低劑量氚水基于Nrf2通路誘導(dǎo)肺癌細胞的輻射適應(yīng)性反應(yīng)

關(guān)鍵詞：氚水;電離輻射;適應(yīng)性反應(yīng);Nrf2通路

中圖分類號：Q691 文獻標(biāo)志碼：A

隨著核能事業(yè)的不斷發(fā)展，核反應(yīng)堆的建立日益增多，氚向環(huán)境中排放量不斷增加，對人類健康的影響越來越重要[1-2] 。氚是氫三種同位素（氕、氘、氚）之一，具有放射性，可以發(fā)生β 衰變釋放β 粒子。氚可以通過呼吸、消化道和皮膚進入人體，當(dāng)氚進入人體時其釋放的低能β 粒子所產(chǎn)生的損傷非常嚴(yán)重，其原因是氚屬于持續(xù)性的內(nèi)照射[3-4] 。有研究表明，氚釋放的低能電子具有較高的電離密度，在與胞內(nèi)分子相互作用過程中可以降低超氧化物歧化酶的活性，使胞內(nèi)自由基增多[5-8] ，攻擊胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等生物分子，產(chǎn)生更多DNA 鏈斷裂[7，9-10] 和染色體畸變[11-12] ，最終促使細胞凋亡[13-16] 。

早期研究中，Olivieri 等[17]用氚作為低劑量輻射源和1. 5Gy X 射線先后處理人淋巴細胞，提出輻射適應(yīng)性的概念。隨后，其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)不僅存在于如人外周血細胞等正常細胞[18]中也存在于如非小細胞肺癌A549和淋巴瘤EL-4等癌細胞[19-21] 中，

在輻射適應(yīng)性反應(yīng)的機制研究方面，Sanderson[22] 、Ikushima [23] 等學(xué)者發(fā)現(xiàn)氚誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶介導(dǎo)的DNA堿基切除修復(fù)途徑有關(guān)。隨著對輻射適應(yīng)性反應(yīng)機制研究的深入，他們使用了X 射線等其他輻射證實免疫途徑和抗氧化途徑也在輻射適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮作用[24] ，尤其是抗氧化途徑被證明在輻射適應(yīng)性反應(yīng)中起了關(guān)鍵作用[21] ，然而抗氧化途徑是否在氚水誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中起作用有待進一步探究。

抗氧化途徑以核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）途徑為主，是機體在遭受氧化損傷時維持氧化平衡的重要途徑[18] 。白藜蘆醇作為Nrf2激活劑可以通過激活PI3K/Akt 途徑和MAPK 途徑誘導(dǎo)Nrf2活化，可顯著減少氧化應(yīng)激后細胞內(nèi)的活性氧（ ROS） 水平，抑制細胞凋亡，促進細胞存活[25] 。ML385 作為被高通量篩選發(fā)現(xiàn)的Nrf2抑制劑，能夠直接與Nrf2 蛋白相互作用，阻止Nrf2與靶基因的DNA 序列結(jié)合，從而抑制下游靶基因表達[26] 。

因此，本文選用肺癌細胞A549 為研究對象，用氚水處理探究其是否誘導(dǎo)癌細胞的輻射適應(yīng)性反應(yīng)，同時進一步探究抗氧化途徑Nrf2 通路是否在氚水誘導(dǎo)輻射適應(yīng)性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，以期進一步了解氚水對生物體的影響。

1材料和方法

1. 1實驗材料與儀器

1. 1. 1細胞培養(yǎng)

實驗中使用的人非小細胞肺癌A549 細胞購自ATCC。按照10% 胎牛血清和1% 雙抗加入1640 培養(yǎng)基來配制完全培養(yǎng)基。使用配制好的完全培養(yǎng)基以合適的密度將細胞接種在25 cm² 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基總量5 mL，放入5%CO₂ 、37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天傳一次代。

1. 1. 2試劑與儀器

試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、磷酸緩沖鹽溶液（即PBS，Gibco 公司）、EDTA-胰蛋白酶（Gibco 公司）、青霉素-鏈霉素溶液（ 即雙抗，Gibco 公司）、胎牛血清（Lonsera 公司）、噻唑蘭（即MTT，麥克林公司）、二甲基亞砜（即DMSO，MP 公司）、ROS 檢測試劑盒（ 索萊寶公司）、白藜蘆醇（Sigma 公司）、ML385 （ MedChemExpress 公司）。氚水（3. 5×10⁹ Bq/ L）由中國科學(xué)院合肥物質(zhì)研究所核能安全技術(shù)研究所提供。

