壓切培養(yǎng)對刺五加莖尖分化增殖的作用

摘要：" 以刺五加腋芽為材料，研究了壓切培養(yǎng)技術(shù)對試管苗增殖的作用，篩選出增殖培養(yǎng)基配方：MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。結(jié)合此技術(shù)誘導(dǎo)試管苗分化，增殖倍數(shù)達4.0倍，可使新分化的芽苗快速進入自主生長，葉片展開，生長勢強，有利于培養(yǎng)試管壯苗，為生根培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：" 刺五加；" 壓切技術(shù)；" 增殖培養(yǎng)

中圖分類號：" "S 567. 1 + 90. 43" " " " " " " "文獻標識碼：" "A" " " " " " " " 文章編號：１００1 － 9499（２０25）01 － 0013 － 04

Effect of Pressure-cutting Culture on Differentiation andProliferation in Stem Tips of Acanthopanax senticosus

TIAN Xinhua GUO Qi WANG Fude LI Yanxia**

（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，" Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract In order to clarify the effect of pressure-cutting culture on the proliferation of tube seedlings， we used axillary buds of Acanthopanax senticosus as the study material and screened the proliferation medium： MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L. We found that a 4-fold increase in stem tip proliferation of tube seedlings， and led to a rapid growth of newly differentiated axillary buds， leaf unfolding and vigorous growth. This study facilitates the optimization of tube seedlings and provides a basis for rooting culture.

Key words Acanthopanax senticosus; pressure-cutting culture; proliferation culture

刺五加（Acanthopanax senticosus）為五加科，多年生落葉灌木，主要分布在中國東北、華北、陜西及俄羅斯和朝鮮等地[ 1 ] 。刺五加的根、根莖、根皮均可入藥，具有益氣健脾、補腎安神、抗腫瘤、增強機體免疫力的功效[ 2 - 4 ]，是極其珍貴的藥物資源。刺五加的嫩芽可以作為蔬菜、茶葉，因其含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油等特殊成分，營養(yǎng)價值也非常髙[ 5 - 7 ]。

刺五加種子質(zhì)量差，存在嚴重的生理后熟[ 8 ]，經(jīng)處理后萌發(fā)率仍低于30%[ 9 ]。刺五加組培過程一直存在微體生長速度慢、分化增殖困難，苗木不生根等技術(shù)難題，組織培養(yǎng)技術(shù)體系尚不成熟，嚴重制約了刺五加良種化進程。因此，本試驗通過對刺五加優(yōu)良單株展開研究，采用原創(chuàng)壓切培養(yǎng)方法，結(jié)合激素種類和濃度的篩選，攻克微體培養(yǎng)過程中的技術(shù)難關(guān)，提高苗木存活率，培育出試管壯苗，促進苗木生根，建立完善的組培體系，從而推動優(yōu)良品種的推廣與應(yīng)用。

1 試驗材料與方法

1. 1 供試材料預(yù)處理

2月初采集伊春市金山屯林場的刺五加優(yōu)良單株休眠枝條為供試材料，用清水反復(fù)沖洗，然后置于有光照的室內(nèi)，溫度控制在20～25 ℃，待休眠芽開始萌動即可利用。

1. 2 外植體的滅菌處理

待腋芽萌發(fā)后，剪取長約1.0 cm的單芽莖段，用軟毛牙刷刷洗帶刺莖段，放入燒杯中上面覆蓋紗布，流水沖洗2 h。在超凈工作臺上進行不同滅菌處理：

（1）2% NaClO浸泡4 min，用無菌水沖洗3次；

（2）75% 酒精浸泡30s，0.1% HgCI2浸泡2min，然后用無菌水沖洗3次；

（3）紫外線直射5 min，0.1% HgCI2浸泡4 min，然后無菌水浸泡30 min；

（4）0.1% HgCI2浸泡6 min，然后無菌水浸泡30 min。

以上材料滅菌后取出，用無菌濾紙吸干材料表面多余水分。每組處理8個腋芽，重復(fù)2次，7 d后觀察效果。

1. 3 誘導(dǎo)側(cè)芽生長

在超凈工作臺的無菌環(huán)境下，將帶芽的莖段接種于MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖 +瓊脂粉6 g/L培養(yǎng)基上（pH值調(diào)至5.8～6.0），誘導(dǎo)芽苗生長。

1. 4 壓切培養(yǎng)與試管苗分化增殖

待腋芽伸長、葉片展開后，轉(zhuǎn)接于以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（表1），培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L。采用L9（34）正交試驗設(shè)計表進行試管苗增殖培養(yǎng)基篩選。每個處理接種10瓶，重復(fù)2次，無菌條件下結(jié)合壓切技術(shù)培養(yǎng)試管苗，40 d后調(diào)查苗木的長勢及分化情況。

