飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)、免疫和腸道菌群的影響

摘 要：為研究枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）生長(zhǎng)、免疫和腸道菌群的影響，以體質(zhì)量（92.13±7.91）g的赤點(diǎn)石斑魚為試驗(yàn)對(duì)象，在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.5%和1.0%的枯草芽孢桿菌制劑，進(jìn)行了為期56 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚的特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)無顯著影響（P＞0.05）；飼料中添加枯草芽孢桿菌顯著提高了赤點(diǎn)石斑魚血清中超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）的活性（P＜0.05），但對(duì)血清溶菌酶（LZM）活性無顯著影響（P＞0.05）；飼料中添加1%的枯草芽孢桿菌，血清中總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量顯著提高（P＜0.05）。飼料中添加枯草芽孢桿菌提高了赤點(diǎn)石斑魚腸道中狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）的豐度，而弧菌屬（Vibrio）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）和丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）的豐度有所降低。結(jié)果表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌具有提升赤點(diǎn)石斑魚免疫力、改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；赤點(diǎn)石斑魚；免疫力；腸道菌群

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，具有易存活、易存儲(chǔ)、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)，是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部許可應(yīng)用在水產(chǎn)、畜牧等領(lǐng)域的益生菌?？莶菅挎邨U菌能定殖在生物體內(nèi)，因其不會(huì)對(duì)水產(chǎn)生物健康造成負(fù)面影響、不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中的熱點(diǎn)。研究表明，枯草芽孢桿菌能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［1］，提高宿主免疫力，改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，具有防控病害的作用［2-4］，其在機(jī)體內(nèi)能產(chǎn)生枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素、短桿菌肽等對(duì)病原細(xì)菌有明顯抑制作用的活性物質(zhì)，有利于水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)菌群保持健康狀態(tài)［5］。

赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）俗稱紅斑，隸屬于鱸形目（Perciformes）、鱸亞目（Percoidei）、石斑魚科（Epinephelinae）、石斑魚屬（Epinephelus），其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其養(yǎng)殖病害也越來越多，因此開發(fā)綠色環(huán)保型抗生素藥物替代品至關(guān)重要。目前尚未見枯草芽孢桿菌在赤點(diǎn)石斑魚生產(chǎn)中應(yīng)用的報(bào)道。本研究在飼料中添加商品枯草芽孢桿菌制劑進(jìn)行了赤點(diǎn)石斑魚飼養(yǎng)試驗(yàn)，通過分析試驗(yàn)魚生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和腸道菌群的變化，評(píng)估枯草芽孢桿菌在赤點(diǎn)石斑魚生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，以期為赤點(diǎn)石斑魚健康養(yǎng)殖提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)分組

以“海童牌”石斑魚配合飼料為基礎(chǔ)飼料，其原料為進(jìn)口魚粉、蝦粉、大豆蛋白、魚油、面粉、維生素、礦物質(zhì)等，主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為蛋白質(zhì)49.2%、粗脂肪9.1%、粗纖維1.9%、粗灰分15.6%。試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌制劑購(gòu)自河南某生物科技有限公司，活菌數(shù)1.0×1010 CFU/g。

先將枯草芽孢桿菌菌粉與中性緩沖液混合配制成懸濁液，再按照0、0.5%、1.0%的比例（枯草芽孢桿菌粉在飼料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別向基礎(chǔ)飼料均勻噴灑懸濁液，通風(fēng)晾干，制成3組試驗(yàn)飼料（F0、F1和F2組）。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)投放30尾赤點(diǎn)石斑魚。

試驗(yàn)用赤點(diǎn)石斑魚為浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所繁殖和培育，選擇規(guī)格均勻、健康無病的個(gè)體共270尾，試驗(yàn)魚體質(zhì)量為（92.13±7.91）g。

