響應(yīng)面法優(yōu)化超聲誘導(dǎo)遼藁本種子萌發(fā)研究

摘要：" 為測試超聲誘導(dǎo)方法對促進遼藁本種子發(fā)芽的影響，本文就超聲功率、時間及水浴溫度等指標，研究了不同因素條件對遼藁本種子發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明：遼藁本種子發(fā)芽的優(yōu)化條件為超聲功率68 W，超聲時間5 min和超聲水浴溫度34 ℃；在此條件下遼藁本種子預(yù)期發(fā)芽率為51.89%，實驗驗證算術(shù)平均值為54.07%，最佳超聲誘導(dǎo)條件實驗組與空白組相比，發(fā)芽率提升了10.74%。本研究表明，適宜的超聲處理對遼藁本種子發(fā)芽率有積極的影響。

關(guān)鍵詞：" 遼藁本；" 發(fā)芽率；" 超聲誘導(dǎo)；" 響應(yīng)面法

中圖分類號：" "S 567" " " " " " " "文獻標識碼：" "A" " " " " " " " 文章編號：１００1 － 9499（２０25）01 － 0005－ 04

Optimization of Ultrasonic Induced Seed Germination of Ligusticum jeholensn by Response Surface Method

SHEN Qi1 GAO Zhitao1 BAI Xue1 ZHANG Wei1 YAN Lei2 WANG Honggang1**

（1." Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry，" Heilongjiang Yichun 153000 ;" 2." Yichun Forest Industry Shuangfeng Forestry Bureau Limited Liability Company，" Heilongjiang Yichun 153000）

Abstract In order to test the effect of ultrasonic induction on seed germination， the germination rate of Ligusticum jeholensn seed was studied by ultrasonic power， ultrasonic time and water bath temperature. The results showed that the optimal conditions for seed germination were ultrasonic power of 68W， ultrasonic time of 5min and ultrasonic water bath temperature of 34℃. Under these conditions， the expected germination rate of L. jeholensn seed was 51.89%， and the arithmetic mean value of experimental verification was 54.07%. Compared with the blank group， the germination rate of the experimental group under optimal ultrasonic induction conditions was increased by 10.74%. The results showed that suitable ultrasonic treatment had a positive effect on seed germination rate.

Key words Ligusticum jeholensn; germination rate; ultrasonic induction; response surface method

遼藁本（Ligusticum jeholensn）為傘形科藁本屬多年生草本植物，以根莖和根入藥[ 1 ]，為我國傳統(tǒng)大宗藥材，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[ 2 ]，性溫，味辛，具有祛風、散寒、除濕、止痛等功效，主治風寒感冒、巔頂疼痛、風濕痹痛等疾病[ 3 ]。其嫩莖葉富含人體所需的氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等[ 4 ]。長期的過度采挖導(dǎo)致了野生遼藁本的存量銳減，市場對其需求已超出自然供給能力，因此開展人工種植成為解決野生遼藁本資源短缺的有效途徑[ 5 - 6 ]。目前，在遼藁本人工栽培中，無性繁殖是主流方式，而種子繁殖的應(yīng)用相對較少，其中一個重要因素是遼藁本種子的發(fā)芽率普遍較低。相關(guān)研究指出，導(dǎo)致遼藁本種子休眠的關(guān)鍵原因，是種胚發(fā)育不成熟與存在抑制發(fā)芽的化學物質(zhì)的雙重影響[ 7 ]。這一現(xiàn)狀無疑給遼藁本的人工栽培技術(shù)帶來了顯著的挑戰(zhàn)，凸顯了現(xiàn)有繁殖方式的局限性。因此遼藁本的人工繁育方法急需優(yōu)化、改進，以提升繁殖效果，確保其可持續(xù)供應(yīng)。

傳統(tǒng)的遼藁本種子前期處理手段主要是以不同激素刺激或不同栽植基質(zhì)做為試驗設(shè)計手段。但傳統(tǒng)的處理手段存在種子催芽質(zhì)量難以控制、萌發(fā)率低、發(fā)芽時間不統(tǒng)一等弊端。近年來，超聲波技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥業(yè)等各領(lǐng)域。李占君等[ 8 ]發(fā)現(xiàn)超聲誘導(dǎo)可以促進防風種子的發(fā)芽，提高發(fā)芽率，并運用PBD（Plackett－Burman Design）進行關(guān)鍵因素的篩選，通過爬坡實驗得出關(guān)鍵因素的中心點，結(jié)合BBD（Box－Behnken Design）響應(yīng)面優(yōu)化影響發(fā)芽率的關(guān)鍵因素條件。王岸娜等[ 9 ]運用響應(yīng)面法研究了培養(yǎng)時間、浸泡時間和浸泡溫度對發(fā)芽藜麥黃酮、多酚、GABA含量積累的影響。王蔓等[ 10 ]通過對超聲單因素及響應(yīng)面的分析，確定了最佳的影響綠豆芽重超聲條件。