1. 5 培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

培養(yǎng)溫度控制在（24±2）℃，光照強度2 000 Lux，光照時長12 h/d。采用dps19.05統(tǒng)計軟件進行方差分析和差異顯著性測驗（LSD法）[ 11 ]。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同滅菌處理的效果

獲得無菌材料是組織培養(yǎng)過程的重要初始環(huán)節(jié)，要求選用的滅菌方法在保證對外植體損傷、褐化最小的前提下，降低污染率。由表2可見，處理1滅菌不充分，污染率較高（43.75%）；處理4滅菌過度，盡管污染率較低，但苗木損傷嚴重，大量褐化，嚴重影響外植體生長，甚至導(dǎo)致外植體死亡；處理3污染率為18.75%，褐化率25.00%，其他外植體均表現(xiàn)正常，是較適宜的滅菌方法。

2. 2 誘導(dǎo)側(cè)芽生長

將獲得的無菌外植體轉(zhuǎn)接入MS+KT 1.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右開始萌動，經(jīng)一周培養(yǎng)葉片展開，培養(yǎng)30 d后新生出葉片4～5片，葉片展開，葉色新綠，但主莖生長緩慢。在培養(yǎng)過程中每培養(yǎng)一周時間就轉(zhuǎn)接入新的培養(yǎng)基中，這種方法可減少褐化的產(chǎn)生。

2. 3 壓切技術(shù)在試管苗分化增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用

2. 3. 1 植物壓切培養(yǎng)技術(shù)

壓切培養(yǎng)技術(shù)是經(jīng)長期試驗摸索總結(jié)出來的一種試驗操作技術(shù)，該技術(shù)適用于無主莖或主莖生長緩慢，增殖困難，分化苗弱、成苗率低的植物。利用此項技術(shù)，在保證新分化出的幼苗獲得足夠營養(yǎng)的同時，又為其獨立生存創(chuàng)造條件，從而有利于提高分化苗的存活率，有利于培育出健壯試管苗，為生根培養(yǎng)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

2. 3. 2 結(jié)合壓切培養(yǎng)技術(shù)篩選增殖培養(yǎng)基

將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)苗分別轉(zhuǎn)入不同增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，待有分化苗產(chǎn)生后，在超凈工作臺無菌條件下，利用鑷子整體夾出，采用壓切方法部分切割，給分化苗基部造成傷口，然后整體轉(zhuǎn)接入相同處理的新培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，觀察到傷口處慢慢長出白色營養(yǎng)瘤，新分化出的小苗葉片展開，葉色轉(zhuǎn)綠，生長勢強于未經(jīng)壓切培養(yǎng)處理的分化苗。然后將分化苗徹底分離，獨立培養(yǎng)，獲得健壯的試管苗。試驗結(jié)果經(jīng)極差分析（表3），從各因素對苗木性狀影響的極差結(jié)果反應(yīng)：對于試管苗有效葉片數(shù)性狀而言，A因素極差5.15，B因素2.00；C因素1.82；D因素1.97；對于增殖倍數(shù)而言，A因素極差1.43，B因素0.75；C因素0.38，D因素0.27；即無論從有效葉片數(shù)還是分化增殖情況來講，KT（A）都是決定苗木生長分化的重要因素。從各因素對苗木性狀影響的均值結(jié)果反應(yīng)： 對于試管苗有效葉片數(shù)性狀而言，A因素的均值K2＞K3＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K3＞K1＞K2；D因素K2＞K1＞K3；對于增殖倍數(shù)而言，A因素的均值K3＞K2＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K1＞K3＞K2，D因素K2＞K1＞K3，即對苗木生長狀況影響最大的因素A（KT），其次是B因素（6-BA），并且分化數(shù)隨著他們濃度升高而增加。但在試驗中苗木還有其他反應(yīng)：即隨他們濃度增高，主莖生長會更慢，易形成叢生苗，葉片小，色淡，分化苗不易分割，分離往往造成苗木損失。方差分析結(jié)果（表4）表明，各因素間差異極顯著（p＜0.01）。按F值大小分析，影響苗木有效葉片數(shù)、分化增殖的主要因素仍是KT。按照植株上部生長情況的多重比較結(jié)果顯示（表5），以處理6培養(yǎng)的試管苗分化增殖苗數(shù)較多，葉片展開，有效葉片數(shù)也較多，便于壓切培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中苗木損失少，且與其他處理差異顯著。因此，選擇培養(yǎng)基（即處理6）MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 1.5" mg/L+NAA 0.2 mg/L為刺五加的分化增殖培養(yǎng)基，分化苗數(shù)較多，葉色深綠，頂芽新綠，植株生長健壯。