1.2 試驗(yàn)魚養(yǎng)殖

分組飼養(yǎng)試驗(yàn)采用9個(gè)內(nèi)徑1.0 m、高0.5 m的圓形網(wǎng)箱，將9個(gè)網(wǎng)箱置于同1口養(yǎng)殖水體約23 m3的圓形養(yǎng)殖池中。該養(yǎng)殖池位于1套循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。整套循環(huán)水系統(tǒng)包含8口養(yǎng)殖池及1套水處理系統(tǒng)，其中1口養(yǎng)殖池用于本次試驗(yàn)研究，其余7口池養(yǎng)殖同批次的赤點(diǎn)石斑魚，養(yǎng)殖密度約60尾/m3。養(yǎng)殖池水每天循環(huán)處理6～8次，水溫在（24.0±1.0）℃，鹽度25～27，氨氮質(zhì)量濃度≤0.1 mg/L，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度≤0.05 mg/L。試驗(yàn)期間光照為自然光照，每天投飼2次（8：00、16：00），表觀飽食投喂，記錄投飼量。試驗(yàn)共進(jìn)行56 d。

1.3 樣品采集與指標(biāo)分析

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，稱量各組試驗(yàn)魚。于每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取樣10尾魚，稱取魚體質(zhì)量、內(nèi)臟質(zhì)量、肝臟質(zhì)量。按照以下公式計(jì)算特定生長(zhǎng)率（specific growth rate，SGR）、飼料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）、臟體比（viscerosomatic index，VSI）和肝體比（hepatosomatic index，HSI）。

RSG=100×（lnWt-lnW0）/t （1）

RFC=Fv/（Wt-W0） （2）

IVS=100×Wv/Wb （3）

IHS=100×Wh/Wb （4）

式（1）～（4）中，RSG表示特定生長(zhǎng)率（%/d），Wt表示終末體質(zhì)量（g），W0表示初始體質(zhì)量（g），t表示飼養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)（d）；RFC表示飼料系數(shù)，F(xiàn)v表示攝食總量（g）；IVS表示臟體比，Wv表示魚的內(nèi)臟質(zhì)量（g），Wb表示魚的平均終末體質(zhì)量（g）；IHS表示肝體比，Wh表示魚的肝臟質(zhì)量（g）。

1.3.2 血清生化指標(biāo)分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每箱隨機(jī)取樣10尾魚，抽取尾靜脈血。采集的血樣置于4 ℃冰箱靜置4 h后，以5 000 r/min離心10 min，收集上層血清，用于測(cè)定生化指標(biāo)。本試驗(yàn)共測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、血清溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等8項(xiàng)血清生化指標(biāo)，檢測(cè)方法按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 腸道菌群分析

試驗(yàn)結(jié)束后，每箱隨機(jī)采樣10尾魚，在冰盤上解剖，將魚的腸道內(nèi)含物擠出。每5尾魚的腸道內(nèi)容物混合后作為1個(gè)樣品，裝入2 mL凍存管中，液氮速凍，-80 ℃保存，用于腸道菌群分析。

將石斑魚腸道樣品送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行腸道菌群基因組DNA的提取和測(cè)序。利用16S rDNA基因的可變區(qū)V3～V4通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［6］，建立細(xì)菌16S rDNA文庫(kù)。采用FLASH 1.2.11軟件和cutadapt 2.6軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行拼接和過濾，得到的數(shù)據(jù)為有效序列（clean tags）；利用USEARCH（v7.0.1090）軟件將拼接好的tags聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），得到OTU代表序列后，通過RDP classifer軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.6。在上述數(shù)據(jù)處理的基礎(chǔ)上，展開Alpha多樣性（Alpha diversity）指數(shù)分析，計(jì)算豐富度指數(shù)（Chao1）、物種豐度指數(shù)（abundance-based coverage estimator metric，Ace）、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)和覆蓋率（coverage），得到每個(gè)樣品的物種豐富度和多樣性信息；進(jìn)行門、屬水平物種分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncan’s方法進(jìn)行組間多重比較，設(shè)P＜0.05為差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)的影響見表1。試驗(yàn)期間，各組赤點(diǎn)石斑魚的成活率均為100%。添加0.5%枯草芽孢桿菌的F1組，其特定生長(zhǎng)率高于F0組與F2組，但組間無顯著性差異（P＞0.05）。飼料系數(shù)隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而降低，但各組間也無顯著性差異（P＞0.05）。臟體比隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而增加，各組間同樣差異不顯著（Pgt;0.05）。添加1.0%枯草芽孢桿菌的F2組，其肝體比顯著低于F0組和F1組（Plt;0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚血清生化指標(biāo)的影響

枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚血清生化指標(biāo)的影響見表2。由表2可見，飼料中添加枯草芽孢桿菌后，試驗(yàn)魚的SOD、ACP和AKP活性均有所提高，F(xiàn)1組和F2組的SOD、ACP活性顯著高于F0組（P＜0.05），添加1.0%枯草芽孢桿菌F2組的AKP活性顯著高于F0組和F1組（P＜0.05）。飼料中添加枯草芽孢桿菌后，試驗(yàn)魚血清中的TC、HDL-C和LDL-C均有一定程度的升高，其中F2組TC、HDL-C和LDL-C顯著高于F0組和F1組（P＜0.05）。LZM、TG含量在各組之間有一定的波動(dòng)，但組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚腸道菌群的影響

2.3.1 物種韋恩圖分析

通過16S rRNA高通量測(cè)序，共獲得試驗(yàn)赤點(diǎn)石斑魚腸道樣品的OUT數(shù)量為1 267。對(duì)各組做韋恩圖（VEEN）分析，結(jié)果顯示，3組共享的OUT數(shù)量為434，各組特有的OUT數(shù)量隨著枯草芽孢桿菌添加量的增大而增加，F(xiàn)0、F1和F2組OUT數(shù)量分別為106、181、237（見圖1）。

2.3.2 Alpha多樣性分析

試驗(yàn)魚腸道菌群Alpha多樣性分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3個(gè)試驗(yàn)組的覆蓋率達(dá)到99.8%以上，數(shù)據(jù)基本包含了大多數(shù)的細(xì)菌物種。隨著飼料中枯草芽孢桿菌的添加，腸道菌群的豐富度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中F2組的Chao1指數(shù)顯著高于F0組和F1組（Plt;0.05），F(xiàn)1組的Ace指數(shù)顯著高于F0組（Plt;0.05）。Simpson和Shannon指數(shù)表明，物種多樣性隨著飼料中枯草芽孢桿菌的添加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。

試驗(yàn)魚腸道菌群中門水平和屬水平的物種相對(duì)豐度結(jié)果見圖2。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌群，厚壁桿菌門（Firmicutes）為次優(yōu)勢(shì)菌群。隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，梭桿菌門（Fusobacteria）的豐度明顯下降，而擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度明顯增高。

在屬水平上，發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）為優(yōu)勢(shì)菌群，羅姆布茨菌屬（Romboutsia）為次優(yōu)勢(shì)菌群。隨著飼料中添加枯草芽孢桿菌濃度的增加，弧菌屬（Vibrio）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）和丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）的豐度有所降低，而狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）的豐度有所增加。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

芽孢桿菌是目前較為廣泛使用的一種微生物制劑。有研究表明，其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［7-8］。本試驗(yàn)中，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚的特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)影響不顯著，這與對(duì)鯉［9］、青魚［10］及雜交石斑魚［11］的研究結(jié)果類似。但本試驗(yàn)中，飼料中添加芽孢桿菌顯著降低了F2組的肝體比，這說明飼料中添加一定濃度的枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚的生理有影響，但是對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響較小。

3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚血清生化的影響

血清生化指標(biāo)常被用于評(píng)價(jià)魚體的健康狀況，SOD、LZM、AKP、ACP等在魚類免疫抗病方面起著非常重要的作用，其活性的高低常常被用作衡量魚類免疫力的參照指標(biāo)［12-13］。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)，SOD將歧化生成過氧化氫和活性氧，活性氧能高效殺滅病原微生物；AKP和ACP是能催化各種磷化物反應(yīng)的非特異性免疫酶類，起到物質(zhì)的磷酸基轉(zhuǎn)移功能，是動(dòng)物體內(nèi)重要的解毒免疫酶。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌可以提高赤點(diǎn)石斑魚血液內(nèi)SOD、AKP、ACP的活性，增強(qiáng)血清非特異性免疫力，這與鯽［14］、羅非魚［8］和大菱鲆［15］的研究結(jié)果相似。

血清高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，與甘油三酯和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)［16］。有研究表明，枯草芽孢桿菌能調(diào)節(jié)血脂代謝及緩解肝臟損傷［1］。本試驗(yàn)中，添加1.0%枯草芽孢桿菌的F2試驗(yàn)組，其TC、HDL-C和LDL-C都顯著高于F0組和F1組，說明飼料中添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的芽孢桿菌能提高機(jī)體甘油三酯和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少脂肪在肝臟中的積累，這一結(jié)果也與本試驗(yàn)中F2組肝體比顯著低于F0和F1組的數(shù)據(jù)相吻合。

