延長(zhǎng)鹽單胞菌生產(chǎn)依克多因高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

關(guān)鍵詞：延長(zhǎng)鹽單胞菌；合成培養(yǎng)基；高細(xì)胞密度培養(yǎng)；依克多因；鹽沖擊

依克多因（Ectoine，1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-羧酸）為天冬氨酸的衍生物，是嗜鹽菌在極端環(huán)境中合成的產(chǎn)物。依克多因可以提高膜脂表面的水合作用力，維持細(xì)胞新陳代謝所需的胞質(zhì)空間和正常細(xì)胞形態(tài)[1-5]，除此以外該物質(zhì)在皮膚細(xì)胞的保護(hù)和穩(wěn)定方面具有良好功效[6]。目前，依克多因作為一種高價(jià)值的化合物被廣泛應(yīng)用在化妝品、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域，它可以通過(guò)化學(xué)合成和生物發(fā)酵的方法得到，前體的高成本及合成過(guò)程中可能帶來(lái)的環(huán)境污染使得化學(xué)方法在工業(yè)化生產(chǎn)中不具優(yōu)勢(shì)[7]。因此，生物發(fā)酵生產(chǎn)依克多因已成為主要生產(chǎn)方式，其中延長(zhǎng)鹽單胞菌（Halomonaselongata）是主要的工業(yè)生產(chǎn)菌株[8-10]。延長(zhǎng)鹽單胞菌H.elongataDSM2581T屬于中度嗜鹽菌，能夠在高鹽環(huán)境下快速生長(zhǎng)，原因在于胞內(nèi)積累大量的依克多因來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡[11-13]。

許多研究致力于優(yōu)化生物合成的方法，設(shè)計(jì)了許多提高依克多因產(chǎn)量的方法，如“細(xì)菌擠奶”工藝[14]。同時(shí)，代謝工程也為提高依克多因產(chǎn)量作出了貢獻(xiàn)，如Ning等[15]構(gòu)建了在低鹽濃度下高效生產(chǎn)依克多因的大腸桿菌菌株?；虿倏叵碌牧u化酶的缺失，也會(huì)減少依克多因的羥基化而提高依克多因的產(chǎn)量[16]。如何有效地控制微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成，提高發(fā)酵生產(chǎn)水平是生產(chǎn)下游環(huán)節(jié)的重點(diǎn)。發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化依然是突破生產(chǎn)瓶頸的關(guān)鍵，Salman[17]和Chen等[18]都通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件成功地提高了淀粉酶和依克多因的生產(chǎn)水平。利用能夠精準(zhǔn)調(diào)控合成培養(yǎng)基，高效快速地生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的依克多因，是實(shí)現(xiàn)依克多因低成本生產(chǎn)的途徑之一。

依克多因的詳細(xì)生物合成機(jī)制迄今還未完全闡明，研究其中的合成機(jī)制及調(diào)節(jié)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)具有巨大的商業(yè)價(jià)值。高細(xì)胞密度發(fā)酵（HighCellDensityFermentation，HCDF）在工業(yè)生產(chǎn)上是用來(lái)增加產(chǎn)量的常用方法[19]。利用合成培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高細(xì)胞密度發(fā)酵，兼顧高鹽濃度培養(yǎng)基可以刺激依克多因生物合成的特點(diǎn)[20-21]，建立H.elongataDSM2581T的高密度培養(yǎng)有效提升依克多因產(chǎn)量的新工藝，為其工業(yè)化規(guī)模的低成本生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

本研究考察并優(yōu)化了影響H.elongataDSM2581T依克多因發(fā)酵的全合成培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及添加濃度，并在5L發(fā)酵罐水平考察了H.elongata在全合成培養(yǎng)基中的發(fā)酵代謝情況；基于優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基協(xié)同鹽脅迫工藝對(duì)延長(zhǎng)鹽單胞菌進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng)，最終獲得高于已報(bào)道的天然微生物生產(chǎn)依克多因的產(chǎn)量，并且獲得高生產(chǎn)速率的發(fā)酵效果。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1原料和試劑

1.1.1出發(fā)菌株 實(shí)驗(yàn)菌種延長(zhǎng)鹽單胞菌H.DSM2581T，屬于中度嗜鹽菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，由中國(guó)科學(xué)院微生物所提供。

1.1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

（1）菌種活化培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.00、酵母粉5.00、氯化鈉80.00、瓊脂16.00，pH7.00±0.10。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5.00、蛋白胨10.00、氯化鈉80.00、pH7.00±0.10。

