RNA干擾沉默褐飛虱糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因4的研究

摘要：褐飛虱是水稻上危害最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，目前的防治措施存在各種弊端，開(kāi)展控制褐飛虱的探索研究可開(kāi)辟新的防治途徑。本研究利用dsRNA（douhle-stranded RNA，雙鏈RNA）介導(dǎo)的RNAi（RNA interfer-ence，RNA干擾）技術(shù)，以褐飛虱糖運(yùn)輸?shù)鞍谆颍∕st4）為靶標(biāo)，在體外合成Nlst4的dsRNA，將其飼喂褐飛虱若蟲(chóng)后，其體內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)量顯著下降，產(chǎn)生致死表型；構(gòu)建Ntst4的RNAi干擾載體，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化培育轉(zhuǎn)基因水稻，褐飛虱取食后，體內(nèi)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，1齡、2齡若蟲(chóng)發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)，但未出現(xiàn)致死表型。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，利用RiVAi技術(shù)通過(guò)培育轉(zhuǎn)基因水稻防治褐飛虱存在可行性，可為后續(xù)轉(zhuǎn)基因抗褐飛虱水稻的培育提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：褐飛虱；RNA干擾；糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因4；人工飼喂；轉(zhuǎn)基因水稻

中圖分類號(hào)：S433.3；Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025）01-0022-08

褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）屬半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae），為單食性害蟲(chóng)，只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代，通過(guò)刺吸取食水稻植株?duì)I養(yǎng)以及傳播草狀叢矮病和齒葉矮縮病等水稻病毒病等方式進(jìn)行為害，是水稻上危害最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一。褐飛虱種群具有繁殖能力強(qiáng)、可遷飛的特點(diǎn)，防治措施仍以化學(xué)防治為主，導(dǎo)致褐飛虱抗藥性、環(huán)境污染等問(wèn)題日益加劇，因此，迫切需要發(fā)展新的防治措施來(lái)防治褐飛虱。

dsRNA（double-stranded RNA，雙鏈RNA）介導(dǎo)的RNAi（RNA intederence，RNA干擾）技術(shù)首次在秀麗線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)而被廣泛關(guān)注，之后作為基因功能研究的重要手段而被廣泛應(yīng)用。隨著RNAi干擾技術(shù)的不斷完善，其在害蟲(chóng)防治研究中取得重要進(jìn)展，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育表達(dá)產(chǎn)生目標(biāo)基因的dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)進(jìn)行防治的目的。例如，Baum等通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得了可表達(dá)AT-Pase A基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)玉米根螢葉甲有良好的防治效果。Mao等培育出可表達(dá)P450（ CYP6AE14）基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花，可明顯抑制鱗翅目害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育可表達(dá)產(chǎn)生目標(biāo)基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)中目標(biāo)基因功能進(jìn)行干擾從而達(dá)到防治目的已成為可能。

利用RNAi技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行目標(biāo)基因的調(diào)控以達(dá)到防治褐飛虱的目的，關(guān)鍵在于選擇合適的目標(biāo)基因。飼喂法是褐飛虱通過(guò)口針攝取體外合成的dsRNA，它可以很好地模擬褐飛虱自然取食的效果，是篩選目標(biāo)基因培育轉(zhuǎn)基因水稻防治褐飛虱等刺吸性害蟲(chóng)的最佳方法。目前，大部分的研究主要集中在對(duì)褐飛虱基因的功能驗(yàn)證方面，僅有少數(shù)研究者通過(guò)培育轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)目標(biāo)基因dsRNA，來(lái)驗(yàn)證此方法對(duì)褐飛虱防治的作用是否顯著。Zha等采用RNAi技術(shù)，以NLHTl（hexose transporter gene）等3個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)基因培育轉(zhuǎn)基因水稻，發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，但未發(fā)現(xiàn)褐飛虱表型的明顯變化。陸琳等以a-l鏈微管蛋白-dsl、微管蛋白特異的伴侶分子c-dsl0為干擾目標(biāo)培育轉(zhuǎn)基因水稻，進(jìn)行褐飛虱防治研究，結(jié)果顯示，取食轉(zhuǎn)基因植株后，部分蟲(chóng)體目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平下降顯著，但未觀察到蟲(chóng)體死亡現(xiàn)象。

在生物體內(nèi)，糖分不僅提供能量及碳源，而且在信號(hào)傳導(dǎo)和滲透過(guò)程也起著重要的作用。然而，糖分不能直接通過(guò)細(xì)胞膜，其在細(xì)胞間或者亞細(xì)胞之間交換需要糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。褐飛虱主要糖分能量來(lái)源于水稻韌皮部汁液，褐飛虱取食的蔗糖不能直接穿過(guò)中腸上皮細(xì)胞而被吸收利用，需在腸內(nèi)水解為葡萄糖和果糖經(jīng)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至血淋巴中才能被吸收利用，因此糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在褐飛虱等刺吸性害蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用。Price等對(duì)預(yù)測(cè)的93個(gè)褐飛虱糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行鑒定，最終獲得18個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其中Nlstl、Nlst4、Nlst6、Nlst9、Ntst12、Nlst16及Ntst18在中腸高表達(dá)。褐飛虱糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因6（Nlst6）在將蔗糖水解產(chǎn)物葡萄糖、果糖轉(zhuǎn)運(yùn)至血淋巴被褐飛虱吸收利用過(guò)程中起著重要作用，NLst6下調(diào)對(duì)產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵期、產(chǎn)卵數(shù)量和體重等方面產(chǎn)生顯著影響。

本研究選取在褐飛虱中腸特異表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因4（sugar transporter 4，Nlst4，GenBank accession：AB549997.1）為研究對(duì)象，利用飼喂法進(jìn)行RNAi的研究，了解褐飛虱取食外源合成目標(biāo)基因dsRNA后的生長(zhǎng)發(fā)育狀況：構(gòu)建基因Ntst4的RNAi載體，用獲得的可表達(dá)Nlst4 dsRNA的轉(zhuǎn)基因材料飼喂褐飛虱，研究褐飛虱體內(nèi)目標(biāo)基因Nls4的表達(dá)及褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育變化情況，探索防治褐飛虱的新途徑。