奶牛結(jié)核病PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn)探討

摘要：奶牛結(jié)核病檢測(cè)中，多采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，也是目前發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)之一。本文主要分析了新疆兵團(tuán)第八師石河子地區(qū)在奶牛結(jié)核病檢測(cè)中存在的一些問題，希望對(duì)以后的奶牛結(jié)核病檢測(cè)工作有所促進(jìn)和幫助，以保證檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，并提出建議，以供同行參考。

關(guān)鍵詞：奶牛結(jié)核??；PPD；皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)；精準(zhǔn)檢測(cè)；要點(diǎn)探討

牛結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起牛的一種人畜共患傳染病。人的結(jié)核病有10%以上是由牛分枝桿菌引起，因此，控制牛結(jié)核病是控制人類結(jié)核病的重要途徑之一，石河子地區(qū)作為新疆奶牛養(yǎng)殖大區(qū)，為控制和凈化我區(qū)奶牛結(jié)核病，采用國(guó)內(nèi)外通用的牛結(jié)核病控制策略是從“檢疫－撲殺”。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)是控制和凈化牛結(jié)核病的前提。目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法包括：提純牛型結(jié)核菌素（PPD）、皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）、PPD比較皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)（SICTT）和牛 γ- 干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）。牛結(jié)核病PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法之一，也是目前石河子地區(qū)實(shí)施奶牛全群監(jiān)測(cè)的檢疫方法，在控制與凈化奶牛結(jié)核病中發(fā)揮著重要作用。本文對(duì)基層奶牛結(jié)核病頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)技術(shù)要點(diǎn)分析探討，為今后牛結(jié)核病的精準(zhǔn)檢測(cè)提供參考。

1 PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 監(jiān)測(cè)單位的技術(shù)能力

新疆兵團(tuán)第八師石河子市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心具體負(fù)責(zé)實(shí)施第八師石河子市牛結(jié)核病檢測(cè)預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和凈化場(chǎng)創(chuàng)建等技術(shù)指導(dǎo)工作。

1.2 監(jiān)測(cè)對(duì)象和時(shí)間

按第八師牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)方案要求，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，按照“一病一案、一場(chǎng)一策”要求開展監(jiān)測(cè)。

所有種牛、奶牛、肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)20日齡以上牛全群100%結(jié)核病檢測(cè)；調(diào)運(yùn)牛應(yīng)來(lái)自結(jié)核病無(wú)疫區(qū)或凈化場(chǎng)，調(diào)入前在輸出地開展一次牛結(jié)核病檢測(cè)，調(diào)入后應(yīng)隔離45 d，經(jīng)再次檢測(cè)合格后，方可解除隔離。

牛結(jié)核病低風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)（成年牛凈化群）：實(shí)行每半年（春、秋季節(jié)）用提純牛型結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行一次全群監(jiān)測(cè)。

牛結(jié)核病高風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)（確診牛結(jié)核病的污染牛群）：根據(jù)牛場(chǎng)實(shí)際感染程度，應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方案和本場(chǎng)制定的牛結(jié)核病防控方案，每隔45 d～90 d應(yīng)用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行全群檢測(cè)，檢出的陽(yáng)性牛及時(shí)進(jìn)行撲殺并無(wú)害化處理，直至最后一次全群為陰性。

2 準(zhǔn)備試驗(yàn)所需的材料試劑

2.1 結(jié)核菌素的選擇和使用

試驗(yàn)的關(guān)鍵材料是結(jié)核菌素抗原。目前使用的結(jié)核菌素為提純牛型結(jié)核菌素（PPD）。據(jù)資料報(bào)道，不同廠家的PPD其反應(yīng)程度可能不同，即使同一廠家的不同批號(hào)、不同劑量的PPD也存在差異，這對(duì)結(jié)果的判定帶來(lái)誤差，在確定檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮此因素，因此在選擇時(shí)應(yīng)考慮其敏感性和特異性，以確保結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性；此外，PPD的運(yùn)輸、保管和使用，應(yīng)嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書的要求進(jìn)行，使用前確認(rèn)是否低溫保存和有效期，應(yīng)觀察瓶蓋無(wú)松動(dòng)、瓶身完整無(wú)裂痕、凍干粉未出現(xiàn)潮解、干縮，用真空測(cè)定器監(jiān)測(cè)是否真空。配制結(jié)核菌素要在實(shí)驗(yàn)室（配藥室）無(wú)菌操作，PPD開瓶，必須現(xiàn)配現(xiàn)用、當(dāng)日使用，隔日不能再用，溶解后有異物的均禁止使用。用過(guò)的結(jié)核菌素瓶、剩余的結(jié)核菌素液及檢測(cè)完成后產(chǎn)生的垃圾，包括注射器、針頭、口罩、防護(hù)服等應(yīng)收集起來(lái)進(jìn)行無(wú)害化處理。

