大西洋鮭傳染性胰腺壞死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其表達(dá)

摘 要：

傳染性胰腺壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis，IPN）是由傳染性胰腺壞死病病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起的一種主要危害鮭科魚類的傳染病。為克隆傳染性胰腺壞死病病毒（IPNV）VP2基因和VP3基因，并構(gòu)建其重組腺病毒載體，利用PCR方法分別擴(kuò)增出IPNV VP2基因和VP3基因，通過多基因片段同源重組技術(shù)將IPNV VP2基因和VP3基因克隆到pAd-Track-CMV載體，經(jīng)過線性化后與pAd-easy-1載體在BJ5183菌體內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建出重組腺病毒質(zhì)粒；通過PCR及Not Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，再經(jīng)Pac Ⅰ線性化后用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得重組腺病毒；通過綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)監(jiān)控重組腺病毒的復(fù)制情況，用Western-blotting法分別檢測IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的表達(dá)，并測定重組病毒滴度。結(jié)果顯示，分別克隆出IPNV VP2和VP3基因，基因總長度為2 211 bp，構(gòu)建出目的基因重組腺病毒載體，該病毒在293T細(xì)胞中分別表達(dá)出蛋白分子質(zhì)量約為54 kD和26 kD的產(chǎn)物，滴度為1.0×109 個(gè)/mL TCID50。結(jié)果表明，已成功獲得IPNV VP2基因和VP3基因重組腺病毒，該病毒在293T細(xì)胞中滴度較高，能夠穩(wěn)定表達(dá)。傳染性胰腺壞死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重組腺病毒載體的成功構(gòu)建可為大西洋鮭傳染性胰腺壞死病活載體疫苗的研制提供參考。

關(guān)鍵詞：大西洋鮭；傳染性胰腺壞死??；VP2基因；VP3基因；腺病毒載體

傳染性胰腺壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis，IPN）是由傳染性胰腺壞死病病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起的一種主要危害鮭科魚類的傳染?。?-2］。該病常見于多種水生動(dòng)物中，由于極高的死亡率，嚴(yán)重威脅著許多海洋魚類、淡水魚類和軟體動(dòng)物等多種水生動(dòng)物［3-4］。IPN在美國、歐洲、亞洲、澳大利亞和南非等多個(gè)國家和地區(qū)的鮭科魚類養(yǎng)殖場先后被報(bào)道，給世界各國的鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5-8］。IPNV是一種無包膜的雙鏈RNA病毒，隸屬于水生動(dòng)物雙RNA病毒屬［1，9］。該病毒分為A段和B段，其中A段編碼VP2、VP3、VP4和VP5這4種蛋白；B段編碼1種RNA聚合酶蛋白（VP1）。其中VP2和VP3兩種蛋白是IPNV的主要結(jié)構(gòu)蛋白［1-2］。VP2蛋白和VP3蛋白含有病毒的大部分中和表位，與病毒的毒力相關(guān)。這些表位可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗IPNV中和抗體［1，2，9-11］。

近年來，對重組腺病毒載體的研究越來越受到人們關(guān)注。由于重組腺病毒具有滴度高、轉(zhuǎn)染效率高和不會(huì)將外源基因組整合到宿主基因組中的優(yōu)點(diǎn)，因而該病毒載體被廣泛用于多種基因的表達(dá)和多種病原體疫苗的基因傳遞［12-16］。重組腺病毒能夠有效地將外源基因轉(zhuǎn)移到多種細(xì)胞系中，并且可以刺激宿主機(jī)體對目的基因產(chǎn)生強(qiáng)有效和持續(xù)的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［12，17］。同時(shí)，重組腺病毒能夠感染多種硬骨魚細(xì)胞系［18］。另外，口蹄疫病毒2A肽（foot-and-mouth disease virus 2A peptide，F(xiàn)2A）蛋白長度較短、能夠高效率切割位于F2A肽上游和下游的基因，從而被廣泛用于單個(gè)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行多個(gè)病原基因的表達(dá)［19-21］。

本研究分別擴(kuò)增出IPNV VP2基因和VP3基因，以重組腺病毒作為基因傳遞載體，利用具有高切割效率的F2A肽，構(gòu)建出能夠同時(shí)表達(dá)IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體并獲得重組腺病毒，旨在為傳染性胰腺壞死病重組腺病毒疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體、細(xì)菌菌株和主要試劑

pAd-Track-CMV載體、pAd-easy-1載體、BJ5183感受態(tài)細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DH10B感受態(tài)細(xì)胞，均購自上海秋爽生物科技有限公司。

