反季節(jié)雛鵝大腸埃希菌病的細菌分離鑒定、毒力基因與耐藥性分析

摘要：為鑒定安徽某鵝場反季節(jié)雛鵝發(fā)生早期漿膜炎的病原菌及分析其毒力基因和耐藥性情況，本研究對病死雛鵝肝組織進行細菌分離培養(yǎng)，采用染色鏡檢、16SrRNA測序鑒定、毒力基因檢測及藥物敏感試驗開展細菌相關特性鑒定。本研究分離的致病性大腸埃希菌攜帶多種毒力基因且具有廣泛的耐藥性，養(yǎng)殖反季節(jié)鵝應注重科學防控大腸埃希菌病。

關鍵詞：反季節(jié)；雛鵝；大腸埃希菌；毒力基因；耐藥性

鵝大腸埃希菌（Escherichia coli， E.coli）某些致病性菌株引起鵝不同類型疾病的總稱，臨床常表現(xiàn)為腸炎、敗血癥、漿膜炎、腫頭綜合征、卵黃性腹膜炎、種蛋受精率和出雛率下降等病癥，主要侵害雛鵝和產蛋母鵝[1]。大腸埃希菌雖為條件性致病菌，但是幼齡動物、動物機體防御機能下降、交配和產蛋應激等因素均可使條件性致病E.coli在鵝群中發(fā)病和流行。反季節(jié)鵝養(yǎng)殖是利用現(xiàn)代技術進行舍內養(yǎng)殖小環(huán)境的改變，刺激種鵝在夏秋季休產期進行生產的一種生產方式[2]。然而，大腸埃希菌病多發(fā)于高溫的夏秋季節(jié)，其對反季節(jié)鵝養(yǎng)殖威脅更大，且相關研究較少。因此，需對致病性E.coli進行分離和相關特性研究，為科學防控反季節(jié)鵝大腸埃希菌病提供切實依據(jù)。本研究對4日齡反季節(jié)鵝群分離出致病性E.coli，并鑒定了毒力基因和耐藥性情況，為鵝場提供了科學防控指導。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自青島海博生物技術有限公司，小牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，BioSmart U+ All Powerful Multiple Probe qPCR PreMix擴增試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 病鵝臨床癥狀與剖檢癥狀

發(fā)病鵝來源于安徽蚌埠市某鵝場飼養(yǎng)的反季節(jié)三花鵝，2日齡時有零星死亡，4日齡時死亡率達7%，病鵝肛周有污穢，排黃綠色稀糞。剖檢顯示肝臟有出血和白色壞死點，部分鵝肝臟有輕度包膜增厚，部分心包腔內有纖維素性滲出物，胰腺大量白色壞死點，脾臟有白色壞死點。

1.3 細菌分離培養(yǎng)與鏡檢

取2份鵝肝組織在含5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基上劃線接種，采用燭缸法于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。采用革蘭氏染色法對分離菌進行染色鏡檢。另外，對肝組織檢測鵝的8種病毒（禽流感病毒、新城疫病毒、水禽黃病毒、水禽呼腸孤病毒、鵝1型星狀病毒、鵝2型星狀病毒、小鵝瘟病毒和禽腺病毒）結果均為陰性。

1.4 分離菌的16S rRNA鑒定

采用煮沸法提取分離菌核酸。參考細菌16S rRNA基因通用引物，引物序列為27F：5’-AGAGTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-CTCGTGGCGTCTTCTGTCCC-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。按BioSmart U+ All Powerful Multiple Probe qPCR PreMix擴增試劑盒說明配制反應體系，PCR反應總體積為50μL，上、下游引物各1μL，模板3μL。PCR反應程序為：94℃條件下預變性5min；94 ℃條件下變性30 s、55 ℃條件下退火30 s、72 ℃條件下延伸90 s，35個循環(huán)。PCR產物經凝膠電泳檢測并且切膠后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列在NCBI網站進行BLAST分析。

1.5 分離菌的毒力基因檢測

合成耶爾森（HPI）毒力島基因irp2、fyuA，腸脫落位點（LEE）毒力島基因eaeA，志賀毒素基因stx1、stx2，腸毒素STa，黏附素K99、FimC，共8對檢測引物，預期大小分別為552、302、981、413、953、555、824、497bp。按DNA擴增試劑盒說明配制反應體系，PCR反應總體積為20μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL。PCR反應程序為：94 ℃條件下預變性5 min；94 ℃條件下變性30 s、50-60 ℃條件下退火30 s、72 ℃條件下延伸45 s，33個循環(huán)。PCR產物經凝膠電泳和拍照觀察。

1.6 分離菌的藥敏試驗

對分離菌按照K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，將菌液涂布于含5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，并將十二類27種藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，于37 ℃條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，測量抑菌圈的直徑。根據(jù)《腸桿菌屬抑菌圈直徑（mm）判斷標準》對檢測結果進行敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

4日齡病死鵝肝臟有出血和白色壞死點，并有輕度包膜增厚，心包腔內有白色纖維素性滲出物。用該肝臟劃線接種培養(yǎng)基，分離菌在TSA培養(yǎng)基上形成表面光滑凸起、灰白色、圓形小菌落。革蘭氏染色鏡檢顯示分離菌為淡紅色的革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。

2.2 16S rRNA鑒定結果

分離菌的16S rRNA基因PCR擴增結果獲得了預期大小的1 466bp片段（圖2），將PCR擴增產物電泳切膠后送公司測序，BLAST分析顯示分離菌株與E.coli的16S rRNA基因序列同源性最高，達99%以上，因此該分離菌株屬于大腸埃希菌，并命名為AHBB2024株。