2.2 詳細(xì)記錄檢測(cè)信息并建立檔案

記錄畜主姓名、牛耳標(biāo)號(hào)、年齡、繁殖狀態(tài)、檢測(cè)人、檢測(cè)日期、初始皮厚，72 h、96 h、120 h皮厚、皮差等信息，以便通過(guò)檔案能對(duì)檢疫牛做出綜合判定。

2.3 試劑、耗材及工具

電子數(shù)顯卡尺、1 mL藍(lán)心注射器、電動(dòng)剃毛器、配液用一次性注射器、酒精藥棉、0.9%生理鹽水、人員防護(hù)用品（膠條防護(hù)服、手術(shù)手套、防護(hù)口罩、醫(yī)用防護(hù)帽、醫(yī)用防護(hù)鞋套等）、75%酒精、碘伏、回收廢物生物安全箱等。

3 嚴(yán)格操作規(guī)程（操作方法）

標(biāo)準(zhǔn)化操作流程是保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和數(shù)據(jù)可比性的關(guān)鍵。檢測(cè)人員應(yīng)接受必要的牛結(jié)核PPD檢測(cè)相關(guān)知識(shí)培訓(xùn)，了解牛結(jié)核病的基本知識(shí)、傳播途徑和防控措施，掌握檢測(cè)要點(diǎn)、熟悉操作流程和規(guī)范操作，并能準(zhǔn)確評(píng)估和記錄結(jié)果，才能大大提高奶牛PPD試驗(yàn)的準(zhǔn)確率。

3.1 接種部位確定

接種部位的選擇會(huì)影響抗原的吸收速度和強(qiáng)度以及測(cè)量誤差，直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。按照國(guó)標(biāo)選擇在頸側(cè)中部上三分之一處，三個(gè)月以內(nèi)的犢牛，在肩胛部進(jìn)行，該處測(cè)量皮厚和注射較為方便，不同的注射部位結(jié)果誤差很大，

若進(jìn)行比較變態(tài)反應(yīng)，應(yīng)選擇同一側(cè)頸中部2個(gè)點(diǎn)，一個(gè)在上三分之一處，一個(gè)在下三分之一處，2個(gè)點(diǎn)之間的距離不得少于15 cm。注射點(diǎn)及周圍的皮膚應(yīng)無(wú)明顯的病變。

3.2 剃毛方法

在注射結(jié)核菌素前注射部位必須剃毛，以便于識(shí)別注射部位和消毒，做到每次測(cè)量皮皺厚度時(shí)在同一處進(jìn)行。在用剃刀、刀片等剃毛時(shí)，常引起局部外傷，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)炎性腫脹，建議使用電動(dòng)剃毛器則方便易行，無(wú)上述弊端。剃毛的直徑約10 cm。

3.3 測(cè)量皮厚

檢測(cè)判定中皮差以毫米計(jì)，檢測(cè)試驗(yàn)中微小的差錯(cuò)都可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。目前基層使用的是電子卡尺，使用較方便，但注意每一次測(cè)量完后要?dú)w零。此外，卡尺夾持皮皺的松緊程度因測(cè)量人的不同有所差異，故自始至終要由一人測(cè)量，否則造成假陽(yáng)性或假陰性出現(xiàn)。測(cè)量時(shí)用左手食指和拇指捏起中央皺皮，卡尺卡口的按壓要適中，防止過(guò)緊或過(guò)松，盡量減少誤差。

3.4 注射方法及劑量

注射前消毒（75%酒精）要嚴(yán)格，防止注射部位的感染。且要等酒精揮發(fā)后再注射，以防止注射時(shí)酒精隨針頭進(jìn)入體內(nèi)刺激腫脹影響結(jié)果。一頭牛一個(gè)注射器，注射器采用1 mL一次性使用無(wú)菌注射器（帶針頭）。注射時(shí)，最好用左手食指和拇指捏起中央皺皮，針頭斜著45度角刺入皮膚，或者注射進(jìn)針時(shí)，手腕要控制好，腕部背側(cè)緊貼著牛頸部位，防止針尖劃破皮膚。注射部位皮膚應(yīng)鼓起綠豆大的小泡，表明結(jié)核菌素注射成功。如注射失敗，應(yīng)重新選擇注射部位（對(duì)側(cè)或者同側(cè)15 cm以外的部位），還應(yīng)做好標(biāo)記和記錄。注射后如出血應(yīng)重新?lián)Q點(diǎn)注射，以避免結(jié)核菌素隨血液流出，或出血形成皮內(nèi)（下）小血腫，影響結(jié)果判定。注射劑量嚴(yán)格按使用說(shuō)明書的規(guī)定劑量，無(wú)論牛只大小，一律皮內(nèi)注射0.1 mL，不能因?yàn)槭菭倥：腕w重偏輕而減量，也不能因?yàn)轶w重較大而加量。另外，也不能稀釋成低濃度或高濃度而加大或減少劑量注射。牛型PPD 0.1 mL（含2 000IU），禽型PPD 0.1 mL（含2 500IU）。抽取PPD時(shí)，應(yīng)注意排除注射器內(nèi)的氣泡，以減少