本研究主要利用創(chuàng)新手段，通過超聲波刺激誘導(dǎo)遼藁本種子發(fā)芽手段，對影響種子發(fā)芽的影響因素進行分析與研究。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了遼藁本種子進行超聲時的最優(yōu)功率、時間和水浴溫度，以期最大限度地提高遼藁本種子的發(fā)芽率。

1 材料與儀器

1. 1 實驗材料

供試材料為遼寧省撫順市農(nóng)業(yè)科學研究院“撫香葉芹1號”（2年生苗）的遼藁本種子。

超純水、次氯酸鈉、瓊脂粉、無水乙醇、酒精燈、脫脂棉、培養(yǎng)皿、量筒、濾紙、鑷子等。

1. 2 實驗儀器

KQ－100DE臺式數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CMPL－TP－40L超純水機，成都優(yōu)越科技有限公司；SW－CJ－2FD超凈工作臺，蘇州廣源凈化科技有限公司；MJ－500－11恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；其他儀器玻璃器皿等。

2 實驗方法

2. 1 遼藁本種子預(yù)處理

挑選大小接近、成熟飽滿、無霉變、無蟲蛀的遼藁本種子，去離子水沖洗去除種子表面浮塵，置于10 cm×14 cm加厚自封袋中，使用40 ℃溫水浸種24 h。

2. 2 超聲誘導(dǎo)單因素實驗

2. 2. 1 超聲功率

取適量經(jīng)預(yù)處理的遼藁本種子，以滅菌水為超聲傳輸介質(zhì)做超聲誘導(dǎo)處理。分別使用不同超聲功率40、60、80、100 W處理10 min，超聲水浴溫度40 ℃。超聲誘導(dǎo)處理完畢的種子先使用75%乙醇溶液浸泡20 s，使用滅菌水沖洗3遍，每次至少震蕩40次；再配合4%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，使用滅菌水沖洗3遍，每次至少震蕩40次；將處理好的遼藁本種子50粒/組置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基（WA），置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃，避光培養(yǎng)7 d后開始記錄，連續(xù)3d無發(fā)芽視為實驗終止，以此研究超聲功率對種子發(fā)芽率的影響。

2. 2. 2 超聲時間

取適量經(jīng)預(yù)處理的遼藁本種子，以滅菌水為超聲傳輸介質(zhì)做超聲誘導(dǎo)處理。分別在超聲功率60 W，超聲水浴溫度40 ℃的條件下處理5、10、15、20 min。超聲誘導(dǎo)處理完畢的種子同上述操作，研究超聲時間對種子發(fā)芽率的影響。

2. 2. 3 超聲水浴溫度

取適量經(jīng)預(yù)處理的遼藁本種子，以滅菌水為超聲傳輸介質(zhì)做超聲誘導(dǎo)處理。分別在超聲時間10 min，超聲功率為60 W的條件下使用不同超聲水浴溫度30、35、40、45、50 ℃對種子進行超聲誘導(dǎo)處理。超聲誘導(dǎo)處理完畢的種子同上述操作，研究水浴溫度對種子發(fā)芽率的影響。

2. 3 響應(yīng)面實驗

以上述單因素實驗為基礎(chǔ)，使用Box-Behnken響應(yīng)面法，以超聲功率、超聲溫度和超聲時間為影響因子，以發(fā)芽率含量為響應(yīng)值，挖掘遼藁本種子發(fā)芽最佳工藝（表1）。

2. 4 數(shù)據(jù)處理

本實驗每組設(shè)3次生物學重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。實驗數(shù)據(jù)采用R語言（R-4.1.1）進行統(tǒng)計分析，各組之間的結(jié)果比較采用LSD多重比較，以p＜0.05為顯著標準。Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計與分析采用Design Expert 13軟件實現(xiàn)。

3 結(jié)果與分析

3. 1 超聲處理對發(fā)芽影響的單因素實驗

3. 1. 1 超聲功率對遼藁本發(fā)芽率的影響

由圖1（a）可以看出，遼藁本種子在不同的超聲功率下發(fā)芽率均有顯著的差異（plt;0.05），隨著超聲功率的升高，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，并在60W時最大，為56.67%。當超聲波功率提升時，其產(chǎn)生的空化效應(yīng)隨之增強，對遼藁本種子表皮的細胞壁破壞及間隙清潔作用也更為明顯。但若功率設(shè)置過高，反而可能損傷種子的細胞結(jié)構(gòu)，進而影響其發(fā)芽率。

