基于KRAS突變肽段介導(dǎo)的胰腺癌免疫治療

關(guān)鍵詞：胰腺導(dǎo)管癌；KRAS；免疫療法；腺病毒；基因治療

胰腺癌（PancreaticCancer，PC）是一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，胰腺導(dǎo)管癌（PancreaticDuctalAdenocaromas，PDAC）是胰腺癌最主要的亞型，約90%的胰腺惡性腫瘤源于胰腺導(dǎo)管上皮病變形成的胰腺導(dǎo)管癌[1]。胰腺癌5年總生存率僅為12%左右[2]，早期發(fā)現(xiàn)率低、進(jìn)展快、易產(chǎn)生耐藥性是胰腺癌的主要特點(diǎn)，也是導(dǎo)致其預(yù)后不良的主要因素[1]。據(jù)研究結(jié)果顯示，到2023年胰腺癌已成為繼肺癌和結(jié)直腸癌之后的第三大癌癥死亡原因[2-3]。用手術(shù)切除的方法進(jìn)行治療目前被認(rèn)為是胰腺癌唯一的治療方法[4]，治療標(biāo)準(zhǔn)為先手術(shù)后輔助化療，但由于大多數(shù)病例在早期沒有癥狀，這導(dǎo)致目前可用的診斷測試往往無法檢測到早期疾病患者，確診時(shí)只有15%～20%的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)，大部分患者被診斷時(shí)就處于疾病晚期或因局部進(jìn)展而失去手術(shù)機(jī)會(huì)[1，5-6]。對于不可進(jìn)行手術(shù)切除的處于疾病轉(zhuǎn)移或疾病晚期患者，化療是唯一的治療選擇[7]。但PDAC是一種對于化療耐藥性很強(qiáng)的癌癥。在能夠耐受5-氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑三重化療的患者中，生存期也只能延長到11個(gè)月[8]，且這種姑息性化療可能具有顯著的毒性。

Ras基因是人類癌癥中最經(jīng)常出現(xiàn)突變的腫瘤基因組。而在Ras突變型癌癥中又有84%的突變?yōu)镵RAS異構(gòu)體發(fā)生突變[9]。據(jù)Connor等[10]的研究顯示，大約90%的PDAC中存在KRAS突變，KRAS高頻率的突變以及其在癌癥發(fā)展早期被激活，都意味著KRAS突變導(dǎo)致的致癌信號傳導(dǎo)可能是PDAC的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)因素[10]。在KRAS中，與癌癥相關(guān)的錯(cuò)義突變主要聚集在Gly12（G12）、Gly13（G13）和Gln61（Q61）密碼子上，共占99%[11]，而在KRASQ61突變中Q61的主要突變?yōu)镼61H，約占57%[12]。突變的KRAS不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，還可以促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）等免疫抑制細(xì)胞的浸潤，減少腫瘤組織中CD8+T淋巴細(xì)胞比例[13-17]。KRAS突變等遺傳畸變是癌癥特有，而在正常組織中不存在[18]。因此，靶向KRAS的典型熱點(diǎn)突變是治療有KRAS突變位點(diǎn)癌癥的一種非常有吸引力的方法。

在免疫學(xué)上，與黑色素瘤[19]、肺癌和膀胱癌[20]等其他腫瘤相比，PDAC具有低免疫原性和低腫瘤突變負(fù)荷（TMB）[19]，對于大多數(shù)患者來說，腫瘤內(nèi)很少有效應(yīng)T細(xì)胞浸潤[21]。大量體細(xì)胞突變釋放新抗原能使得腫瘤組織中炎癥細(xì)胞因子和效應(yīng)T細(xì)胞增加[22-24]，說明高TMB能夠激起免疫治療的療效[19，25]。理論上，只要KRAS突變在腫瘤細(xì)胞上表現(xiàn)出來，通過免疫療法直接靶向KRAS突變就可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)抗腫瘤作用[26]。已有研究表明突變的KRAS肽裝載在抗原呈遞細(xì)胞上可以誘導(dǎo)KRAS突變特異性T細(xì)胞反應(yīng)[27-30]。KRAS突變特異性T細(xì)胞被激活后可以殺死KRAS突變腫瘤細(xì)胞，并抑制KRAS突變腫瘤的生長。