誤差。

4 正確掌握判斷標(biāo)準(zhǔn)

按照操作規(guī)程72小時(shí)觀察結(jié)果并測(cè)量皮厚，個(gè)別牛出現(xiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，可疑牛和陰性牛在96 h和120 h必須再分別觀察一次。通過(guò)觀察注射部位是否有炎性反應(yīng)、觸摸腫塊是否有結(jié)節(jié)和皮厚差綜合判定結(jié)果。在生產(chǎn)實(shí)際中，一些操作人員容易憑借“經(jīng)驗(yàn)”判定結(jié)果，認(rèn)為只要接種部位沒有“鼓包”就是正常的，其實(shí)不然，有些皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)會(huì)形成明顯的隆起，有些變態(tài)反應(yīng)則是擴(kuò)散性的，表面看不出異常反應(yīng)，但實(shí)際則出現(xiàn)增厚反應(yīng)，因此必須借助儀器判定。在此期間，被檢測(cè)牛術(shù)部也可能因?yàn)闄C(jī)械或蚊蟲（尤其在夏、秋季節(jié)）叮咬而引起腫脹，在觀察過(guò)程中一定要分清。注射部位前后出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，且皮皺厚差值大于或等于4.0 mm時(shí)判為陽(yáng)性；無(wú)明顯炎性反應(yīng)，且皮厚差值為2.0 mm-4.0 mm時(shí)判為可疑；無(wú)明顯炎性反應(yīng)，皮厚差值小于或等于2.0 mm時(shí)判為陰性[1]。

5 引起非特異性反應(yīng)的因素

根據(jù)本地區(qū)的試驗(yàn)結(jié)果，由禽型結(jié)核分枝桿菌和副結(jié)核及其他分枝桿菌引起的假陽(yáng)性較低，而奶牛生理性的（發(fā)情期、妊娠后期，其敏感性增高）、飼料配合不平衡，日糧中蛋白質(zhì)飼料過(guò)高，或過(guò)度飲食酸性飼料、臨床上使用激素、藥物制劑及接種某些疫苗、機(jī)體患有某些傳染病或寄生蟲病以及人為操作不當(dāng)?shù)仍虺３？梢鸺僮儜B(tài)反應(yīng)。因此，在奶牛結(jié)核檢測(cè)中，對(duì)上述因素必須綜合考慮，減少由非特異性因素引起的假變態(tài)反應(yīng)。

6 討論與分析

在奶牛結(jié)核病防控和凈化中，采用國(guó)標(biāo)規(guī)定的提純牛型結(jié)核菌素（PPD）頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)取得了明顯的成效，該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，便于現(xiàn)場(chǎng)操作作業(yè)，價(jià)格低廉，容易進(jìn)行判定，缺點(diǎn)是操作費(fèi)時(shí)煩瑣，結(jié)果判定主觀性大、存在非特異性高的缺點(diǎn)等，因此造成結(jié)果的判定存在一定的誤差。其精準(zhǔn)度的提升對(duì)于早期診斷和有效防控至關(guān)重要。

研究表明，按農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的《牛結(jié)核病提純結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)操作規(guī)程》，用提純的牛型結(jié)核菌素對(duì)奶牛進(jìn)行皮內(nèi)注射變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)奶牛結(jié)核病時(shí)，檢出準(zhǔn)確率可達(dá)到95%～98％。但如操作不當(dāng)或不規(guī)范，檢出準(zhǔn)確率則會(huì)大打折扣[2]。

按照《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2020）》，20日齡以上的奶牛均應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但是在實(shí)際工作中，60日齡以下的犢牛在實(shí)際操作中往往不能100%檢測(cè)，存在幼齡犢牛漏檢現(xiàn)象。據(jù)資料報(bào)道，犢牛年齡越小患病率越高，1個(gè)月齡的犢牛患病率占2.46%，3個(gè)月齡患病率占0.88%，而6個(gè)月齡的僅占0.41%。