多基因片段同源重組克隆試劑盒、RNA提取試劑盒、GXL DNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶，均購自NEB（北京）生物技術(shù)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自德國羅氏公司（Roche）；細(xì)胞高糖培養(yǎng)基（D-MEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），均購自美國Gibco公司；DNA Marker，購自上海百賽生物科技有限公司；小鼠抗IPNV，購自美國CD公司；脂質(zhì)體（LipofectamineTM）3000，購自美國英杰生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑，購自美國Sigma生物科技有限公司。

1.1.2 陽性病毒樣品與細(xì)胞系

IPNV陽性病料（腎臟、脾臟等組織）采集于青海省尖扎縣某大西洋鮭養(yǎng)殖基地。人胚腎細(xì)胞系（293T）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所提供。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、核酸電泳系統(tǒng)、紫外凝膠成像系統(tǒng)，均購自北京六一儀器有限公司；蛋白電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，均購自美國伯樂儀器有限公司；組織破碎儀，購自德國Eppendorf公司；低溫離心機(jī)、CO2恒溫培養(yǎng)箱，均購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）的擴(kuò)增

選用GenBank上已經(jīng)公開發(fā)表的IPNV VP2和VP3基因序列（登錄號：KF279643.1），應(yīng)用DNA Star分別設(shè)計(jì)出特異性引物。IPNV VP2基因正向擴(kuò)增引物增加了pAd-Track-CMV載體同源臂和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)：5′-ATCTCTAGACCATGGCAGCTGCGCCGGCGATGAACACAAACAAGGCAACC-3′，反向擴(kuò)增引物：5′-GTTGGTCTTGGTGAGATCTCC-3′；IPNV VP3基因正向擴(kuò)增引物：5′-ATGGACGAGGAACTGCAACGCCT-3′，反向擴(kuò)增引物增加了pAd-Track-CMV載體同源臂和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)：5′-CTAGCCTATAGAATAGATCAAGCTTCACCTCAGCGTTGTCTCCG-3′；從GenBank獲得的F2A基因序列（登錄號：AJ251473.1）由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。F2A肽基因克隆正向擴(kuò)增引物：5′-AGATCTCACCAAGACCAACAACTTTGACCTGTTAAAGT-3′，反向擴(kuò)增引物：5′-GTTCCTCGTCCATGGTTGGACTCAACGTCTCCCGC-3′。

按照RNA提取試劑盒說明書提取IPNV總RNA。使用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒以提取的RNA為模板合成cDNA。反應(yīng)總體系為20 μL，包括1.0 μg總RNA，1.0 μL Oligo（dT）18引物，0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶，4.0 μL酶緩沖液，1.0 μL蛋白酶抑制劑，2.0 μL脫氧核苷酸，加DEPC水使體系為20 μL；反應(yīng)條件為：65 ℃反應(yīng)10 min，55 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min。

以合成的cDNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，即10×PrimeSTAR GXL緩沖液5.0 μL、dNTP混合物4.0 μL、GXL DNA聚合酶1.0 μL、cDNA 4.0 μL，正、反向引物各（10 μmol/L）1.5 μL，加DEPC水使體系為50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸4 min，共31次循環(huán)；72 ℃反應(yīng)10 min。將8.0 μL的PCR產(chǎn)物加到1.5%核酸電泳中進(jìn)行驗(yàn)證。分別克隆出IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因的陽性產(chǎn)物后，送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果拼接并與目的序列進(jìn)行比對分析。

1.3 目的基因（IPNV VP2基因、F2A基因和IPNV VP3基因）和pAd-Track-CMV載體的同源重組

將5 ng IPNV VP2基因PCR產(chǎn)物、30 ng F2A基因PCR產(chǎn)物、5 ng IPNV VP3基因PCR產(chǎn)物、20 ng線性化pAd-Track-CMV載體、1 μL快速融合酶及2 μL 10×酶緩沖液加入到反應(yīng)體系，并加ddH2O使總體系為20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃孵育30 min；孵育結(jié)束后馬上將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h，挑取較小菌落培養(yǎng)后利用PCR篩選陽性。PCR鑒定正向引物：5′-ATGAACACAAACAAGGCAACC-3′，反向引物：5′-CACCTCAGCGTTGTCTCCG-3′。對陽性產(chǎn)物大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并用Not Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切鑒定，篩選為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序結(jié)果用BLAST分析，以鑒定PCR產(chǎn)物與目的序列之間的氨基酸是否存在差異。同時(shí)設(shè)置pAd-Track-CMV空載體作為陰性對照。