（3）M63培養(yǎng)基按照Fatollahi等[22]描述的方法配制；PTM1微量元素溶液按照Charoenrat等[23]等描述的方法配制。

1.2測(cè)試與表征

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 SBA-40E型生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；pH計(jì)（梅特勒-托利多）；GZX-9420MBE型鼓風(fēng)烘箱（華連醫(yī)療器械）；5L生物反應(yīng)器（上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司）；LC-2010A型高效液相色譜（日本島津公司）；YXQ-LB-100SII型壓力蒸汽滅菌器（BOXUN）；FA1004型電子天平（上海良平儀器分析儀表有限公司）；ZWYC-2933型智城恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；VARIOSKANLUX型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2.2檢測(cè)方法

（1）生物量檢測(cè)方法：利用酶標(biāo)儀在低振蕩、600nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值（OD600）；菌體干重（DryCellWeight，DCW）：發(fā)酵液離心棄上清，取沉淀于90℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)重，將細(xì)胞干重與菌液吸光度值作線性擬合，得DCW=0.425×OD600。

（2）葡萄糖濃度檢測(cè)方法：發(fā)酵液離心取上清進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?jīng)0.22μm水系膜過(guò)濾后由生物分析傳感器測(cè)量。

（3）依克多因含量檢測(cè)方法：取發(fā)酵液經(jīng)超純水稀釋3倍后，加入玻璃研磨珠在冷凍研磨機(jī)中于65Hz條件下研磨30min。取出后經(jīng)過(guò)12000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min去沉淀，上清經(jīng)0.22μm水系膜過(guò)濾保存至液相小瓶，待測(cè)。依克多因通過(guò)島津HPLC檢測(cè)，使用SB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Agilent公司），流動(dòng)相為水∶乙腈（體積比為98∶2），恒定流速0.5mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)器為SPD-20AV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm[24]。

1.2.3動(dòng)力學(xué)計(jì)算 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)可以將復(fù)雜的細(xì)胞代謝過(guò)程用簡(jiǎn)明的方式展現(xiàn)出來(lái)[25-26]，本文采用式（1）擬合H.elongata的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。

其中，X、X0和Xm分別代表菌體質(zhì)量濃度、初始菌體質(zhì)量濃度和最大菌體質(zhì)量濃度（g/L），μm代表最大比生長(zhǎng)率（h?1），t代表發(fā)酵時(shí)間（h）。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 采用DesignExpert8.06軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，CentralCompositeDesign采用Origin2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS的ANOVATuckypost-hoc檢驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1搖瓶培養(yǎng) 將種子液按10%的接種量接入裝有45mL培養(yǎng)基的250mL擋板搖瓶中，于37℃、225r/min培養(yǎng)12h。

1.3.2反應(yīng)器培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)采用5L體系發(fā)酵罐，裝液量為3L。高壓濕熱滅菌后按10%的接種量進(jìn)行接種。通氣量為1vvm，轉(zhuǎn)速為600r/min，罐壓控制為0.05MPa，溫度為37℃。發(fā)酵過(guò)程每間隔1h取樣，檢測(cè)生物量、依克多因含量和殘?zhí)菨舛鹊葏?shù)。

2結(jié)果與討論

2.1合成培養(yǎng)基優(yōu)選

2.1.1碳源篩選實(shí)驗(yàn) 碳源是細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是生物合成、維持生命活動(dòng)的能量來(lái)源[27]。不同的碳源對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝的影響不同，易利用的碳源可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝。本研究考察了不同碳源種類(lèi)（葡萄糖、檸檬酸鈉、乳糖、甘露糖、木糖、蔗糖、海藻糖）對(duì)H.elongataDSM2581T生長(zhǎng)的影響，利用多工位反應(yīng)器進(jìn)行碳源篩選實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)20h后測(cè)定生物量，結(jié)果如圖1所示。在不同碳源下延長(zhǎng)鹽單胞菌H.elongata均可以生長(zhǎng)，說(shuō)明H.elongata具有廣泛的碳源底物譜，胞內(nèi)存在利用多種碳源的酶系。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中獲得的生物量最多，其次是檸檬酸鈉，可見(jiàn)兩種物質(zhì)都是有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源。而甘露糖、乳糖為碳源的培養(yǎng)基中生物量明顯低于其他組別。