本文通過增加KRASQ61H突變形成新抗原負(fù)荷來激起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫細(xì)胞活性[31]。將表達(dá)KRASQ61H抗原融合蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體包裝為Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4病毒注射液，將其注射到小鼠腫瘤組織內(nèi)，定期測量腫瘤體積變化，在給藥后檢測小鼠體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞的變化情況。在終點(diǎn)處取腫瘤組織，分別在RNA層面和蛋白層面檢測腫瘤組織處T細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果表明，Ad-SNP1通過激起荷瘤小鼠體內(nèi)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的效果，這證明了通過基因治療的方式增加抗原負(fù)荷來達(dá)到抑制腫瘤生長是可行的，同時(shí)篩選出了效果較好的表達(dá)載體，為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要原料與試劑

本文所用的骨架質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行全基因合成。限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；T4連接酶購自ThermoFisherScientific公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；HumanGM-CSFDuoSetELISA試劑盒購自美國Ramp;D公司；抗HSP70（Mycobacteriumtuberculosis）抗體購自GeneTex公司；APC-Cy?7HamsterAnti-MouseCD3e、FITCRatAnti-MouseCD4、PerCP-Cy?5.5RatAnti-MouseCD8a購自美國BD公司；C57BL/6J小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司；人胚腎細(xì)胞（HEK293）購自中科院上海細(xì)胞庫；鼠源胰腺癌細(xì)胞（Pan02）購自上海酶研生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；QPCRSYBRMix購自南京諾唯贊生物科技公司。人源KRASQ61H基因過表達(dá)慢病毒由山東維真生物公司包裝。

1.2主要儀器

凈化工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司，CA-1390-1型）、二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，BB150型）、熒光倒置顯微鏡（德國徠卡Leica公司，DMIL型）、多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，SynergyH1型）、定量基因擴(kuò)增儀（AnalytikJenaAG公司，OTOWER3.0型）、高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，KZ-II型）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝 根據(jù)人源KRAS序列及其熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化得到SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列，將基因序列提交北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行全基因合成。將合成好的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列和實(shí)驗(yàn)室已有pAd載體骨架用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收所需的載體骨架片段及目的基因片段，將其用T4連接酶進(jìn)行連接即得到本文所需的4個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并涂布平板培養(yǎng)，將平板上的單克隆菌落挑出培養(yǎng)，菌液送測確認(rèn)序列無誤后抽提質(zhì)粒用于病毒包裝。本文中所用的Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4病毒的包裝、擴(kuò)增和純化由上海泰兒圖生物科技公司完成。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染 培養(yǎng)基為添加體積分?jǐn)?shù)10%FBS和青霉素和鏈霉素（總體積分?jǐn)?shù)1%）的高糖DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%時(shí)，每孔感染1×107pfu的4種病毒，培養(yǎng)48h后收上清用于Elisa實(shí)驗(yàn)，收細(xì)胞提取RNA用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)。

1.3.3組織、細(xì)胞的RNA提取及Real-TimeqPCR 感染病毒后的細(xì)胞加Trizol提取RNA；對于小鼠的腫瘤組織，加Trizol及研磨珠勻漿處理后提取RNA，將提取得到的RNA樣本進(jìn)行定量，后用PrimeScriptMix酶反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需體積配置擴(kuò)增體系，擴(kuò)增體系為cDNA、雙蒸水和預(yù)混液SYBRMix，用RT-qPCR檢測在RNA水平上各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)情況，檢測時(shí)每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.4小鼠血常規(guī) 對小鼠進(jìn)行眼眶取血，取血時(shí)須在EP（Eppendorf）管中提前加入EDTA-K2抗凝劑，抗凝劑質(zhì)量濃度為1.5mg/mL，血樣送由賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行血常規(guī)檢測。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞 對小鼠進(jìn)行眼眶取血（在EP管中提前加入肝素鋰抗凝劑），每管血樣中加入2μLAPC-Cy7CD3e、1μLPerCP-Cy5.5CD8a、1μLFITCCD4，設(shè)置好對照組，避光孵育30min后用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行2次紅細(xì)胞破除，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次后用0.5mLPBS重懸，最后細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后流式上機(jī)。