儀器：高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、恒溫水浴鍋、離心機、超凈工作臺、電動移液槍、細胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡。

X射線源由中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院提供，使用的是Elekta Infinity直線加速器，照射劑量為4～20 Gy，劑量率為560 cGy/ min。

1. 2. 2白藜蘆醇和ML385 處理

在細胞生長到彌合度70% ～80%時，用含不同濃度白藜蘆醇（0、1、5、10、20 和50 μM）培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細胞24 h 檢測細胞活力;用0、1、5、10、20和50 μM 白藜蘆醇預(yù)處理A549 細胞24 h，4 Gy X射線照射，48 h 后檢測細胞活力;用含不同濃度ML385（0、1、5 和10 μM）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h檢測細胞活力;0、1、5 和10μM ML385 預(yù)處理A549 細胞24 h，4 Gy X 射線照射，48 h 后檢測細胞活力;設(shè)置空白對照組、4 Gy X 射線照射組、白藜蘆醇預(yù)處理照射組、氚水預(yù)處理照射組和氚水+ML385 預(yù)處理照射組，其中后三組分別用1 μM 白藜蘆醇、1. 4 × 10⁴ Bq/ mL 氚水和1 μM ML385 +1. 4×10⁴ Bq/ mL 氚水預(yù)處理細胞24 h，除空白對照組外均照射4 Gy X 射線并檢測X 射線照射后48 h 時的細胞活力和2 h 后的ROS水平。

1. 2. 3細胞活力檢測

使用MTT 法對細胞活力進行檢測。從細胞培養(yǎng)箱取出細胞，吸去原來的培養(yǎng)基，加入配制好的MTT 工作液，每皿1 mL，另外再取一個新培養(yǎng)皿也加入1 mL MTT 工作液作為調(diào)零孔。將加了MTT 工作液的實驗組、對照組和調(diào)零孔一起放入細胞培養(yǎng)箱中孵育。4 h 后取出，棄去上清液，每孔加入DMSO 1 mL，靜置5 min，搖晃培養(yǎng)皿使細胞內(nèi)結(jié)晶紫充分溶解在DMSO 中。每皿吸取200μL 加入96 孔板，設(shè)置3 個復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀在492 nm 處測量吸光度（OD）。

1. 2. 4ROS檢測

使用DCFH-DA 熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧水平。在1. 2. 1 和1. 2. 2 節(jié)中所提分組0 或4 GyX 射線處理細胞后2 h 時給細胞裝載DCFH-DA 熒光探針，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS 清洗一次，每皿加入1 mL 稀釋后的探針，放入細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min 后，棄去培養(yǎng)皿中液體，用PBS 清洗三次，以充分去除未進入細胞的探針，防止檢測背景過高。清洗后每皿留有1 mL PBS，維持細胞形態(tài)。使用熒光倒置顯微鏡對細胞進行拍照，每組隨機選擇至少三個區(qū)域進行拍攝。最后使用Image J 對照片中細胞的熒光進行定量分析，檢測其平均熒光強度。

1. 3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗中的所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計繪圖軟件GraphPad Prism 9 進行統(tǒng)計分析和繪制圖像，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用獨立樣本t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，當(dāng)P lt;0. 05時，說明有統(tǒng)計學(xué)差異;當(dāng)Plt;0. 01 時，說明差異極顯著。

2結(jié)果

2. 1氚水誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)可以恢復(fù)X 射線照射后的A549細胞活力

為檢測低劑量氚水對肺癌細胞A549生長增殖的影響，用不同活度氚水處理A549 細胞。細胞活力結(jié)果如圖1所示。與未加氚水的對照組相比，各活度氚水組的細胞活力沒有顯著變化（P gt;0. 05）。結(jié)果表明，低劑量氚水未對細胞增殖產(chǎn)生影響。

為檢測不同劑量X 射線對A549 細胞活力的影響，使用不同劑量X 射線照射A549 細胞，細胞活力結(jié)果如圖2（a）所示，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加細胞活力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。以對照組（0 Gy）為基準(zhǔn)，4、8、12、16 和20 Gy X 射線劑量組細胞活力數(shù)值均表現(xiàn)出顯著下降（P lt;0. 01），表明4 ～ 20 Gy的X 射線照射均能抑制A549 細胞的細胞活力，可以顯著降低A549 細胞的增殖水平。因4 Gy X 射線即可以有效引起A549 細胞活力下降，選取4 GyX 射線用于后續(xù)的輻射適應(yīng)性反應(yīng)實驗。

