁，回收沖洗液并轉(zhuǎn)移至無菌容器中，所得溶液即為待測樣品的初始溶液，也被稱為原液。各環(huán)節(jié)操作均在生物安全柜中進行，以確保樣品結(jié)果的準確性和人員的安全性。

1.4.2 樣品稀釋

在無菌條件下，使用移液器精確量取25 mL的原液樣品（100），注入225 mL的無菌稀釋液，進行稀釋，再通過均質(zhì)化處理，使其充分混合均勻，獲得1∶10的樣品均質(zhì)液（10-1）。從均質(zhì)液中吸取1 mL，加入裝有9 mL無菌稀釋液的試管內(nèi)，并用旋渦混合器充分混勻，獲得1∶100的樣品均質(zhì)液（10-2）。通過上述操作，可以逐步制備出濃度遞減的系列樣品均質(zhì)液（共制備5個梯度稀釋液，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）。

1.4.3 金黃色葡萄球菌檢測

完成樣品稀釋后，從5個梯度稀釋液中（不包括原液）分別取0.3、0.3、0.4 mL涂布3塊BP（Baird-Parker）平板，將其倒置于（36±1）℃條件下培養(yǎng)48 h，并記錄好每個平板的菌落數(shù)。選擇典型菌落，分別進行革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗。同時，將典型菌落劃線接種到血平板上，并將其放置在（36±1）℃的條件下培養(yǎng)24 h。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌》（GB 4789.10—2016）第二法中的要求進行培養(yǎng)計數(shù)。

1.4.4 霉菌和酵母檢測

完成樣品稀釋后，將樣品原液和5個稀釋梯度的樣品勻液作兩個平行樣，分別吸取1 mL放置于平皿中，再將20～25 mL孟加拉紅培養(yǎng)基（冷卻至46 ℃）傾注平皿，并輕輕轉(zhuǎn)動使其混合均勻。參照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）第一法中的要求進行操作。待孟加拉紅瓊脂完全凝固后，將培養(yǎng)皿正置于（28±1）℃的霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，定時觀察，并詳細記錄實驗結(jié)果。

1.4.5 菌落總數(shù)檢測

完成樣品稀釋后，將樣品原液和5個稀釋梯度的樣品勻液作兩個平行樣，分別吸取1 mL放置于平皿中，再將已冷卻至46 ℃的PCA培養(yǎng)基（約18～20 mL）傾注平皿并輕輕轉(zhuǎn)動，以確保培養(yǎng)基和樣品勻液能夠均勻鋪展于平皿內(nèi)。待培養(yǎng)基凝固，將培養(yǎng)皿倒置放入（36±1）℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。全過程控制在15 min以內(nèi)，以保證樣品結(jié)果的準確性。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2022）中的要求進行培養(yǎng)與計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果觀察與計數(shù)

2.1.1 金黃色葡萄球菌

樣品22-C540和樣品22-Q626的金黃色葡萄球菌在BP平板上的計數(shù)情況如表1所示。

從具有代表性的菌落中至少選取5個疑似菌落進行鑒定，經(jīng)試驗后確認為金黃色葡萄球菌，開始計數(shù)。針對同一稀釋度下的3組平板，若其菌落總數(shù)之和在20～200 CFU，則進行計數(shù)。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌》（GB 4789.10—2016）中的要求進行計數(shù)。由表1可知，兩個樣品都取10-2梯度進行計數(shù)，結(jié)果分別為4.1×103 CFU·mL-1和6.6×103 CFU·mL-1。

2.1.2 霉菌與酵母

樣品23-C787與23-T269霉菌與酵母的計數(shù)情況如表2所示。

選取同一稀釋度菌落數(shù)在10～150 CFU的兩個平板進行計數(shù)。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）要求進行計數(shù)。由表2可知，編號為23-T787的樣品，選用10-2的稀釋比例進行霉菌計數(shù)，所得結(jié)果為2 900 CFU·mL-1。選取原液進行酵母菌計數(shù)，所得計數(shù)結(jié)果為106 CFU·mL-1。編號為23-T269的樣品，霉菌的計數(shù)選取了10-2的稀釋梯度，所得結(jié)果為2 600 CFU·mL-1；酵母計數(shù)選取原液進行計數(shù)，所得結(jié)果是81 CFU·mL-1。

2.1.3 菌落總數(shù)

樣品LNSCJG-24-02 268和樣品LNSCJG-24-02 331的菌落總數(shù)在PCA平板上的計數(shù)情況如表3所示。

菌落總數(shù)在計數(shù)時取值30～300 CFU，按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2022）中的要求進行計數(shù)并修約。樣品LNSCJG-24-02 268取10-2梯度進行計數(shù)，所得結(jié)果為2.0×104 CFU·mL-1。樣品LNSCJG-24-02 331取10-2梯度進行計數(shù)，所得結(jié)果為2.9×104 CFU·mL-1。