在實(shí)際工作中，我們觀察到，一些牛型結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛，多數(shù)營(yíng)養(yǎng)良好，體壯，臨床無(wú)明顯牛結(jié)核癥狀或者臨床癥狀不典型，病理學(xué)觀察時(shí)只從眼觀變化很難全部看到病變，所以單憑肉眼看不到結(jié)核病變的牛， 不能盲斷為假陽(yáng)性牛。可能原因：牛結(jié)核病感染初期或輕度感染時(shí)，還未發(fā)病，可能不出現(xiàn)臨床癥狀；此外，由于皮內(nèi)結(jié)核菌素試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)Y(jié)核病提前做出診斷，大部分感染牛在臨床癥狀出現(xiàn)前已被淘汰，因而牛結(jié)核病的臨床癥狀很少遇到，通常只有少部分發(fā)病后期的?？捎^察到一些與結(jié)核病有關(guān)的癥狀。這些癥狀隨著體內(nèi)結(jié)節(jié)的分布而變化，除少數(shù)病例外，病程較慢，在多數(shù)情況下，甚至在晚期階段，仍無(wú)特征性癥狀。

提純牛型結(jié)核菌素（PPD）頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)可疑牛的復(fù)檢時(shí)間問題《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2020）》中6.3.1c）規(guī)定，“對(duì)疑似反應(yīng)牛應(yīng)立即在另一側(cè)以同一批PPD同一劑量進(jìn)行第二次皮內(nèi)注射，再經(jīng)72h觀察反應(yīng)結(jié)果。”據(jù)王忠山等報(bào)道，用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)診斷奶牛結(jié)核病，對(duì)試驗(yàn)檢出的陽(yáng)性牛和可疑牛立即用該方法進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)檢測(cè)，多數(shù)牛（87.2%）的變態(tài)反應(yīng)會(huì)受到抑制，弱化前次實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致前后檢測(cè)結(jié)果不一致。由于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)出現(xiàn)滯后效應(yīng)，不能在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)

進(jìn)行[3]。

關(guān)于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢出的陽(yáng)性牛的處理。根據(jù)筆者2019—2020年來(lái)對(duì)新疆石河子地區(qū)4家規(guī)模牛場(chǎng)通過(guò)牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出的475頭陽(yáng)性牛進(jìn)行比較，結(jié)果表明：牛型結(jié)核陽(yáng)性457頭，符合率在93.18 %-100 %之間，平均96.21 %；禽型結(jié)核病的11頭，陽(yáng)性率在0%～3.57%，平均2.32%。根據(jù)以上我們所做的試驗(yàn)及本地區(qū)奶牛場(chǎng)的實(shí)際情況，為達(dá)到控制和凈化的目的，建議本地區(qū)通過(guò)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢出的陽(yáng)性牛不再?gòu)?fù)檢，直接撲殺或無(wú)害化

處理[4]。

嚴(yán)格試驗(yàn)操作規(guī)范，減少人為因素的誤判。牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但需要注意的細(xì)節(jié)很多，技術(shù)人員及相關(guān)人員往往因?yàn)椴灰?guī)范操作而影響結(jié)果的判定，造成不必要的損失。因此，應(yīng)制定程序化的操作步驟，對(duì)技術(shù)人員及相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)，要求每人熟練每個(gè)環(huán)節(jié)的操作要領(lǐng)，并對(duì)人員合理分工，使檢測(cè)工作能夠有條不紊地開展。此外，要做好檢測(cè)人員的衛(wèi)生防護(hù)，確保自身安全。

未來(lái)的研究應(yīng)聚焦在以下幾個(gè)方向：一是開發(fā)新型的、特異性更強(qiáng)的抗原，以提高PPD檢測(cè)的性能；二是探索更精準(zhǔn)的接種部位，減少測(cè)量誤差和非特異性反應(yīng)；三是建立更為完善的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合多種檢測(cè)方法，提高診斷的綜合準(zhǔn)確率；四是加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作的推廣，確保實(shí)驗(yàn)的可復(fù)制性和結(jié)果的可靠性?！?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] 全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)：GB/T18645-2020[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2020.

[2] 姚智深.如何提高奶牛PPD試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[J].中國(guó)奶牛，2014（6）：58-60.

[3] 王忠山，鄧紅江，劉向鵬，等.短期內(nèi)進(jìn)行牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)的結(jié)果變化觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（06）：41-43.

[4] 王宏偉，李新萍，李劼，等.新疆石河子地區(qū)牛結(jié)核病檢測(cè)方法的比較研究[J].中國(guó)奶牛，2020（07）：33-35.

收稿日期：2024-11-18

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)科技計(jì)劃（2023AB009-02）

作者簡(jiǎn)介：王宏偉（1968—），男，本科，高級(jí)獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物疫病防控。

*通訊作者：竇立靜（1975—），女，本科，高級(jí)獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物疫病防控。