1.3.6Pan02-Q61H細(xì)胞系構(gòu)建 首先鼠源胰腺癌細(xì)胞（Pan02）提取RNA并測序，證實(shí)Pan02細(xì)胞系中不含KRASQ61H突變。用含有KRASQ61H突變的慢病毒以感染復(fù)數(shù)50、用1/2小體積感染法感染Pan02，并用含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)液培養(yǎng)幾代，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株（慢病毒中設(shè)計(jì)攜帶有Puromycin抗性基因），用顯微鏡觀察GFP信號，確認(rèn)感染情況。收取篩選后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測GFP信號，再次驗(yàn)證熒光細(xì)胞的比例。同時(shí)收細(xì)胞并提取mRNA進(jìn)行RT-qPCR檢測Pan02-Q61H細(xì)胞在mRNA水平上KRASQ61H突變表達(dá)。將RT-qPCR產(chǎn)物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測序，驗(yàn)證構(gòu)建情況。

1.3.7Pan02-Q61H小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建并驗(yàn)證好的Pan02-Q61H細(xì)胞，第1天（D1）以皮下注射的方式將8×105個(gè)細(xì)胞量接種在C57BL/6小鼠的右側(cè)背部，每只注射100μL，構(gòu)建移植瘤小鼠模型。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組（n=7），分別為SNP1組、SNP2組、SNP3組、SNP4組以及Control組，在移植后第8、14、20d，每只小鼠瘤內(nèi)注射5×108pfu相應(yīng)的Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4這4種病毒，注射體積為100μL，對照組小鼠則在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)注射相同體積病毒稀釋液，根據(jù)腫瘤生長情況，每3d監(jiān)測一次腫瘤的大小，并使用游標(biāo)卡尺記錄二維測量值，計(jì)算腫瘤大?。?.5×長×寬2）。在第34d處死小鼠，收集腫瘤組織并稱重。

1.3.8小鼠組織切片及免疫熒光染色 采用多聚甲醛固定腫瘤組織后用梯度乙醇進(jìn)行組織脫水，然后用二甲苯進(jìn)行組織透明，最后進(jìn)行浸蠟和包埋，得到組織樣品石蠟塊，將蠟塊修整后，用石蠟切片機(jī)將其切成厚度均為5μm切片，切片貼于載玻片上進(jìn)行烤片、脫蠟及復(fù)水得到組織樣品切片。組織切片先用抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，后用體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用封閉液封閉非特異性位點(diǎn)，封閉結(jié)束后孵育對應(yīng)的CD4、CD8和CD11B抗體，最后用DAPI（4'，6-二脒基-2苯基吲哚）對細(xì)胞核進(jìn)行染色后封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍攝熒光圖。

1.3.9統(tǒng)計(jì)分析 所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphpadPrism9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用組件Student'st-tests及單因素One-WayANOVA進(jìn)行分析，所有結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）進(jìn)行表示。Plt;0.05表示數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，*表示Plt;0.05；**表示Plt;0.01，***表示Plt;0.001，****表示Plt;0.0001。WesternBlot圖片以及免疫熒光圖片使用ImageJ統(tǒng)計(jì)處理，并用GraphpadPrism9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與討論

2.14種載體構(gòu)建及表達(dá)水平檢測

設(shè)計(jì)并構(gòu)建好4種質(zhì)粒表達(dá)載體，結(jié)果如圖1所示。由圖1（a）可見，4種表達(dá)載體均由兩個(gè)表達(dá)盒構(gòu)成，第1個(gè)表達(dá)盒由人巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）啟動(dòng)子、含多種KRAS突變位點(diǎn)的肽段融合熱激蛋白70（HeatShockProtein70，HSP70）分子佐劑構(gòu)成；第2個(gè)表達(dá)盒由TK啟動(dòng)子以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-MacrophageColonyStimulatingFactor，GM-CSF）構(gòu)成。各表達(dá)載體SNP1、SNP2、SNP3、SNP4中的KRAS突變序列排序、連接方式以及種類數(shù)量不同，但均含有Q61H突變肽段，將構(gòu)建并驗(yàn)證無誤的質(zhì)粒包裝腺病毒衣殼得到Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4這4種病毒。

用Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4感染人腎上皮細(xì)胞系（HEK293）后檢測GM-CSF和HSP70的表達(dá)，結(jié)果如圖1（b）和1（c）所示。由圖可見，4種病毒在HEK293中GM-CSF蛋白都有表達(dá)，其中Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3組中GM-CSF蛋白表達(dá)較未感染組分別提高了131.142、105.031、112.932倍（Plt;0.01），Ad-SNP4組中GM-CSF蛋白表達(dá)較未感染組提高了51.2654倍（Plt;0.05），Ad-SNP1組中GMCSF蛋白表達(dá)較其他3組更高；同時(shí)在感染48h后收細(xì)胞提取mRNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA水平上HSP70的表達(dá)，Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組HSP70表達(dá)較未感染組分別提高了25864.5、753.396、8411.12、2940.8倍（Plt;0.01），Ad-SNP1組HSP70表達(dá)顯著高于其他3組。上述結(jié)果表明4種病毒在細(xì)胞層面都能表達(dá)，但表達(dá)水平不同，Ad-SNP1表達(dá)最高，其次是Ad-SNP2、Ad-SNP3，Ad-SNP4表達(dá)最低。為了進(jìn)一步確定表達(dá)情況并篩選表達(dá)較好的載體，在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的藥效研究。