為探究氚水是否能誘導(dǎo)肺癌細胞產(chǎn)生輻射適應(yīng)性反應(yīng)以及在多少活度的氚水處理后可以誘導(dǎo)輻射適應(yīng)性反應(yīng)，用不同活度氚水預(yù)處理A549 細胞 24 h 后，用4 Gy X 射線對細胞進行照射，檢測細胞活力，結(jié)果如圖2（b）所示。氚水和X 射線共同處理后的細胞活力隨著氚水活度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，即較低活度（7×10³ 和1. 4×10⁴ Bq/ mL） 氚水處理后可以恢復(fù)4 Gy 照射后A549 細胞的細胞活力，而較高活度（2. 8×10⁴ 和3. 5×10⁴ Bq/ mL）氚水處理后會使A549 的細胞活力進一步下降。綜上，7×10³和 1. 4×10⁴ Bq/ mL 的氚水可以誘導(dǎo)A549 細胞產(chǎn)生輻射適應(yīng)性反應(yīng)，其中1. 4×10⁴ Bq/ mL 恢復(fù)的細胞活力最顯著，選取該活度用于后續(xù)氚水適應(yīng)性反應(yīng)探究。

2. 2氚水誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)可降低照射后A549細胞內(nèi)的氧化水平

熒光顯微鏡下細胞熒光情況如圖3（a）所示。

可見空白對照組幾乎未見綠色熒光，低活度氚水處理組細胞有少量綠色熒光，X 射線組綠色熒光明顯，氚水+X 射線組可見綠色熒光但沒有X射線組的明顯。定量檢測熒光強度情況如圖3（b） 所示，氚水和X 射線分別處理后的細胞內(nèi)平均熒光強度有顯著上升（Plt;0. 05），氚水+X 射線組相較于未用氚水預(yù)處理的X 射線組，其平均熒光強度顯著下降（p=0. 000 4）。結(jié)果表明，低活度氚水和X 射線都可使胞內(nèi)ROS 顯著上升，而氚水預(yù)處理可以顯著降低X 射線照射后胞內(nèi)ROS 水平，說明氚水可以在氧化水平上誘導(dǎo)A549細胞產(chǎn)生輻射適應(yīng)性反應(yīng)，減少高劑量X 射線照射后細胞的氧化損傷。

2. 3明確白藜蘆醇和ML385的使用濃度

為探究氚水是否通過激活Nrf2通路誘導(dǎo)輻射適應(yīng)性反應(yīng)，本文使用了Nrf2激活劑白藜蘆醇和Nrf2 抑制劑ML385[26] 。

白藜蘆醇作為公認(rèn)的Nrf2 激活劑，前人研究中報道它在預(yù)處理細胞后可以通過激活Nrf2 通路來減少后續(xù)輻射對細胞的損傷[27] 。不同濃度白藜蘆醇處理細胞活力結(jié)果如圖4（a） 所示。與對照組（0 μM）相比，各濃度白藜蘆醇處理后的細胞活力沒有顯著差異（P gt;0. 05），表明各濃度白藜蘆醇并未對細胞活力產(chǎn)生影響。隨后用這六個藥物濃度處理A549細胞24 h 后，用4 Gy X 射線照射細胞，檢測A549 細胞活力，結(jié)果如圖4（b） 所示。發(fā)現(xiàn)4 Gy X 射線照射后，A549 細胞活力隨著預(yù)先加入的白藜蘆醇濃度的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。與未用白藜蘆醇預(yù)處理的對照組（ 0μM）相比，較低濃度（1 μM）白藜蘆醇預(yù)處理后細胞活力顯著上升（Plt;0. 01），較高濃度（5、10、20 和50 μM）白藜蘆醇預(yù)處理后細胞活力顯著下降（P lt;0. 01）。因1 μM 白藜蘆醇可以顯著恢復(fù)4 Gy X射線照射后的細胞活力，將選用該濃度進行后續(xù)實驗。