3.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚腸道菌群的影響

魚類腸道內(nèi)有大量細(xì)菌，微生物群在不斷繁衍的同時(shí)，也受到外界條件的影響，其中食物是影響魚類腸道微生物群落結(jié)果的重要因素之一。有研究表明，厚壁桿菌門、變形菌門、擬桿菌門的種

圖2 腸道菌群中門和屬水平的物種相對(duì)豐度

類是魚類腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，占總菌群數(shù)的90%以上，對(duì)魚類營(yíng)養(yǎng)吸收和免疫反應(yīng)都有重要的作用［17-18］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，赤點(diǎn)石斑魚腸道中厚壁桿菌門、變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌群，這與上述研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加而減少，尤其是其中的鯨桿菌屬在F2組的豐度相對(duì)較低，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)赤點(diǎn)石斑魚腸道的優(yōu)勢(shì)菌群造成了一定的影響，這與張書環(huán)等［19］對(duì)雜交鱘的研究結(jié)果一致。

腸道菌群的多樣性有助于維持其生態(tài)功能，當(dāng)腸道菌群多樣性降低時(shí)，機(jī)體患病的幾率增加。本研究中各試驗(yàn)組特有的OTU數(shù)量均高于對(duì)照組，這說明飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高赤點(diǎn)石斑魚腸道菌群的多樣性，改善菌群的微生態(tài)。李衛(wèi)芬等［20］在草魚飼料中添加枯草芽孢桿菌后，顯著提高了腸道枯草芽孢桿菌和假單胞菌的數(shù)量，而致病性弧菌和大腸桿菌數(shù)量極顯著降低。胡娟等［9］的研究結(jié)果也表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌可減少鯉腸道內(nèi)大腸桿菌等有害菌的數(shù)量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌可以增加赤點(diǎn)石斑魚腸道芽孢桿菌的數(shù)量，減少弧菌數(shù)量，降低魚體患病風(fēng)險(xiǎn)，這與上述研究結(jié)果相一致。

4 小結(jié)

試驗(yàn)表明，在赤點(diǎn)石斑魚飼料中添加商品枯草芽孢桿菌能降低魚的肝體比，增強(qiáng)血液中SOD、AKP、ACP的活性，改善其腸道菌群，可以有效提高魚體的免疫力。

參考文獻(xiàn)

［1］羅燕兒，趙慧，郭道遠(yuǎn)，等.枯草芽孢桿菌對(duì)草魚肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2020，44（3）：485-493.

［2］蔡紅丹，莫坤聯(lián)，胡永華，等.飼料中添加復(fù)合芽孢桿菌對(duì)石斑魚生長(zhǎng)、免疫及腸道菌群的影響［J］.飼料研究，2021，44（21）：64-70.

［3］AI Q H，XU H G，MAI K S，et al.Effects of dietary supplementation of Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on growth performance，survival，non-specific immune response and disease resistance of juvenile large yellow croaker， Larimichthys crocea［J］.Aquaculture，2011，317（1/2/3/4）：155-161.

［4］張冬梅，顏浩驍，羅茂林，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)、腸道組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、免疫能力和腸炎的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2022，34（1）：575-588.

［5］惠明，竇麗娜，田青，等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（27）：11623-11624.

［6］XU N，TAN G C，WANG H Y，et al.Effect of biochar additions to soil on nitrogen leaching，microbial biomass and bacterial community structure［J］.European Journal of Soil Biology，2016，74：1-8.

［7］劉波，劉文斌，王恬.地衣芽孢桿菌對(duì)異育銀鯽消化機(jī)能和生長(zhǎng)的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：80-84.

［8］程遠(yuǎn)，黃凱，黃秀蕓，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)吉富羅非魚幼魚生長(zhǎng)性能、免疫力和抗氧化功能的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（6）：1503-1512.

［9］胡娟，高辰辰，藥園園，等.飼用枯草芽孢桿菌HGcc-1對(duì)鯉腸肝健康、血清補(bǔ)體及腸道菌群的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2021，45（10）：1753-1763.