在上述3次能力驗證實驗中，分別完成了培養(yǎng)基空白對照和生理鹽水空白對照實驗。結(jié)果顯示，在空白對照實驗中均未發(fā)現(xiàn)菌落生長，驗證了實驗的可靠性。

2.2 能力驗證結(jié)果分析

2022年結(jié)果評價22-Q626樣品Z值為0.9，22-C540樣品Z值為-0.7；2023年結(jié)果評價23-C787樣品Z值為0.6，23-T269樣品Z值為0.5；2024年268樣品Z值為0.25。2024年菌落總數(shù)能力驗證結(jié)果通知單顯示，兩個樣品分別為統(tǒng)計樣和干擾樣，報送結(jié)果顯示268樣品有準確Z值，而331的樣品未提供Z值，因此可以證明268為統(tǒng)計樣，331為干擾樣。通過分析3次能力驗證結(jié)果得知，|Z|值均小于2.0，證明實驗結(jié)果相對準確（能力驗證評價準則為|Z|≤2.0時，為滿意結(jié)果；當(dāng)2.0＜|Z|＜3.0時，為可疑結(jié)果；當(dāng)|Z|≥3.0時，為不滿意結(jié)果）。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

實驗中，建議使用一次性無菌平皿，玻璃平皿可能存在不平整現(xiàn)象，影響計數(shù)。在開展實驗之前，應(yīng)準備好實驗試劑和耗材，提前滅菌。生物安全柜在實驗開始之前用紫外燈照射30 min，臺面用75%乙醇擦拭一遍。培養(yǎng)箱提前打開并調(diào)到所需溫度，以保證培養(yǎng)時間達到標準要求，方便計時保證結(jié)果準確性。金黃色葡萄球菌定量項目在計數(shù)時應(yīng)詳細記錄典型的菌落數(shù)，進行后續(xù)鑒定時，應(yīng)盡可能地多挑取可疑菌落，以保證取到目標菌，防止挑取的菌種全部都是雜菌而造成假陰性的結(jié)果[3]。霉菌與酵母菌的計數(shù)中，由于霉菌和酵母孢子會擴散，因此在新版標準GB 4789.15—2016中，明確規(guī)定將培養(yǎng)方式調(diào)整為正置培養(yǎng)[4]。菌落總數(shù)培養(yǎng)時，培養(yǎng)基厚度要適中，如有必要可以再覆蓋一層培養(yǎng)基，控制好實驗時間，避免時間過長影響計數(shù)結(jié)果。

微生物實驗每個環(huán)節(jié)都會影響最終的檢測結(jié)果，因此每一步都應(yīng)該詳細記錄下來，以便及時發(fā)現(xiàn)問題并改正，在計數(shù)過程中每隔一段時間就應(yīng)該記錄，防止時間過長菌落蔓延影響結(jié)果。在做實驗時應(yīng)安排人員進行比對，根據(jù)不同檢驗員的結(jié)果進行分析，必要時也可以用紙片法進行對比實驗。在能力驗證過程中可通過安排人員進行比對測試、定量檢測結(jié)果的不確定度，加強檢驗過程中的監(jiān)督與核查，提高檢驗員自身的實驗技能和解決問題的能力，以及實驗室的整體檢測質(zhì)量[5]。

3.2 結(jié)論

定期參加能力驗證能夠及時發(fā)現(xiàn)實驗室問題，對于檢驗員提高自身技術(shù)水平也有很大幫助。營口市食品藥品檢驗檢測中心微生物檢驗室，連續(xù)3年參加能力驗證，|Z|值均小于2.0，結(jié)果均為滿意，證明實驗室檢測結(jié)果相對準確，為承擔(dān)國家抽檢任務(wù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻

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[2]雷質(zhì)文.食品微生物實驗室質(zhì)量管理手冊[M].北京：中國標準出版社，2006.

[3]李文綺，李自芹，賈文婷.2019—2021年食品微生物能力驗證的結(jié)果分析與討論[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2023（3）：67-71.

[4]郭麗艷.能力驗證樣品中霉菌和酵母檢測結(jié)果的不確定度評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019，10（18）：6088-6092.

[5]中國食品藥品檢定研究院.食品檢驗操作技術(shù)規(guī)范（微生物檢驗）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2019.

作者簡介：邵悅（1993—），女，黑龍江蘭西人，本科，工程師。研究方向：生物技術(shù)、食品微生物。