基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室布魯氏菌病虎紅平板凝集與試管凝集試驗(yàn)誤差分析

摘要：動(dòng)物布魯氏菌病在基層實(shí)驗(yàn)室一般通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)，即虎紅平板凝集和試管凝集進(jìn)行確診，本文對(duì)兩種檢測(cè)原理及影響因素進(jìn)行了全面的分析和總結(jié)，以期提高檢測(cè)正確率從而提高布病檢疫凈化的效率，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失。

關(guān)鍵詞：布魯氏疾病、試管凝集、虎紅平板凝集、試驗(yàn)誤差分析

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌侵入機(jī)體后，引起變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患的全身性傳染病?！吨腥A人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將其規(guī)定為乙類傳染病，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為二類動(dòng)物疫病病種。

1 流行病學(xué)調(diào)查及基層布病防控現(xiàn)狀

牛、羊、豬是引起疾病的主要病原菌，其中牛、羊傳播率較高。易感動(dòng)物主要通過(guò)消化道、呼吸道、破潰皮膚或結(jié)膜等黏膜組織接觸到布魯氏菌，由于其具有易感性而造成感染。直接接觸主要發(fā)生在混牧、圈舍飼養(yǎng)、集貿(mào)市場(chǎng)交易和運(yùn)輸過(guò)程中與患病動(dòng)物接觸而造成感染，人也可通過(guò)接觸病畜臟器、血液、皮毛從而感染布??；間接接觸主要是被污染的圈舍、場(chǎng)地、水源、草料、飼養(yǎng)人員以及氣溶膠等多種途徑而感染布病。在流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，除部分牲畜妊娠期出現(xiàn)流產(chǎn)、胎衣不下、乳房炎、睪丸炎、附睪炎等明顯癥狀，大多家畜成隱性發(fā)病，感染后通常不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，這也給布病防控凈化帶來(lái)了難度。養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過(guò)程中不易察覺(jué)，感染此病后造成患者低熱、多汗、肌肉和關(guān)節(jié)酸痛、乏力或肝、脾、淋巴等組織不同程度的損傷，臨床癥狀多變且無(wú)特異性。因此，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)家畜布病的確診、凈化至關(guān)重要。

近年來(lái)，為促進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提檔升級(jí)，活畜禽調(diào)運(yùn)和市場(chǎng)交易日趨頻繁，畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展成為農(nóng)民增收致富的“穩(wěn)定器”，但布病在畜群和人類之間的感染率逐年程上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生事業(yè)，引起各級(jí)政府、獸醫(yī)行業(yè)管理部門(mén)和動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)的高度重視，甘肅省將其列為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)病種，采取“免疫接種為主、檢測(cè)凈化為輔”的方式，在免疫全覆蓋的基礎(chǔ)上，有針對(duì)性地對(duì)調(diào)引牛羊、引起人感染布病的重點(diǎn)區(qū)域和高流產(chǎn)率畜群以及其他可疑情況開(kāi)展全群跟蹤監(jiān)測(cè)，以及早發(fā)現(xiàn)并剔除陽(yáng)性個(gè)體。因此，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)堅(jiān)持科技引領(lǐng)，加強(qiáng)防控能力建設(shè)，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提升檢測(cè)及鑒別診斷技術(shù)。

2 檢測(cè)確診方法

目前，基層實(shí)驗(yàn)室依照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）進(jìn)行操作與判定：虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，疑似陽(yáng)性的樣品再使用試管凝集進(jìn)行復(fù)檢，試管凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性的，判定為感染動(dòng)物[1]?；⒓t平板，價(jià)廉、快速簡(jiǎn)便，適用于大批量初篩，但由于抗原特異性、溫度、試劑靈敏度等諸多因素的影響，出現(xiàn)假陽(yáng)性較多，需進(jìn)行試管凝集復(fù)檢，以確保判定準(zhǔn)確，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失。

3 實(shí)驗(yàn)原理

3.1 虎紅平板試驗(yàn)原理（RBT）

所用抗原含有苯酚的酸性（PH3.6-3.9）粉色抗原，細(xì)菌抗原與相應(yīng)的抗體（血清）混合后，在電解質(zhì)參與下，抗原和抗體凝集成肉眼可見(jiàn)的凝集小塊。血清與虎紅平板凝集抗原等量（30 μL）混合后，4 min內(nèi)若出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒，判定為陽(yáng)性（最低檢出限為22.22 IU/mL）。