1.4 pAd-Track-CMV載體與pAd-Easy-1載體的重組連接

將pAd-Easy-1載體轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性BJ5183細(xì)菌做成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，置于液氮中保存待用。

將“1.3”中所述連接成功的重組質(zhì)粒用Pme I酶切使之線性化，按照PCR Clean-up試劑盒說明書純化酶切產(chǎn)物。將10 μL純化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至40 μL電感受態(tài)BJ5183細(xì)胞中，電擊條件：電壓2 500 V，電阻200 Ω，電容25 μF，電擊時(shí)長5 ms。電擊后，將重組混合物涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h，挑選較小的菌落培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物用0.8%的核酸電泳進(jìn)行檢測，對陽性產(chǎn)物大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并用PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定。同時(shí)將pAd-Track-CMV空載體和pAd-Easy-1載體的重組空質(zhì)粒作為陰性對照。

使用與上述電擊相同的條件，將篩選的陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到DH10B感受態(tài)細(xì)胞中。挑取菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并用PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定，陽性酶切產(chǎn)物回收后用于下一步轉(zhuǎn)染。

1.5 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前24 h，將293T細(xì)胞以1.0×107 個(gè)/mL接種于25 cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁率為瓶底面積的60%～80%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。用2 mL的D-MEM將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌2～3次，加入2 mL空白的D-MEM，于37 ℃孵育30 min。吸取30 μL LipofectamineTM3000加到900 μL D-MEM中，制成細(xì)胞培養(yǎng)液A；將4 μg線性化重組腺病毒質(zhì)粒加入培養(yǎng)液A中，于37 ℃下孵育20 min；將孵育好的混合培養(yǎng)液加入到細(xì)胞中，于37 ℃孵育4 h；之后棄去培養(yǎng)液，補(bǔ)加10 mL含有10%FBS的D-MEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，通過觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）來檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞上表達(dá)出最強(qiáng)的GFP時(shí)，小心棄去5 mL上層細(xì)胞培養(yǎng)液，收集剩余的培養(yǎng)液進(jìn)行病毒傳代［22］。

1.6 抗原蛋白的Western-blotting檢測

收集感染293T細(xì)胞的病毒液并用RIPA裂解緩沖液裂解5 min，收集裂解后的蛋白樣品之后，用超聲波進(jìn)行破碎處理（40 W作用3 s，間隔3 s，重復(fù)20次），在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，吸取上清液加入6× Loading Buffer，95 ℃作用10 min。將制備的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件：電壓80 V電泳1 h，之后將電壓調(diào)至120 V直至結(jié)束。以β-actin作為對照組，參考蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)切下凝膠，將待測蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，反應(yīng)條件：電流200 mA電泳2 h。結(jié)束后，將膜置于配制的50 g/L牛血清白蛋白中封閉1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。將封閉好的膜與1∶1 000稀釋的鼠抗IPNV一抗孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；之后將該膜與1∶2 000稀釋的羊抗鼠二抗孵育2 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后加入配制的顯影劑，檢測膜的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)［23］。

1.7 病毒滴度的測定

將繁殖10代后收集的病毒液用D-MEM從10-1連續(xù)稀釋到10-11。稀釋好的病毒分別接種于含有293T細(xì)胞的96孔板內(nèi)。每個(gè)稀釋度接種100 μL，相同稀釋度重復(fù)8個(gè)孔。接種24 h后，通過每天觀察每個(gè)孔的GFP和細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect， CPE）來確定病毒的病變情況。將記錄的每孔CPE情況使用Reed-Muench方法計(jì)算得到重組病毒的滴度［22-23］。

2 結(jié)果

2.1 IPNV VP2基因和VP3基因的克隆結(jié)果

IPNV VP2基因和VP3基因的重組腺病毒構(gòu)建結(jié)果見圖1。PCR產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到了總長度為2 211 bp的基因片段，與預(yù)期的目的基因片段長度一致。

2.2 重組質(zhì)粒分析

經(jīng)PCR鑒定，目的基因產(chǎn)物（VP2基因、F2A基因和VP3基因）的擴(kuò)增長度為2 211 bp，見圖1-（a）。通過Not Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后得到2 211 bp和9 200 bp兩個(gè)片段，見圖1-（b），與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果表明，利用多基因片段同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了pAd-Track-CMV重組質(zhì)粒。