2.1.2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 有研究[28]發(fā)現(xiàn)在較高鹽濃度（gt;10g/L）下H.elongataDSM2581T的產(chǎn)物合成為生長(zhǎng)相關(guān)型?；诖税l(fā)現(xiàn)，在優(yōu)選營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)程中，當(dāng)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)選擇以生物量為指標(biāo)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖10g/L；PTM11mL/L；氯化鈉60g/L）上利用Design-Expert8.06Trial軟件包統(tǒng)計(jì)學(xué)工具箱實(shí)施n=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了合成培養(yǎng)基中的檸檬酸鈉、氯化銨、磷酸氫二鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳8個(gè)成分對(duì)延長(zhǎng)鹽單胞菌生長(zhǎng)的影響。利用250mL搖瓶培養(yǎng)10h后測(cè)定OD600，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，評(píng)價(jià)指標(biāo)為生物量。每組設(shè)置3組平行。

經(jīng)軟件分析得到各培養(yǎng)基成分對(duì)生物量（Y）影響的擬合方程，Y=3.73?0.091A+0.21B+0.085C?0.041D+0.088E?0.090F?0.13G?0.035H。因?yàn)閜值為0.0212（lt;0.05），表明對(duì)于生物量評(píng)分所建立的回歸方程顯著。氯化銨的p值0.0046lt;0.01，表明氯化銨是影響生物量的極顯著因素。研究指出氮源對(duì)提高生物量和依克多因生產(chǎn)率具有重要意義[20]。檸檬酸鈉、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂的p值小于0.05，表明這些物質(zhì)也是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著因素。Plackett-Burma實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析后確定了以上幾種培養(yǎng)基成分的最佳添加質(zhì)量濃度為：硫酸鈉2.50g/L，七水合硫酸鎂3.00g/L，硫酸鋅0.25g/L，硫酸錳0.09g/L，十二水磷酸氫二鈉7.50g/L。

2.1.3CentralCompositeDesign實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

研究表明鹽濃度是影響依克多因合成的重要因素[29-30]。由本實(shí)驗(yàn)篩選出的影響延長(zhǎng)鹽單胞菌生長(zhǎng)顯著的因素：檸檬酸鈉（X1）和氯化銨（X2），將其與促進(jìn)依克多因合成的主要因素氯化鈉（X3）相結(jié)合。通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)考察這3種因素對(duì)延長(zhǎng)鹽單胞菌生長(zhǎng)（生物量Y1）和依克多因合成（依克多因產(chǎn)量Y2）的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行，各因素及水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，分析結(jié)果見(jiàn)表4。為了預(yù)測(cè)最佳點(diǎn)，運(yùn)用DesignExpert8.06軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和二次多項(xiàng)回歸擬合，得到以生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成為指標(biāo)的多元二次回歸方程：Y1=8.48+0.13X1?0.21X2?0.084X3?0.059X1X2+0.24X2X3?0.32X2X3?1.59X12?1.53X22?1.54X32；Y2=620.99+9.02X1+15.74X2+44.39X3+34.89X1X2?4.82X1X3?17.98X2X3?95.16X12?110.30X22?139.20X32。以Y1為響應(yīng)值的模型決定系數(shù)R2=0.9789，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9599，plt;0.0001，模型高度顯著。以Y2為響應(yīng)值的模型決定系數(shù)R2=0.9809，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9636，plt;0.0001，模型高度顯著。X12、X22、X32的p均小于0.0001，說(shuō)明因素X1、X2、X3對(duì)生物量和依克多因產(chǎn)量的影響都極顯著，因素X3對(duì)依克多因產(chǎn)量影響極顯著，X1X2兩兩相交效應(yīng)對(duì)依克多因產(chǎn)量影響顯著。

各因素的響應(yīng)面等值線圖如圖2所示，3個(gè)響應(yīng)面的等高線中心都在設(shè)定的范圍內(nèi)，表明在設(shè)計(jì)的因素水平內(nèi)存在最優(yōu)設(shè)計(jì)條件。由圖2可知，三維響應(yīng)曲面呈弧形，檸檬酸鈉、氯化銨、氯化鈉呈兩兩間交互作用，分別固定檸檬酸鈉、氯化銨、氯化鈉，生物量和依克多因產(chǎn)量隨著另外兩個(gè)因素取值的增大先升高后降低，曲面頂點(diǎn)即為生物量和依克多因產(chǎn)量最高點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的最優(yōu)因素添加質(zhì)量濃度。當(dāng)氯化鈉處于中心水平時(shí)，檸檬酸鈉和氯化銨對(duì)依克多因產(chǎn)量影響較大，響應(yīng)面坡度較陡。

