黃花菜活性成分提取工藝及快速鑒定方法

摘" "要" "黃花菜含有酚類、多糖、醣甙化合物等多種活性成分。介紹了黃花菜活性成分的低成本分步工業(yè)化提取及快速鑒定方法，以及活性成分的結(jié)構(gòu)與功能，以助于更好地高效綜合利用黃花菜，同時(shí)為萱草科其他植物活性成分提取鑒定研究提供參考。

關(guān)鍵詞" "黃花菜;活性物質(zhì);黃酮;皂苷;黃花菜多糖

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni， HCB），又稱檸檬萱草，也有地方稱之為忘憂草、安神菜、金針菜等，是一種多年生草本植物。在地理分布上，其種植區(qū)域橫跨中國(guó)多個(gè)生態(tài)區(qū)域，涵蓋了秦嶺山脈以南的亞熱帶及溫帶地區(qū)，包括湖南省、江蘇、浙江、湖北、江西、四川，向南則延伸至廣東省的珠江三角洲及粵北山地。此外，秦嶺以北的省份，如甘肅、陜西也有種植，最北端到達(dá)內(nèi)蒙古以及東北地區(qū)的吉林省。黃花菜生物活性物質(zhì)有多種次生代謝產(chǎn)物，例如黃酮、多糖、皂苷等，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功效。因此，對(duì)黃花菜活性物質(zhì)的提取和鑒定方法進(jìn)行研究具有重要的意義。

1" "材料與方法

1.1" "儀器、材料與試劑" "黃花菜來自陜西大荔縣陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)基地;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司生產(chǎn)，人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)自中國(guó)藥物生物檢定所;香草醛、苯、吡啶、甲醇、乙醇、1%三氯化鋁、AB-8大孔吸附樹脂、鹽酸、鎂粉、溴化鉀均購(gòu)自天津瑞格斯科技有限公司;膜分離裝置（杭州科膜）;紫外—可見分光光度計(jì)UV-2501（日本島津公司）;Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛）、超聲波清洗機(jī)。

1.2" "活性物質(zhì)提取方法" "黃花菜活性物質(zhì)中酚類物質(zhì)多以黃酮苷的形式存在，如黃酮類化合物。多糖多以低聚果糖形式存在[1]，而糖苷化合物多為皂苷類活性物質(zhì)。利用黃花菜各種活性成分不同的理化性質(zhì)，依次提取黃酮類化合物、多糖、皂苷。

1.2.1" "黃酮類化合物提取與含量測(cè)定" "將洗凈的鮮黃花菜蒸制5～6 min后晾涼至室溫，曬干，制成粗粉[2]。精密稱取黃花菜干品粗粉25 g，用70%乙醇500 mL，于具塞錐形瓶中，60 Hz超聲40 min[3]，轉(zhuǎn)入蒸餾燒瓶中，水浴回流數(shù)次，過濾（過濾物備用），常壓下回收乙醇，至提取濃縮液為20 mL且無醇味時(shí)，停止加熱。過濾物與保留的藥渣用于后續(xù)多糖和皂苷提取。

紫外—可見分光光度法鑒定黃花菜總黃酮。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加50%甲醇制成0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照中華人民共和國(guó)藥典方法，510 nm測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）[4]。計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)y=13.266x+0.006，R2=0.998 4。

1.2.2" "多糖提取與含量測(cè)定" "粗多糖是黃花菜中的一種重要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗疲勞等多種藥理作用。將黃酮類化合物提取后的過濾物與保留的藥渣采用80%乙醇回流兩次，每次2 h。料液比1 ∶ 40，50 ℃熱水浸泡2 h，抽濾去除單糖和低聚糖，抽濾后剩余不溶物重復(fù)提取1次，所有濾液通過0.2 μm微濾膜過濾除去大分子物質(zhì)和雜質(zhì)，取濾液依次過截留分子量為6 000、2萬、10萬道爾頓超濾膜，反復(fù)3次，濃縮液（透過液備用提取皂苷）用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮至原體積20%，真空干燥得到粗多糖[5]。

硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4260-2015[5]，490 nm測(cè)吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖對(duì)照液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)y=0.005 5x+0.000 7，R2=0.999 9。

多糖含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，公式詳見國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4260-2015[5]。

1.2.3" "皂苷提取與含量測(cè)定" "將多糖提取超濾后透過液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮至原體積20%，減壓干燥得到皂苷粗品。皂苷粗品水溶液過大孔吸附樹脂柱，將乙醇溶液洗脫液減壓干燥得到精制黃花菜皂苷[6-7]。

香草醛冰乙酸溶液顯色法測(cè)定總皂苷含量。分別吸取20 μL、50 μL、100 μL、150 μL和200 μL的2.0 mg/mL人參皂苷Re，按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》保健食品中總皂苷的測(cè)定方法[8]560 nm測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)y=0.001 1x+0.016 4，R2=0.996 9。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "黃酮類化合物含量測(cè)定" "按實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)回歸方程計(jì)算黃花菜樣品中黃酮類化合物活性物質(zhì)濃度，結(jié)果見表1。測(cè)得黃花菜提取液中黃酮類化合物含量為0.36 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.89%，黃花菜黃酮類化合物含量=提取液濃度×提取液總體積/黃花菜質(zhì)量，得黃花菜中黃酮類化合物含量為14.4 μg/g。