2. 3. 3 壓切培養(yǎng)對苗木生長的作用

將經(jīng)壓切技術(shù)與增殖培養(yǎng)（處理6）相結(jié)合培養(yǎng)的苗木與直接分化培養(yǎng)的苗木進行對比：結(jié)合培養(yǎng)出來的分化苗頂芽新綠，下部葉色深綠，葉片展開，主莖較粗，分離母體后可快速吸收營養(yǎng)，啟動自主生長能力強，存活率比直接切離母體的試管苗提高20%左右。

3 討 論

3. 1 刺五加屬于藥食兼用植物，一般長梗刺五加用作藥用，短梗刺五加做為蔬菜。從基礎(chǔ)苗木培養(yǎng)方面看，菜用品種更易培養(yǎng)，生長分化速度也較快；藥用品種則需要較長時間的前期積累，因品種不同無菌苗可能需要2個月左右的預(yù)培養(yǎng)，才能轉(zhuǎn)接入分化增殖培養(yǎng)階段。

3. 2 在植物組織培養(yǎng)中易出現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物褐化現(xiàn)象，這主要是切割外植體使植物受到創(chuàng)傷刺激，細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)流出，被氧化為褐色的醌類物質(zhì)，產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，導(dǎo)致植物生長受阻，甚至死亡，又稱之為酚污染現(xiàn)象[ 10 ]。目前可以通過不同的處理方法抑制外植體褐變：加入抗氧化劑、吸附劑、改變滲透壓[ 12 ]或低溫處理[ 13 ]等，但不同物種抑制褐變的方法也不盡相同，應(yīng)結(jié)合植物的具體生長情況選擇適宜的方法。本試驗在初代培養(yǎng)時通過不斷轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基減少褐變，效果較好。

3. 3 刺五加屬于不易打破自身生物調(diào)控的植物，先要獲得理想的培養(yǎng)結(jié)果，應(yīng)結(jié)合生長季進行。壓切培養(yǎng)是一種新型培養(yǎng)技術(shù)，適用于無主莖或主莖生長緩慢、不易伸長的植物。通過與其他培養(yǎng)方法結(jié)合，可以大大減低苗木死亡，有效提高分化苗存活率。

參考文獻

［1］ 胡秀艷，" 朱顯玲，" 王占新." 刺五加人工栽培技術(shù)［J］." 特種經(jīng)濟動植物， 2020， 23（7）： 23.

［2］ 粟杰，" 馮艷，" 林炳鋒." 刺五加化學(xué)成分的分離與鑒定［J］." 中草藥， 2021， 52（16）： 4783 - 4788.

［3］ 陳雁，" 陳漢坤，" 朱偉." 刺五加的研究進展和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用［J］.2024， 4（34）： 312 - 320.

［4］ 邢合龍." 遼西地區(qū)刺五加育種及林下種植管理技術(shù)研究［J］.中國林副特產(chǎn)， 2020，6（169）： 40 - 44.

［5］ 魯招弟." 刺五加經(jīng)濟價值及栽培技術(shù)［J］." 世界熱帶農(nóng)業(yè)信息， 2022（5）： 31 - 33.

［6］ 張順捷，" 李曉琳." 刺五加資源的開發(fā)利用［J］." 本草中國，2021（5）： 108 - 111.

［7］ 張?zhí)祆o，" 李玲，" 沈?qū)氂睿? 等." 刺五加特征特性及開發(fā)利用［J］.園藝與種苗， 2018（11）： 34 - 37.

［8］ 徐紹娣，" 李輝，" 張順捷." 刺五加實生苗生產(chǎn)中存在問題與分析［J］. 中國林副特產(chǎn)， 2017（5）： 95 - 96.

［9］ 呂艷雪." 刺五加栽培技術(shù)［J］." 特種動植物，" 2020（2）：" 31 - 33.

［10］ 沈海龍." 植物組織培養(yǎng)［M］." 北京：" 中國林業(yè)出版社， 2005

［11］ 唐啟義，" 馮明光." DPS19.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［M］." 北京：科學(xué)出版社， 2007.

［12］ 趙麗蒙，" 陸秀君，" 張麗杰，" 等." 衛(wèi)矛莖段組織培養(yǎng)中不定芽誘導(dǎo)［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2016， 44（12）： 21 - 25.

［13］ 張建瑛，" 殷東生，" 葛文志，" 等." 預(yù)處理對胡桃楸成熟胚不定芽的誘導(dǎo)［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2019， 47（2）： 21 - 24.