3.2 試管凝集試驗(yàn)原理（SAT）

試管凝集抗原與抗體（血清）混合，在電介質(zhì)作用和37 ℃溫箱條件下作用24 h，抗原抗體形成復(fù)合物沉于試管底部，混合液清亮程度會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)觀察混合液清亮程度，可判定是否存在布魯氏菌抗體。牛、駱駝、馬血清稀釋倍數(shù)為1：25至1：100，羊、豬血清稀釋倍數(shù)為1：50至1：400，當(dāng)?shù)诙茉噭?：50（羊、豬1：100）出現(xiàn)“++”以上凝集時(shí)，該樣品判為陽(yáng)性[2]（最低檢出限羊/豬為25 IU/mL，牛/駱駝/馬為50 IU/mL）。

4 共性影響因素分析

4.1 血清

畜禽采血分離血清是疫病監(jiān)測(cè)、檢測(cè)、診斷和評(píng)估免疫效果的一項(xiàng)前提性工作，血清質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果。

4.2 采血管影響

采血管分為普通采血管與含肝素鈉抗凝劑采血管。普通采血管中不含抗凝劑，血液樣品采集凝血后離心，產(chǎn)生的上清液則為血清，而含有抗凝劑的采血管離心后，上清液則是血漿，前者在凝血的過(guò)程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，血清中無(wú)纖維蛋白，后者則與之相反。使用血漿試驗(yàn)，纖維蛋白會(huì)與抗原結(jié)合，出現(xiàn)假陽(yáng)性[3]。因此，采集樣品過(guò)程中應(yīng)使用普通采血管，以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。

4.3 血清質(zhì)量

進(jìn)行試驗(yàn)的血清樣本應(yīng)當(dāng)無(wú)腐敗氣味、無(wú)溶血、透明清亮，樣品新鮮。血清分離分為自然析出法與離心機(jī)分離法，自然析出法獲得的血清質(zhì)量更好，但要保證靜置時(shí)間大于1小時(shí)，血液樣本放置于20～37 ℃環(huán)境中，使纖維蛋白原收縮凝集，此時(shí)血液標(biāo)本陽(yáng)性率趨于穩(wěn)定，降低假陽(yáng)性率。因此，血液采集后應(yīng)在凝血反應(yīng)被激活、血液凝固后再移動(dòng)樣品或者進(jìn)行離心，降低纖維蛋白原與虎紅抗原、試管凝集抗原產(chǎn)生的非特異性凝集反應(yīng)。

5 個(gè)性影響因素分析

5.1 虎紅平板試驗(yàn)影響

第一，抗原靈敏度。診斷抗原用布病陽(yáng)性參考血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 IU/mL）標(biāo)化，與0.5%苯酚生理鹽水1/45（22.22 IU/mL）稀釋的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品出現(xiàn)清晰地陽(yáng)性反應(yīng)，與1/55（18.18 IU/mL）稀釋的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清不反應(yīng)[4]。不同廠家的試劑對(duì)同一批樣品的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生差異，因此，抗原的質(zhì)量對(duì)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性有一定的影響，抗原靈敏度并不是越高越好，如果假陽(yáng)性率過(guò)高，不僅會(huì)加大工作量，還會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

第二，試劑樣品溫度。在2～8 ℃條件下保存，保質(zhì)期為12個(gè)月，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照規(guī)定的溫度儲(chǔ)存虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原，實(shí)驗(yàn)室需要將抗原和血清恢復(fù)室溫（22±4 ℃）后使用，從冰箱中取出后立即試驗(yàn)，則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的敏感性降低。

第三，試驗(yàn)操作。采用虎紅平板凝集試驗(yàn)反應(yīng)板進(jìn)行檢測(cè)，減少試驗(yàn)過(guò)程中反應(yīng)板的影響。實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)采用陰性對(duì)照樣本檢查虎紅試劑是否存在自凝現(xiàn)象，試驗(yàn)過(guò)程中加入抗原和血清時(shí)應(yīng)先分離，樣品加完后再用牙簽或木棍迅速混合均勻，涂布直徑為2 cm，避免反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或涂布直徑過(guò)大導(dǎo)致的假陽(yáng)性。在自然光照下輕晃4 min判定結(jié)果，若4 min內(nèi)為陰性，而4min后觀察為陽(yáng)性，則最終判定為陰性，說(shuō)明檢測(cè)樣本抗體濃度未達(dá)到最低檢