2.2" "多糖含量測(cè)定" "硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。取適量黃花菜多糖樣品制成溶液，測(cè)定吸光值。根據(jù)樣品葡萄糖濃度計(jì)算多糖含量，結(jié)果見表2。測(cè)得黃花菜樣品葡萄糖濃度為78.53 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.35%，進(jìn)而依據(jù)公式求得黃花菜中多糖含量為11.31 g/100 g。

2.3" "皂苷含量測(cè)定" "按實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定樣品吸光度。計(jì)算樣品中總皂苷含量，結(jié)果見表3。本方法測(cè)得黃花菜樣品中總皂苷含量為437.64 μg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 2.79%。

3" "討論

3.1" "黃酮類化合物與多糖提取工藝優(yōu)化" "為了進(jìn)一步優(yōu)化黃酮與多糖分步提取工藝，在未來的工作中可以考慮超聲波輔助提取工藝優(yōu)化，將乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率和料液比5個(gè)工藝參數(shù)為變量，選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的因素及相應(yīng)水平正交試驗(yàn)，篩選出黃酮類化合物優(yōu)化提取工藝[9]。

按照1.2.2方法過程中，在提取出粗多糖后，抽濾去除單糖和低聚糖工藝前可以增加多糖優(yōu)化提純工藝。將乙醇沉淀出的黃花菜多糖分別用無水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯洗滌后離心分離，重復(fù)多次，除去溶劑后真空干燥至恒重[1]。

3.2" "黃酮類化合物快速鑒定" "在經(jīng)過2.1方法鑒定黃酮類化合物后，為了滿足批量生產(chǎn)快速經(jīng)濟(jì)性，可以通過熒光檢識(shí)黃酮結(jié)果。楊青等根據(jù)C3-羥基類黃酮在紫外光下熒光顯著的原理，在紫外光下觀察濾紙上黃花菜提取液，如顯亮黃綠色熒光，即可確認(rèn)含C3-羥基類黃酮化合物[10]。

3.3" "黃花菜多糖光譜分析

3.3.1" "紫外光譜分析" "準(zhǔn)備1.0 mg/mL黃花菜多糖水溶液，對(duì)樣品在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析樣品共軛體系、不飽和鍵、芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。樣品在200 nm處有微弱吸收，具有多糖特征。在220、260 nm處沒有明顯吸收峰，背景平坦。經(jīng)過分析，可以確定不含核酸、蛋白質(zhì)以及多肽成分。見圖4。

3.3.2" "紅外光譜分析" "將1 mg干燥的黃花菜多糖樣品與100 mg干燥的溴化鉀粉末混合研磨均勻并壓制成薄片，進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖5所示。

紅外光譜分析結(jié)果顯示，黃花菜多糖樣品在3 100～3 600 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收峰羥基伸縮振動(dòng)吸收峰;在3 000～2 800 cm-1和1 480～1 300 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)CH3、CH2、CH等基團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰;在1 700～1 550 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)C=O羰基伸縮振動(dòng)吸收峰;在1 000～1 200 cm-1范圍內(nèi)，出現(xiàn)吡喃糖苷存在的特征峰。吡喃糖苷是低聚果糖等糖類化合物中常見的結(jié)構(gòu)單元。綜合以上紅外光譜特征，所提取的產(chǎn)品是一種低聚糖[11]。

參考文獻(xiàn)

[1] 丁常澤，林世家.黃花菜多糖的提取分離分析[J].湖南人文科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（2）：21-23.

[2] 趙紅霞，王應(yīng)強(qiáng)，劉愛青，等.預(yù)處理對(duì)熱水浸提黃花菜浸膏粉營(yíng)養(yǎng)組成及生物活性影響研究[J].中國(guó)食品添加劑，2023，34（1）：101-109.

[3] 趙凱麗，王秋亞，王慧，等.黃花菜總黃酮的提取、測(cè)定方法和生物活性研究進(jìn)展[J].山東化工，2022，51（11）：110-112.

[4] 中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2020.

[5] SN/T 4260-2015. 出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法[S].

[6] 張平平，劉金福，韓慧，等.水溶性苦瓜皂苷和苦瓜多糖提取方法的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007（6）：12-15.

[7] 賀曉龍，邵青，姚堯，等.山丹丹皂苷提取工藝初探[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，34（2）：73-76.

[8] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[9] 白雪松，杜鵑，謝巧英.黃花菜中總黃酮超聲提取工藝研究[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（1）：3-5.

[10] 付亮，袁璟亞，楊瑞武，等.正交試驗(yàn)優(yōu)化淫羊藿總黃酮和多糖的分步提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：56-60.

[11] 楊青，唐瑞仁，任鳳蓮.黃花菜中黃酮化學(xué)成分的測(cè)定[J].食品科技，2006（9）：235-236.