3. 1. 2 超聲時間對遼藁本發(fā)芽率的影響

由圖1（b）可以看出，遼藁本種子在不同的超聲時間下發(fā)芽率有顯著的差異（plt;0.05），隨著超聲時間的延長，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后下降至穩(wěn)定的趨勢，在5 min時達到最大，為57.78%。隨著超聲處理時長的增加，其對遼藁本種子外皮細胞壁的破壞效果以及對細胞壁間隙的清理作用更為突出。然而，過長的處理時間，由于持續(xù)的機械作用和能量影響，可能引起種子細胞的損害。

3. 1. 3 超聲水浴溫度對遼藁本發(fā)芽率的影響

由圖1（c）可以看出，遼藁本種子在不同的超聲水浴溫度下發(fā)芽率有顯著的差異（plt;0.05），隨著超聲水浴溫度的升高，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在35 ℃時達到最大，為54.44%。當超聲處理的溫度提升至約35 ℃時，遼藁本種子中的酶活性達到較高水平，有利于促進其生理生化反應(yīng)。然而，若溫度繼續(xù)攀升，酶活性及生理生化過程則可能受到抑制。當溫度升高至50 ℃時，種子遼藁本種子體內(nèi)酶活性失活，種子不發(fā)芽。

3. 2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的綜合結(jié)果，運用Design- Expert 13軟件，將超聲功率（A）、超聲時間（B）和水浴溫度（C）作為自變量，發(fā)芽率（R）作為響應(yīng)變量，構(gòu)建了一個3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計實驗（表2）。

從表3中得出的數(shù)據(jù)，獲得了基于發(fā)芽率的回歸模型及其系數(shù)的統(tǒng)計顯著性分析。分析結(jié)果揭示，本研究所選的二次多項式模型達到統(tǒng)計學上的顯著性標準（P＜0.05）。通過失擬項的P值（0.410 9＞0.05）評估，證實了模型與實際數(shù)據(jù)的貼合度高，且回歸方程結(jié)果具有合理性。這有效反映了實驗中各因素與響應(yīng)變量之間的實際聯(lián)系。進一步的分析顯示，因子A對種子發(fā)芽率的影響具有顯著性（P＜0.05），而因子B、C的影響則不顯著；此外，A2和B2同樣表現(xiàn)出顯著性。綜上所述，超聲功率被確認為影響發(fā)芽率的關(guān)鍵因素。

通過對實驗數(shù)據(jù)的擬合，建立了一個多元二次回歸方程：發(fā)芽率R=51.33+2.22A-0.832 5B-0.833 75C-" 2.222 5AB-2.225AC-2.222 5BC-3.998 5A2-5.666B2-" 2.888 5C2。由圖2（a）可知，隨著超聲功率和超聲時間的增加，種子發(fā)芽率先升高后降低，分別在功率68 W和5 min時達最大值。同理在圖2（b）和圖2（c）中可得遼藁本種子發(fā)芽率對應(yīng)響應(yīng)值增量狀態(tài)最佳時條件分別為：AC（68 W，34 ℃），BC（5 min，34 ℃），且A、C和B、C均為差異性不顯著（P＞0.05）。

3. 3 最佳工藝驗證

通過響應(yīng)面擬合，確定了促進遼藁本種子發(fā)芽的最佳條件：超聲處理時間為5 min，功率為68 W，水浴溫度設(shè)定在34 ℃，預(yù)計發(fā)芽率為51.89%。實際測試中，最終發(fā)芽率達到了54.07%，與模型預(yù)測值的相對偏差僅為2.183%，這表明模型預(yù)測與實際情況高度一致，證實了模型的可靠性。

4 討論與結(jié)論

超聲波技術(shù)是一種彈性機械波，因其簡單、方便、快捷、安全等優(yōu)點而得到了廣泛應(yīng)用，作用于物質(zhì)介質(zhì)中，用于與物質(zhì)的提取、實驗的檢測、儀器的清洗以及植物種子的萌發(fā)。本文研究了超聲波對遼藁本種子發(fā)芽率的影響，通過單因素實驗篩選出合適的超聲功率、超聲時間及超聲水浴溫度的范圍，再經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后最佳超聲條件為：超聲功率68 W、超聲時間5 min、超聲水浴溫度34 ℃，遼藁本種子在此處理條件下，發(fā)芽率達到54.07%，此數(shù)值與理論值相近，證實了二次多項式模型的有效性。

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