同樣檢測不同濃度ML385 處理A549 細胞后的細胞活力，結(jié)果如圖5（a） 所示。與對照組（0μM）相比，各濃度ML385 處理后的細胞活力沒有顯著差異（Pgt;0. 05），表明各濃度ML385 并未對細胞活力產(chǎn)生影響。隨后，使用這三個藥物濃度對A549 細胞進行預(yù)處理，24 h 后4 Gy X 射線照射，結(jié)果如圖5（b）所示。ML385 預(yù)處理下4 Gy X 射線照射后的A549 細胞活力隨著ML385 濃度的升高逐漸下降。與未用ML385 預(yù)處理的對照組（0μM）相比，1 μM 的ML385 就可以顯著抑制4 Gy照射后的A549 細胞活力，選取1 μM ML385 進行后續(xù)實驗。

2. 4氚水可以通過激活Nrf2 通路誘導(dǎo)A549 細胞的適應(yīng)性反應(yīng)

為探究氚水是否通過激活Nrf2 通路誘導(dǎo)肺癌細胞A549 產(chǎn)生輻射適應(yīng)性反應(yīng)，本文對各處理組處理后的A549 細胞的細胞活力以及氧化水平進行了檢測。細胞活力結(jié)果如圖 6 所示。氚水預(yù)處理和白藜蘆醇預(yù)處理后的細胞活力有相同的趨勢，與空白對照組的細胞活力相比，4 Gy X 射線照射使得A549 細胞活力顯著下降，白藜蘆醇和氚水的預(yù)處理都顯著恢復(fù)了4 Gy X 射線照射后的細胞活力，而氚水+ML385 預(yù)處理后的細胞活力相較于氚水預(yù)處理組顯著下降。結(jié)果表明，氚水可能與白藜蘆醇一樣通過預(yù)先激活Nrf2 通路保護了細胞免受后續(xù)大劑量X 射線引起的細胞活力降低，一旦被ML385 抑制了Nrf2 通路，其誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)便消失了。

熒光顯微鏡下的A549 細胞ROS 水平結(jié)果如圖7（a）所示。相對于空白對照組，4 Gy 空白組熒光明顯增強，氚水和白藜蘆醇預(yù)處理組的熒光相對4 Gy 空白組熒光強度減弱，而氚水+ML385 預(yù)處理組的熒光增強。定量檢測熒光強度結(jié)果如圖7（b）所示，氚水預(yù)處理和白藜蘆醇預(yù)處理都使得4 Gy X 射線照射后的平均熒光強度顯著下降（P lt;0. 01），氚水+ML385 預(yù)處理組相對氚水預(yù)處理組平均熒光強度顯著上升（P lt;0. 05）。結(jié)果表明，氚水和白藜蘆醇都可以顯著降低X 射線照射引起的胞內(nèi)ROS 水平升高，加入ML385 則氚水預(yù)處理不再能降低后續(xù)X 射線照射后的胞內(nèi)氧化水平，ROS 水平顯著升高，氚水誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)消失。

綜上，氚水能夠通過激活Nrf2 通路誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，降低高劑量輻射后的胞內(nèi)氧化水平，促進細胞存活。

3討論

本文以A549細胞為研究對象，選用不同活度氚水作為適應(yīng)劑量探究其對后續(xù)4 Gy X 射線的適應(yīng)性反應(yīng)，并探究了抗氧化途徑Nrf2 通路在其中的所起的作用。針對本實驗的結(jié)果討論如下：

（1）A549細胞存在適應(yīng)性反應(yīng)，不僅與射線類型相關(guān)，而且與照射方式相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)低劑量氚水預(yù)處理肺癌細胞A549 可以顯著改變高劑量X 射線造成的細胞活力下降和胞內(nèi)氧化水平升高，證明了低劑量輻射能夠誘導(dǎo)肺癌細胞的輻射適應(yīng)性反應(yīng)。對α 粒子而言，CHEN 等[21] 發(fā)現(xiàn)50 mGy α 粒子可誘導(dǎo)A549 細胞對后續(xù)的750mGy α 粒子輻照產(chǎn)生放射抗性，具有適應(yīng)性反應(yīng)。對于X 射線， WANG 等[19] 發(fā)現(xiàn)50 mGy 或200mGy X 射線預(yù)處理A549 細胞后，可以誘導(dǎo)其對后續(xù)20 Gy X射線產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。由此可見，適應(yīng)性反應(yīng)與射線類型密切相關(guān)。