由以上實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)化添加質(zhì)量濃度為：檸檬酸鈉3g/L，氯化銨3g/L，氯化鈉80g/L。經(jīng)過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在最優(yōu)條件下培養(yǎng)基中得到的生物量OD600和依克多因產(chǎn)量分別為8.48和618.70mg/L，與預(yù)測(cè)值一致，證明該模型較為合理。

2.2延長(zhǎng)鹽單胞菌產(chǎn)依克多因的發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1批發(fā)酵工藝 在5L罐的發(fā)酵中，對(duì)優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基（HE9）進(jìn)行延長(zhǎng)鹽單胞菌的發(fā)酵過(guò)程代謝參數(shù)考察，結(jié)果如圖3所示。在添加葡萄糖20g/L的條件下菌體OD600最高可達(dá)到26.60，依克多因產(chǎn)量為2.00g/L，對(duì)比搖瓶發(fā)酵結(jié)果均有明顯的提高。利用Logistic方程擬合菌體的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)果表明在優(yōu)化的全合成培養(yǎng)基HE9中延長(zhǎng)鹽單胞菌的μm可達(dá)到0.49h?1。有研究表明H.elongataDSM2581T在鹽質(zhì)量濃度為80g/L的復(fù)合培養(yǎng)基條件下μm為0.65h?1[28]，約為HE9培養(yǎng)基所達(dá)到μm的1.3倍。

從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，菌體生長(zhǎng)經(jīng)歷短暫的延滯期后進(jìn)入菌體快速生長(zhǎng)的指數(shù)期，依克多因進(jìn)入快速合成階段與菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期重合，這與之前報(bào)道的H.elongataDSM2581T在氯化鈉質(zhì)量濃度為80g/L時(shí)依克多因合成是一個(gè)高度耦合生長(zhǎng)過(guò)程的結(jié)果一致[28]。碳源的變化情況表現(xiàn)為：發(fā)酵前5h碳源消耗較慢，僅僅消耗了17.50%的葡萄糖；隨著細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，葡萄糖消耗速度顯著增加，pH開(kāi)始快速下降，通過(guò)氨水調(diào)節(jié)pH值在6.5左右至發(fā)酵結(jié)束。CO2釋放率（Carbon-dioxideEscapeRate，CER）總體呈現(xiàn)與菌體生長(zhǎng)的一致趨勢(shì)。隨著分批培養(yǎng)葡萄糖的耗盡，菌體生長(zhǎng)和依克多因的合成出現(xiàn)停滯。

2.2.2分批補(bǔ)料發(fā)酵 為了進(jìn)一步提升菌體的生物量和依克多因的合成，在優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研究了連續(xù)流加葡萄糖的延長(zhǎng)鹽單胞菌高密度培養(yǎng)工藝。發(fā)酵培養(yǎng)7h后流加葡萄糖溶液，利用發(fā)酵液殘?zhí)菨舛确答佌{(diào)整葡萄糖溶液流加速率；利用氨水進(jìn)行pH調(diào)控和氮元素補(bǔ)充，發(fā)酵過(guò)程各曲線如圖4所示。發(fā)酵培養(yǎng)34h時(shí)，OD600最高可達(dá)到191，依克多因產(chǎn)量達(dá)到11.05g/L（圖4（a）），菌體氧攝取速率（OxygenUptakeRate，OUR）最高達(dá)到220mmol/（L·h）（圖4（b））。與批式發(fā)酵相比，最高OD600和依克多因產(chǎn)量分別為批發(fā)酵結(jié)果的7.18倍和5.53倍。發(fā)酵中期觀察到菌體生長(zhǎng)緩慢、OUR持平的現(xiàn)象，在發(fā)酵20h時(shí)補(bǔ)充2g/L的磷酸氫二鉀，隨后菌體生長(zhǎng)速率和OUR增加速率明顯加快。磷酸鹽含量顯著影響工程大腸桿菌和嗜鹽生物的生物量和依克多因產(chǎn)量[18，31]，說(shuō)明這段生長(zhǎng)的緩慢期可能是由于HE9培養(yǎng)基中磷元素不足導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受限。對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的生理代謝參數(shù)（表5）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后期依克多因產(chǎn)率明顯下降的現(xiàn)象（圖4（c）），遠(yuǎn)低于理論最大產(chǎn)率[32]。補(bǔ)料過(guò)程中持續(xù)葡萄糖和氨水的補(bǔ)入會(huì)導(dǎo)致鹽濃度的逐步下降，從而影響依克多因的合成，這可能是導(dǎo)致發(fā)酵后期比產(chǎn)率低的重要原因。