2.3 同源重組的鑒定

pAd-Track-CMV載體和pAd-Easy-1載體同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果利用PCR和PacⅠ酶切來驗(yàn)證，鑒定結(jié)果見圖1（c）。PCR產(chǎn)物的長度為2 211 bp。經(jīng)PacⅠ酶切，能夠得到大約33.7 kb和4.5 kb的兩條清晰條帶。結(jié)果表明，利用同源重組技術(shù)已成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒。

2.4 抗原蛋白的檢測

將重組腺病毒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過Western-blotting方法檢測VP2蛋白和VP3蛋白的表達(dá)情況。相較于對照組，重組腺病毒分別檢測出分子量約為54 kD和26 kD的兩條蛋白條帶（見圖2）。結(jié)果表明，在收獲的重組腺病毒中能夠表達(dá)出VP2蛋白和VP3蛋白。

2.5 病毒滴度的測定

轉(zhuǎn)染重組腺病毒后，36 h后逐漸能夠觀察到細(xì)胞中的GFP，待70%～80％的細(xì)胞上出現(xiàn)GFP和CPE時(shí)（見圖3），收獲此時(shí)的病毒液反復(fù)凍融2～3次用于傳代。

重組腺病毒傳至10代后，接種于293T細(xì)胞上，36 h之內(nèi)便可出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。根據(jù)Read-Muench方法計(jì)算，重組腺病毒滴度為1.0×109個(gè)/mL TCID50。

3 討論

鮭科魚類是深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖的重要品種，目前已經(jīng)在“深藍(lán)1號”全潛式深海漁場等項(xiàng)目中養(yǎng)殖成功。在此背景下，積極開展魚病防治技術(shù)研究，有利于深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［24-26］。

傳染性胰腺壞死病（IPN）主要以感染鮭科魚類幼魚為主，能夠引起極高的死亡率，近年來，已給全球多個(gè)國家的鮭鱒魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失［27-29］。IPN于1986年在中國東北地區(qū)被報(bào)道［23］。由于缺乏強(qiáng)有力的防控措施，該病的暴發(fā)頻繁，目前已遍布于中國青海、甘肅及遼寧等多個(gè)省，成為威脅中國現(xiàn)代化鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的傳染?。郏?3］。

疫苗接種是有效控制傳染病大規(guī)模暴發(fā)的最佳方法之一［23］。目前多個(gè)國家和地區(qū)的研究人員已經(jīng)研發(fā)出多種用于防控IPN的疫苗，如亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒疫苗和DNA疫苗等［5，9-11，15］，其中一種IPN口服酵母疫苗在荷蘭獲得生產(chǎn)許可并被商業(yè)化應(yīng)用到鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)中。盡管研究人員已經(jīng)研制出多種用于防控IPN的候選疫苗，但此類疫苗在保護(hù)虹鱒等鮭科魚類免受IPNV感染時(shí)均表現(xiàn)出較差的免疫反應(yīng)［11］。因此，在鮭科魚類養(yǎng)殖過程中，IPN的暴發(fā)仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的問題，亟需開發(fā)出保護(hù)效果更佳、使用更為便利的疫苗用于防控IPN。本研究將IPNV VP2基因和VP3基因共同構(gòu)建到腺病毒載體上，利用具有自切割功能的F2A肽蛋白，使得重組腺病毒載體可以同時(shí)表達(dá)出IPNV VP2蛋白和VP3蛋白，為下一步研發(fā)出傳染性胰腺壞死病活載體疫苗提供了前期的理論依據(jù)。

重組腺病毒具有極高的轉(zhuǎn)染效率，該病毒載體能夠在機(jī)體內(nèi)外高效率地轉(zhuǎn)染外源基因，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫和T細(xì)胞免疫反應(yīng)［30-31］。由于轉(zhuǎn)錄活性形式的活化T細(xì)胞的有效免疫反應(yīng)，使得重組腺病毒載體在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出持久性的免疫應(yīng)答反應(yīng)［32］。相比于傳統(tǒng)疫苗，重組腺病毒的安全性、長期持久的免疫應(yīng)答和較強(qiáng)的免疫原性使其成為用于疫苗開發(fā)的理想基因轉(zhuǎn)移載體［33-35］。在多種動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，腺病毒載體可以誘導(dǎo)比腸外免疫更有效的黏膜免疫反應(yīng)［30-31］。另外，腺病毒能夠感染EPC、CHSE-214等在內(nèi)的多種硬骨魚細(xì)胞系。本課題組之前以重組腺病毒作為載體，成功研發(fā)出傳染性造血器官壞死病的活體疫苗，并采用浸泡的免疫方式對虹鱒進(jìn)行免疫，結(jié)果表明，相比于對照組虹鱒，免疫組虹鱒的免疫反應(yīng)和血清中的抗體水平顯著升高，接種組虹鱒受到傳染性造血器官壞死病感染時(shí)的相對生存率（relative percentage survival，RPS）為92%［22］，這為重組腺病毒應(yīng)用于硬骨魚類多種疫病活載體疫苗的研制提供了參考。此外，F(xiàn)2A肽的側(cè)翼蛋白長度比較短，在其上游和下游的基因之間具有較高的切割效率［19］。因此，具有切割功能的F2A肽通常被用于表達(dá)兩種及兩種以上靶蛋白的理想選擇。