對于適應(yīng)劑量照射方式而言，氚水的照射屬于持續(xù)性照射，而X 射線的照射屬于急性照射。從YANG 等[28] 研究結(jié)果來看，所采用的75 mGy X射線預(yù)處理的A549 細胞，在后續(xù)24 h 的5Gy X射線處理中未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，作者認(rèn)為其原因可能與適應(yīng)劑量和后續(xù)高劑量間的時間間隔有關(guān)。針對時間間隔問題，余小玲等[29] 研究者開展了間隔時間分別為3 h、6h、12 h、24 h 和48 h 的輻射適應(yīng)性反應(yīng)實驗，發(fā)現(xiàn)不超過24 h 時，A549細胞有適應(yīng)性反應(yīng);但時間間隔延長至48 h 時，適應(yīng)性反應(yīng)消失。本文使用的氚水屬于持續(xù)性內(nèi)照射β 射線，具有其特殊性，不存在時間間隔的問題[30] 。由此可見，適應(yīng)性反應(yīng)與照射方式也密切相關(guān)。

（ 2）氚在細胞中誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)可能存在閾值，且閾值大小與細胞類型相關(guān)。本文中選用活度為7×10³ Bq/ mL 和1. 4×10⁴ Bq/ mL 的氚水預(yù)處理后可誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng);而氚水活度為2. 1×10⁴ 、2. 8×10⁴和 3. 5×10⁴ Bq/ mL 時，適應(yīng)性反應(yīng)消失，表明氚誘導(dǎo)輻射適應(yīng)性的活度可能存在閾值。從Ikushima 等[23，30] 的研究成果來看，活度為3. 7 ×10² ～1. 85×10³ Bq/ mL 的含氚胸腺嘧啶預(yù)處理下，倉鼠細胞V79 可以觀察到適應(yīng)性反應(yīng);而在過低活度（37 Bq/ mL 和3. 7 Bq/ mL）或過高活度（3. 7×10³ Bq/ mL 和7. 4×10³ Bq/ mL）預(yù)處理下，則沒有適應(yīng)性反應(yīng)，因此研究者提出氚的輻射適應(yīng)性反應(yīng)存在最佳閾值的觀點。雖然研究者高活度的值與本論文的高活度值大小不一樣，猜測這與細胞類型相關(guān)，但高活度存在有閾值現(xiàn)象是一致的。

（3）氚水通過激活Nrf2 通路誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)。本研究進一步探究了氚水誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的潛在機制，使用白藜蘆醇預(yù)處理A549 細胞，發(fā)現(xiàn)可以恢復(fù)后續(xù)高劑量照射引起的活力下降和減少氧化損傷，而當(dāng)使用ML385 抑制細胞Nrf2 通路時，氚水誘導(dǎo)的輻射抗性消失，表明Nrf2 通路在氚水誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的過程中起了關(guān)鍵作用，這與CHEN 等[21] 發(fā)現(xiàn)的適應(yīng)劑量可通過Nrf2 通路誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的研究結(jié)果一致。根據(jù)前人研究，可能原因為：氚水通過自由擴散穿過細胞膜進入細胞，或參與細胞內(nèi)物質(zhì)合成，或參與細胞代謝，在細胞內(nèi)釋放β 粒子[3] 。低活度的氚水預(yù)處理并未對細胞狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響（如圖1 所示），但可以使胞內(nèi)分子隨機電離產(chǎn)生ROS，同時還會刺激線粒體呼吸鏈以及產(chǎn)生氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)[33] ，使得胞內(nèi)ROS 水平激增（如圖3 所示），促使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/ 2（ ERK1/ 2） 磷酸化，最終激活Nrf2 通路[34] 。此外，作者推測細胞自噬也在激活Nrf2 通路中發(fā)揮重要作用，CHEN 等[21] 發(fā)現(xiàn)低劑量電離輻射引起的ROS 升高可以通過促進A549細胞自噬激活Nrf2 通路，使其表達上調(diào)。所以本文推測氚水預(yù)處理通過激活Nrf2 通路，使細胞在面對后續(xù)高劑量X 射線照射時，可以更快清除胞內(nèi)自由基，降低ROS 水平（ 如圖7 所示），減少DNA 損傷，促進細胞存活（如圖6 所示），增強了細胞對后續(xù)高劑量照射的抗性。因此，給我們的啟示，對于受到內(nèi)照射的患者而言，由于存在著輻射適應(yīng)性反應(yīng)，可能不適用于放射性治療。

綜上，對于持續(xù)性氚水的照射方式，本文證明了氚水誘導(dǎo)肺癌細胞A549 的輻射適應(yīng)性反應(yīng)存在活度閾值，并且通過激活抗氧化途徑Nrf2 通路，可降低后續(xù)高劑量照射的輻射損傷，這為氚水的生物效應(yīng)研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。