2.24種載體在小鼠體內(nèi)免疫評價(jià)

已有研究證實(shí)了包含突變位點(diǎn)的KRAS衍生肽疫苗在癌癥患者中能夠誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫原性[27]。本研究將Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP44種病毒（n=5）通過皮下注射進(jìn)入C57小鼠體內(nèi)，劑量為1×108pfu，評價(jià)其體內(nèi)激活免疫反應(yīng)的能力。本研究采取與其他研究類似的多次給藥模型，以激活并將免疫反應(yīng)性維持在一定水平[28]。研究結(jié)果表明，皮下注射4種病毒后，在第1次給藥后的第2d（D2）取血，在第1次給藥后兩周以相同的劑量再次給藥（D14），第2次給藥后第6d（D20）取血，檢測血液中白細(xì)胞（WhiteBloodCell，WBC）、單核細(xì)胞（Monocytes，Mon）、淋巴細(xì)胞（Lymphocyte，Lymph）、中性粒細(xì)胞（NeutralGranularCell，Gran）的變化情況，來判斷4種病毒激起機(jī)體免疫反應(yīng)的能力。

第1次給藥后2d（D2）血常規(guī)結(jié)果如圖2（b）～（e）所示，分析血常規(guī)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在給藥后2dAd-SNP1、Ad-SNP4組小鼠體內(nèi)白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞3種免疫相關(guān)細(xì)胞與對照組相比有顯著提升（Plt;0.05）；中性粒細(xì)胞在Ad-SNP1組小鼠體內(nèi)升高（Plt;0.05），Ad-SNP4組無明顯升高（Pgt;0.05）；Ad-SNP2、Ad-SNP3組與未給藥組相比上述4種免疫相關(guān)細(xì)胞均未引起顯著變化；總體來看，Ad-SNP1組和Ad-SNP4組在病毒注射第2d激起小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。

在第2次給藥后的第6d（D20）血常規(guī)結(jié)果如圖2（f）～（i）所示，Ad-SNP1、Ad-SNP2和Ad-SNP3組小鼠體內(nèi)上述4種免疫相關(guān)細(xì)胞與未給藥組相比都有顯著升高（Plt;0.05）；但是Ad-SNP4組在第2次給藥后第6d（D20）時(shí)小鼠體內(nèi)4種免疫相關(guān)細(xì)胞均降低到與對照組相同水平（Pgt;0.05），總體來看，Ad-SNP1組、Ad-SNP2組和Ad-SNP3組在第2次病毒注射后第6d（D20）依然能一定程度激起小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)，而Ad-SNP4組激起小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的能力較差，與未給藥組相比沒有顯著性差異。

除了通過小鼠血常規(guī)檢測來評價(jià)4種病毒藥物激起機(jī)體免疫能力外，本文還通過小鼠外周血流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+、CD4+以及CD8+T淋巴細(xì)胞的變化情況來多角度評價(jià)4種病毒藥物激起小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的能力。

在第1次給藥后兩周（D14）取血，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+、CD4+以及CD8+T淋巴細(xì)胞的變化情況，結(jié)果如圖3所示，Ad-SNP1組小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量（外周血中104個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量）與未給藥組相比有顯著升高（Plt;0.001），Ad-SNP2組小鼠外周血中CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量同樣也有升高（Plt;0.05），但Ad-SNP2組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量無顯著增加（Pgt;0.05），而Ad-SNP3和Ad-SNP4組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量均與未給藥組無顯著差別（Pgt;0.05）。從外周血流式結(jié)果來看，Ad-SNP1、Ad-SNP2能夠顯著激起小鼠免疫反應(yīng)，但Ad-SNP2激起小鼠免疫反應(yīng)的能力較Ad-SNP1差，而Ad-SNP3和Ad-SNP4不能激起小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)。