出限。

5.2 試管凝集試驗(yàn)影響因素分析

第一，器皿及濕度。基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室布病試管凝集試驗(yàn)現(xiàn)多采用一次性真空采血管，這樣不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)步驟，還能夠降低試管潔凈度帶來(lái)的試驗(yàn)誤差。為確保在溫箱放置過(guò)程中因水分缺失造成的實(shí)驗(yàn)誤差，產(chǎn)生氣溶膠，造成實(shí)驗(yàn)室污染，反應(yīng)過(guò)程中最好加蓋。

第二，5%石碳酸生理鹽水。抗原稀釋液與被檢血清稀釋使用5%石碳酸生理鹽水（羊使用5%石碳酸10%NaCL溶液），能夠抑制血清中IgM類抗體的凝集活性，檢測(cè)IgG類抗體，提高反應(yīng)的特異性。同時(shí)，低濃度石碳酸有一定的抑菌作用，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

第三，前帶現(xiàn)象的影響。試管凝集檢測(cè)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)稀釋度低的血清在管內(nèi)不凝集，而稀釋度高的血清在管內(nèi)出現(xiàn)凝集的現(xiàn)象，這叫做前帶現(xiàn)象。膠體粒子學(xué)說(shuō)，是由于稀釋度低的血清中所含膠體粒子多，即抗體過(guò)剩，影響免疫復(fù)合物的形成，稀釋度高的所含膠體粒子少，所以出現(xiàn)了凝集，導(dǎo)致陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果。此時(shí)，需多采用幾個(gè)稀釋度進(jìn)行復(fù)檢或者采用其他方法復(fù)檢[5]。

第四，試驗(yàn)操作。試管凝集試驗(yàn)加樣要注意將血清加到管底，稀釋吹吸次數(shù)盡量保持一致，同時(shí)，要避免氣溶膠產(chǎn)生（氣泡破裂等），加入抗原后震蕩混勻，比濁管制作與試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，判定結(jié)果時(shí)應(yīng)選擇自然光線。操作過(guò)程中需要注意的細(xì)節(jié)，在實(shí)驗(yàn)室人員操作前要進(jìn)行統(tǒng)一的培訓(xùn)，減少人為操作過(guò)程中引起的實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

6 檢測(cè)結(jié)果存在差異因素

虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出陽(yáng)性樣品，試管復(fù)檢為陽(yáng)性，則判定為布魯氏菌病陽(yáng)性患病動(dòng)物；試管復(fù)檢為陰性，判為陰性的樣品，可能是因?yàn)檠獫{引起的非特異性反應(yīng)或抗體濃度在22.22-50IU/mL之間，造成不凝集現(xiàn)象。虎紅平板為陰性，試管為陽(yáng)性的樣品，原因可能是小腸耶爾森等早期感染的IgM交叉反應(yīng)或布魯氏菌病早期感染的IgM類抗體反應(yīng)，引起凝集現(xiàn)象。

結(jié)語(yǔ)

虎紅平板與試管凝集試驗(yàn)作為基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室布病確診試驗(yàn)，其準(zhǔn)確性直接關(guān)系到養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益。因此，實(shí)驗(yàn)室工作的專業(yè)技術(shù)人員在布病檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行崗前培訓(xùn)，開(kāi)展內(nèi)部比對(duì)，確保在操作過(guò)程中保持一致，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意血清樣品質(zhì)量、溫度、稀釋液、前帶現(xiàn)象等因素影響，以防止出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。在檢測(cè)前應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)抗原與樣品的檢查，確保樣品與實(shí)驗(yàn)要求相符，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。■

參考文獻(xiàn)：

[1] 全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC 181）.動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù).GB/T 18646-2018[S].2018-02-06：1.

[2] 盧旺銀，王子堅(jiān).動(dòng)物布魯氏菌病防治[M].蘭州：蘭州大學(xué)出版社，2023，7：119-120.

[3] 張智鵬.抗凝劑對(duì)動(dòng)物布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，38（11）： 132-136.

[4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016：122.

[5] 張莉，王占輝，張永梅，等.影響布魯氏菌病抗體檢測(cè)的因素分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2015，31（12）：1416+1433-1434.

收稿日期：2024-12-26

作者簡(jiǎn)介：譚鎮(zhèn)陽(yáng)（1995—），女，獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物防疫、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。