［10］沈斌乾，陳建明，郭建林，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)青魚生長(zhǎng)、消化酶活性和魚體組成的影響［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（1）：48-53.

［11］蔣鑫濤，陳有銘，黃鑒鵬，等.復(fù)合益生菌對(duì)雜交石斑魚生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和腸道健康的影響［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，43（5）：81-91.

［12］HOSEINIFAR S H，MIRVAGHEFI A，MERRIFIELD D L.The effects of dietary inactive brewer’s yeast Saccharomyces cerevisiae var.ellipsoideus on the growth，physiological responses and gut microbiota of juvenile beluga（Huso huso）［J］.Aquaculture，2011，318（1/2）：90-94.

［13］WANG X，MARTNEZ M A，DAI M H，et al.Permethrin-induced oxidative stress and toxicity and metabolism.A review［J］.Environmental Research，2016，149：86-104.

［14］邵林，李璟，樂露，等.枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌對(duì)鯽魚免疫機(jī)能的影響及其代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（20）：176-178.

［15］邢憲利，苑雪靜，臧廣賀.復(fù)合益生菌對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能、免疫及腸道健康的影響［J］.飼料研究，2022，45（5）：62-66.

［16］王壇，華雪銘，朱偉星，等.飼料溶菌酶添加水平對(duì)氨氮應(yīng)激下吉富羅非魚血清生化指標(biāo)、抗菌性能和肝臟抗氧化能力的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2016，40（5）：740-750.

［17］RIMOLDI S，TEROVA G，ASCIONE C，et al.Next generation sequencing for gut microbiome characterization in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss） fed animal by-product meals as an alternative to fishmeal protein sources［J］.PLoS One，2018，13（3）：e0193652.

［18］LOPETUSO L R，SCALDAFERRI F，PETITO V，et al.Commensal Clostridia：leading players in the maintenance of gut homeostasis［J］.Gut Pathogens，2013，5（1）：23.

［19］張書環(huán)，吳金平，褚志鵬，等.飼喂枯草芽孢桿菌對(duì)雜交鱘生長(zhǎng)和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響［J］.海洋漁業(yè)，2021，43（1）：71-80.

［20］李衛(wèi)芬，沈濤，陳南南，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚消化酶活性和腸道菌群的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：221-225.

Effects of dietary supplementation of Bacillus subtilis on growth，

immunity and intestinal microbiota of red spotted grouper Epinephelus akaara

MA Jianzhong1，2， REN Peng1，2， CHEN Shun3，

YAN Maocang1，2， CHEN Wandong3， XIE Shangwei3， SHAO Xinbin1，2，

LI An1，2， ZHANG Lining1，2

（1. Zhejiang Mariculture Research Institute， Wenzhou 325005，

China; 2. Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of

Coastal Bio-resource， Wenzhou 325005， China;

3. Nanji Islands National Marine Nature Reserve Administration，

Wenzhou 325400， China）

Abstract： To investigate the effects of dietary Bacillus subtilis on the growth， immunity， and intestinal microbiota of red spotted grouper （Epinephelus akaara）， three diets were formulated to contain 0， 0.5%， and 1.0% of B. subtilis to carry the feeding trial for 56 days. Each group had three replicates， and the fish had an average initial body weight of （92.13±7.91） g. The results showed that supplementation with B. subtilis in the feed had no significant effect on specific growth rate and feed coefficient of E. akaara （Pgt;0.05）. The supplementation with B. subtilis significantly increased the activities of serum superoxide dismutase（SOD）， acid phosphatase（ACP）， and alkaline phosphatase（AKP） （Plt;0.05）， but had no significant effect on the activity of serum lysozyme （LZM）（Pgt;0.05）. The diet adding 1.0% B. subtilis significantly increased the total cholesterol（TG）， high-density lipoprotein（HDL-C）， and low-density lipoprotein（LDL-C） contents in the serum （Plt;0.05）. The diet supplemented with B. subtilis increased the abundance of Clostridium sensu stricto， Turicibacter， and Bacillus， while reducing the abundance of Vibrio， Cetobacterium， and Erysipelothrix. In summary， the results indicate that adding B. subtilis to the feed can enhance the immunity of red spotted grouper and improve the structure of their intestinal microbiota.

Key words： Epinephelus akaara; Bacillus subtilis; immunity; intestinal microbiota