綜合分析小鼠血常規(guī)結(jié)果及外周血流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，判斷4種病毒在小鼠體內(nèi)都能激起免疫反應(yīng)；Ad-SNP1組激起小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的能力最強(qiáng)；其次是Ad-SNP2、Ad-SNP3組，也有一定激起小鼠免疫反應(yīng)的能力；由于Ad-SNP4組僅在第1次給藥后2d（D2）血常規(guī)結(jié)果顯示體內(nèi)免疫升高，說明Ad-SNP4激起小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的能力最弱。

2.3Pan02-Q61H細(xì)胞構(gòu)建及藥效評價(jià)

2.3.1Pan02-Q61H細(xì)胞構(gòu)建及驗(yàn)證 本研究采用Pan02細(xì)胞進(jìn)行比較分析4種病毒對于移植瘤模型的免疫殺傷作用。本研究首先檢測了Pan02細(xì)胞是否含有Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4中的KRASQ61H突變位點(diǎn)。測序結(jié)果顯示，Pan02不含有KRASQ61H突變位點(diǎn)（圖4（a））。進(jìn)一步，本研究使用含有Q61H突變的KRAS基因的慢病毒進(jìn)行感染，獲得Pan02-Q61H細(xì)胞系。結(jié)果顯示，慢病毒感染Pan02細(xì)胞并用嘌呤霉素篩選后，在熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的綠色熒光（圖4（b））。流式細(xì)胞檢測表明89.32%的Pan02細(xì)胞成功被慢病毒感染（圖4（c）、（d））。

進(jìn)一步，本研究對構(gòu)建好的細(xì)胞系進(jìn)行了鑒定。分別提取未感染Pan02細(xì)胞（Pan02-NC）與Pan02-Q61H細(xì)胞的mRNA，并進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示。KRASQ61H能夠在Pan02-Q61H細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)量是未感染Pan02細(xì)胞的378703倍（圖5（a），Plt;0.001）。測序結(jié)果顯示，KRASQ61H突變成功插入Pan02-Q61H細(xì)胞（圖5（b））。蛋白水平分析顯示，KRASQ61H在Pan02細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)（圖5（c）、（d），Plt;0.01）。

綜上所述，從多角度證明了慢病毒感染Pan02細(xì)胞系成功構(gòu)建含有KRASQ61H突變位點(diǎn)的Pan02-Q61H多克隆細(xì)胞系。

2.3.24種病毒在Pan02-Q61H誘導(dǎo)的胰腺癌模型中的藥效評價(jià) 為了進(jìn)一步確認(rèn)4種病毒在體內(nèi)對于Pan02-Q61H細(xì)胞的免疫殺傷作用，將Pan02-Q61H細(xì)胞以8×105個(gè)細(xì)胞量皮下注射，接種于C57BL/6小鼠的背部（n=7），誘導(dǎo)胰腺癌移植瘤模型（圖6（a））。在細(xì)胞注射第8d進(jìn)行藥物治療。

本研究中，Ad-SNP1處理組可見皮下腫瘤大小始終處于較低水平，與未給藥組相比能顯著抑制腫瘤的生長速度（圖6（b），Plt;0.05），而從D11開始Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4及對照組腫瘤均開始顯著增長。Ad-SNP3、Ad-SNP4組與對照組相比能抑制腫瘤生長速度（圖6（b）），但不存在顯著性差異（圖6（c），Pgt;0.05），而Ad-SNP2組抑制腫瘤生長效果較差（圖6（c），Pgt;0.05）。研究終點(diǎn)處死小鼠，取腫瘤組織記錄終點(diǎn)處腫瘤質(zhì)量及體積并拍攝腫瘤終點(diǎn)圖片（圖6（e）），結(jié)果顯示終點(diǎn)處Ad-SNP1組每只小鼠體內(nèi)的腫瘤質(zhì)量及體積均顯著小于對照組（圖6（c）、（d），Plt;0.05），Ad-SNP3、SNP4組腫瘤終點(diǎn)質(zhì)量及體積也小于對照組，但不存在顯著差異（圖6（c）、（d），Pgt;0.05），而Ad-SNP2組腫瘤終點(diǎn)質(zhì)量及體積均大于對照組（圖6（c）、（d），Pgt;0.05），顯示Ad-SNP2沒有發(fā)揮腫瘤抑制作用。綜合腫瘤生長情況表明，Ad-SNP1有顯著的腫瘤抑制作用，Ad-SNP3和Ad-SNP4的對腫瘤的抑制作用較差，而Ad-SNP2沒有腫瘤抑制作用。一項(xiàng)臨床研究同樣表明，通過聯(lián)合注射合成突變RAS肽和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對胰腺癌患者進(jìn)行免疫誘導(dǎo)治療，能夠延長對肽疫苗有免疫應(yīng)答癌癥患者的生存期[28]。