2.3 毒力基因檢測結果

毒力基因檢測結果顯示，共檢測到5個毒力基因（圖3），分別為HPI毒力島基因irp2、fyuA，志賀毒素基因stx2，腸毒素基因STa和黏附素基因FimC，指示該致病性大腸埃希菌攜帶多種毒力因子。

2.4 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，AHBB2024株致病性大腸桿菌多達21重耐藥，僅對亞胺培南、慶大霉素、丁胺卡那、氯霉素、氟苯尼考、多粘菌素B共6種藥物敏感，表現(xiàn)出較廣泛的耐藥性（表1）。

討論

我國是世界上商品鵝養(yǎng)殖和出欄量最多的國家，但大多數(shù)鵝場存在場地簡陋、養(yǎng)殖密度高、多種病原體污染、生物安全管理差等粗放養(yǎng)殖模式，這為條件性致病大腸桿菌提供了感染機會。同時，反季節(jié)鵝生長周期高溫高濕，細菌性疫病高發(fā)[4]。本研究反季節(jié)鵝在4日齡時已造成纖維滲出性漿膜炎，與鴨疫里默氏桿菌病存在發(fā)病時期不同，也指示早期漿膜炎可能為種蛋出雛階段形成早期感染和交叉感染造成，進而提示種鵝致病性大腸埃希菌病凈化防控的重要性。

鵝大腸埃希菌病的診斷主要結合臨床剖檢和實驗室分離鑒定方法，其中16S rRNA測序與序列分析已成為細菌分類和鑒定的一種有效手段[5]。本研究分離的AHBB2024菌株與大腸埃希菌的16S rRNA同源性高達99%，屬于大腸埃希菌種。大腸埃希菌的致病性與其所攜帶的毒力因子密切相關，AHBB2024菌株攜帶5種毒力基因，腸毒素STa基因指示該菌株可分泌對熱穩(wěn)定腸毒素，志賀毒素stx2基因指示該菌株可分泌類志賀毒素，1型菌毛黏附素FimC基因參與大腸埃希菌黏附于宿主黏膜和上皮表面，HPI毒力島irp2、fyuA基因是大腸埃希菌的攝鐵因子和重要的致病因素。

使用抗生素是治療大腸埃希菌病的有力手段，但應考慮病菌的耐藥性情況。依據(jù)藥敏檢測結果可為科學指導養(yǎng)殖企業(yè)（戶）用藥提供依據(jù)。本研究AHBB2024菌株達到21重耐藥，僅對27種藥物中的6種敏感，其中對β-內酰胺類多數(shù)抗生素耐藥性最強，僅第四代抗生素亞胺培南有效。殷鶴予等[6]對河北省唐秦地區(qū)蛋雞92株致病性大腸埃希菌耐藥性檢測，其對林可霉素、氨芐西林、阿莫西林、復方磺胺甲噁唑、四環(huán)素耐藥率較高，均在84.78%以上，本研究AHBB2024菌株對這些藥物也全部耐藥。崔笑博[7]對山東泰安周邊部分地區(qū)分離的78株禽致病E.coli進行耐藥性檢測，結果表明對紅霉素耐藥率96.2%，對氨芐西林耐藥率為92.4%，對環(huán)丙沙星耐藥率為82.27%，對鏈霉素耐藥率為74.68%，對復方新諾明耐藥率為91.1%，對氟苯尼考耐藥率為89.8%，對慶大霉素耐藥率為72.15%，然而，本研究AHBB2024菌株卻對氟苯尼考和慶大霉素敏感。因此，鵝場致病性大腸埃希菌不同菌株的耐藥性不同，獸醫(yī)應結合專業(yè)實驗室的細菌分離和耐藥性情況，同時也應鑒定是否混合感染其他病原，為反季節(jié)鵝養(yǎng)殖企業(yè)（戶）提供科學用藥指導和生物安全防控，避免無效用藥及產生更多的耐藥菌株。■

參考文獻：

[1] 劉旭.鵝大腸埃希菌病的流行病學、臨床癥狀、診斷及防治[J].現(xiàn)代畜牧科技，2020（11）： 86-87.

[2] 虞銳.反季節(jié)繁殖對浙東白鵝產蛋性能、血清生化指標及相關生殖激素的影響[D].揚州：揚州大學，2022.

[3] 陳明澤，樸春光，樸春浩，等.延邊地區(qū)羊腹瀉大腸埃希菌分離鑒定、毒力基因與耐藥性分析[J/OL].內蒙古農業(yè)大學學報（自然科學版）：20240923.1559.002.

[4] 陳光明.種鵝反季節(jié)生產方式下蛋子瘟綜合防控技術[J].江蘇農業(yè)科學，2015，43（7）：223-225.

[5] 李卓君，黃曉暢，柯善林，等.基于16S rRNA基因及宏基因組測序解析藏豬腸道菌群組成特征[J].江西農業(yè)大學，2024，46（5）：1256-1265.

[6] 殷鶴予，伊雪燕，顧宇華，等.河北省唐秦地區(qū)蛋雞致病性大腸埃希菌耐藥及毒力檢測[J].家禽科學，2024，46（9）：14-25.

[7] 崔笑博.禽源大腸埃希菌的分離鑒定、耐藥性分析及聯(lián)合藥敏試驗的研究[D].泰安：山東農業(yè)大學，2014.

收稿日期：2024-10-30

基金項目：安徽省教育廳重點科學研究項目（KJ2019A0800）

作者簡介：劉心怡（2004—），本科，研究方向：動物疫病防控技術研發(fā)。

*通訊作者：趙磊（1982—），研究生，研究方向：動物傳染病防控研究。