本研究采用多基因片段同源重組技術(shù)，能夠在短時(shí)間將IPNV VP2基因和VP3基因精確連接至pAd-Track-CMV載體，從根本上避免了傳統(tǒng)選用T載體進(jìn)行連接操作的復(fù)雜性，大大提高了目的基因和載體的連接效率。分別克隆了IPNV VP2基因和VP3基因，以腺病毒作為基因表達(dá)載體，利用具有高切割效率的F2A肽，通過在293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染以獲得高滴度重組腺病毒，構(gòu)建出可同時(shí)表達(dá)IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體。本研究中F2A肽的應(yīng)用使得腺病毒載體能夠同時(shí)表達(dá)出IPNV VP2蛋白和VP3蛋白，為研制出針對IPNV的活載體疫苗提供了可能。此外，傳統(tǒng)DNA疫苗需要進(jìn)行肌肉注射，在大西洋鮭等鮭科魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化中難以推廣，本研究利用重組腺病毒載體能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出持久性的免疫應(yīng)答，為虹鱒等鮭科魚類采用浸泡免疫方式進(jìn)行疫苗接種提供了可操作性，使得重組腺病毒載體有望應(yīng)用于防控虹鱒等鮭科魚類免受IPNV等病毒的感染。

綜上所述，本研究分別克隆出IPNV VP2基因和VP3基因，將F2A肽連接到IPNV VP2基因和VP3基因之間，通過在293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染以獲得高滴度重組腺病毒，構(gòu)建出能夠同時(shí)表達(dá)IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的重組腺病毒載體，為鮭科魚類傳染性胰腺壞死病活載體疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。

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Construction and expression of recombinant adenovirus vector against

infectious pancreatic necrosis with VP2

protein and VP3 protein of Atlantic salmon

LI Shouhu， QIN Chuang， LI Xincang， SHI Jiangao

（East China Sea Fisheries Research Institute，

Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 200090， China）

Abstract： Infectious pancreatic necrosis （IPN） was an infectious disease caused by infectious pancreatic necrosis virus （IPNV）， which mainly affected salmonids.To clone the infectious pancreatic necrosis virus （IPNV） VP2 gene and VP3 gene， constructed their recombinant adenovirus vector. In this study， the IPNV VP2 gene andVP3 gene were amplified and inserted into the pAd-Track-CMV vector by PCR and multi-gene fragment homologous recombination technology. After linearization， the recombinant plasmids were recombined with the pAd-easy-1 vector in E. coli BJ5183 to construct a recombinant adenovirus plasmid， which was identified by PCR and digestion with NotⅠand HindⅢ ， and then transfected into 293T cells to obtain the recombinant adenovirus after linearizing with PacⅠ. The viral replication was monitored using the expression of green fluorescent protein （GFP）. The expression of VP2 protein and VP3 protein were confirmed by the Western-blotting method， and the recombinant viral titer was detected. The results indicated that the IPNV VP2 gene and VP3 gene were cloned with a length of 2 211 bp， and the recombinant adenovirus vectors for the target genes were constructed. The virus could express a molecular mass of about 54 kD and 26 kD in 293T cells， respectively， with a titer of 1.0×109 cell/mL TCID50. The findings revealed that the recombinant adenovirus with the IPNV VP2 gene and VP3 gene was successfully obtained， and the virus had a high titer in 293T cells and could be expressed stably. The successful construction of recombinant adenovirus vectors with VP2 and VP3 proteins of IPNV could provide a reference for the development of the vaccine and better prevention of IPNV in Atlantic salmon.

Key words： Atlantic salmon; infectious pancreatic necrosis; VP2 gene; VP3 gene; adenovirus vector