2.2.3鹽梯度脅迫促進(jìn)依克多因合成的優(yōu)化控制工藝 為改善高密度培養(yǎng)發(fā)酵后期出現(xiàn)的菌體生長(zhǎng)緩慢和依克多因轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，進(jìn)一步對(duì)HE9合成培養(yǎng)基中磷源濃度進(jìn)行優(yōu)化，并與鹽梯度沖擊控制相結(jié)合，以達(dá)到促進(jìn)依克多因的快速生成。在發(fā)酵過(guò)程的指數(shù)期（8h）進(jìn)行鹽梯度沖擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5、表6所示。在指數(shù)生長(zhǎng)中期利用一次性補(bǔ)加的方式將發(fā)酵液中氯化鈉的質(zhì)量濃度從80g/L補(bǔ)充到130g/L（圖5（a））。OUR在鹽沖擊后有短暫的下降，隨后維持著快速增加的趨勢(shì)，最高達(dá)到209.84mmol/（L·h）（圖5（b））。發(fā)酵13h后OD600達(dá)到169.3，依克多因產(chǎn)量為20g/L。與優(yōu)化前的工藝相比，依克多因產(chǎn)量提高了81%。依克多因合成速率在進(jìn)行鹽梯度沖擊（8h）后顯著增加（圖5（d）），最大達(dá)到了5.5g/（L·h）。圖5（c）所示的依克多因比產(chǎn)率的結(jié)果也表明在鹽梯度沖擊的過(guò)程中，發(fā)酵10h時(shí)的比產(chǎn)率（0.086g/（g·h））顯著高于分批補(bǔ)料發(fā)酵最高的比產(chǎn)率（0.016g/（g·h）），說(shuō)明鹽梯度沖擊能夠有效地促進(jìn)依克多因的合成，而且優(yōu)化后發(fā)酵時(shí)間顯著縮短。

本研究中發(fā)現(xiàn)在搖瓶中生產(chǎn)依克多因的最佳鹽質(zhì)量濃度為80g/L。有研究利用動(dòng)力學(xué)模型對(duì)不同鹽濃度下H.elongataDSM2581T菌體生長(zhǎng)和依克多因生物合成進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)：當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度低于80g/L時(shí)，H.elongataDSM2581T的依克多因的生物合成速率隨著氯化鈉質(zhì)量濃度的增加而增加[33]。但過(guò)高的鹽濃度超過(guò)了細(xì)胞的耐受水平，反而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[28，34]。因此本研究利用不同鹽濃度的培養(yǎng)基分階段進(jìn)行依克多因生物合成：在前期，80g/L的鹽質(zhì)量濃度可以給細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段采取提高鹽質(zhì)量濃度的方式進(jìn)入刺激依克多因合成階段。

在合成培養(yǎng)基上結(jié)合連續(xù)補(bǔ)料，鹽梯度沖擊工藝進(jìn)行高密度細(xì)胞密度發(fā)酵，可以獲得OD600為169.3，依克多因產(chǎn)量為20g/L的結(jié)果。與目前已報(bào)道的嗜鹽菌底盤(pán)的依克多因生產(chǎn)結(jié)果（表7）相比，本研究?jī)?yōu)化后的依克多因的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率與之相比具有極大的優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了20g/L，比其他嗜鹽菌的最高發(fā)酵水平（14.86g/L）[37]提高了34.5%。尤其是依克多因的合成速率達(dá)到了1.54g/（L·h），遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)中的報(bào)道水平。

3結(jié)論

本研究首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了不同碳源對(duì)H.elongataDSM2581T菌體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示葡萄糖是最佳碳源。通過(guò)Plackett-Burman考察了培養(yǎng)基中各組分的濃度對(duì)生物量的影響，結(jié)果表明顯著因素為檸檬酸鈉和氯化銨。利用CentralCompositeDesign進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)基，最終確定檸檬酸鈉3g/L，氯化銨3g/L，氯化鈉80g/L?；趦?yōu)化后的全合成培養(yǎng)基，進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料和指數(shù)中期鹽梯度式?jīng)_擊的發(fā)酵工藝研究，最終獲得的細(xì)胞量的OD600約為169.3，依克多因產(chǎn)量和依克多因合成速率分別達(dá)到20g/L和1.54g/（L·h）。這說(shuō)明在該合成培養(yǎng)基上聯(lián)合連續(xù)補(bǔ)料和指數(shù)期鹽梯度沖擊進(jìn)行高密度培養(yǎng)的可行性，為高效合成依克多因的發(fā)酵工藝提供了數(shù)據(jù)支撐。