本研究通過檢測小鼠腫瘤組織中CD3+、CD8+、CD28+T細(xì)胞表達(dá)情況判斷藥物激起小鼠體內(nèi)免疫情況，取小鼠終點(diǎn)腫瘤組織提RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測CD3+、CD8+、CD28+T細(xì)胞表達(dá)情況（圖6（f）～（h）），結(jié)果表明Ad-SNP1組腫瘤組織中免疫相關(guān)的CD3+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)（Plt;0.05），同時(shí)與T細(xì)胞活化、增殖相關(guān)的CD28+T細(xì)胞的表達(dá)也顯著上調(diào)（Plt;0.05），而Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組腫瘤組織中CD3+、CD8+、CD28+T細(xì)胞的表達(dá)與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05）。這證明給藥后藥物通過激起了小鼠體內(nèi)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)從而抑制腫瘤生長。Gjertsen等[28]的研究也表明，對接種了含有突變Ras肽疫苗后的患者進(jìn)行腫瘤活檢中，腫瘤組織中存在針對Ras突變的特異性T細(xì)胞，同時(shí)研究表明生存時(shí)間與疫苗免疫應(yīng)答之間存在顯著關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步，本研究將腫瘤組織切片后進(jìn)行免疫熒光染色，從蛋白層面分析腫瘤組織中CD4+T以及CD8+T細(xì)胞免疫浸潤情況。免疫熒光結(jié)果（圖7（a）、圖7（c）～（d））顯示Ad-SNP1組CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽性熒光信號明顯高于對照組（Plt;0.001）；而Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組與對照組相比CD4+、CD8+T細(xì)胞的陽性熒光信號無顯著性差異（Pgt;0.05），免疫熒光的結(jié)果跟RT-qPCR的趨勢一致。CD11B是整合素CR3（也叫補(bǔ)體受體3）的α鏈，主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞上，研究表明浸潤的中性粒細(xì)胞上CD11B表達(dá)水平升高，抗腫瘤活性增強(qiáng)[32]。于是本研究又將Ad-SNP1組的腫瘤組織切片進(jìn)行了CD11B免疫熒光染色（圖7（b）、（e）），發(fā)現(xiàn)Ad-SNP1組腫瘤組織中與腫瘤細(xì)胞殺傷相關(guān)的CD11B+細(xì)胞浸潤也有顯著提升（Plt;0.05），進(jìn)一步證明了Ad-SNP1通過激起強(qiáng)烈免疫從而抑制腫瘤生長。

3結(jié)論

通過基因治療的方式增加抗原負(fù)荷從而激起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)達(dá)到抑制腫瘤生長可行，同時(shí)本文從4種表達(dá)載體中篩選出了效果最好的Ad-SNP1表達(dá)載體，Ad-SNP1載體在免疫實(shí)驗(yàn)中激起小鼠免疫反應(yīng)的能力是最強(qiáng)的，同時(shí)在移植瘤模型中顯示出較好的腫瘤抑制作用，且Ad-SNP1載體在小鼠腫瘤組織的相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤也明顯高于對照組及其他3組，因此從4種病毒中篩選出藥效最好的Ad-SNP1載體藥物用于后續(xù)進(jìn)一步的研究，為胰腺癌治療藥物的開發(fā)提供新的可能。

本文構(gòu)建的Ad-SNP1載體藥物是針對KRASQ61H突變型癌癥的一種主動(dòng)免疫治療方法，可以克服小分子藥物難以與KRAS的疏水口袋結(jié)合的問題和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的分離和制備困難的問題。主動(dòng)免疫治療相較于其他幾種療法有相對較少的副作用，對靶腫瘤細(xì)胞具有特異性，以及對腫瘤特異性抗原產(chǎn)生持久的記憶反應(yīng)等幾種主要優(yōu)勢。同時(shí)KRASQ61H突變還常見于肺癌及結(jié)腸癌中，故Ad-SNP1還可用于其他多種含有KRASQ61H突變的癌癥治療，為更多含有KRASQ61H突變的癌癥患者帶來新的希望。