2種喹諾酮類抗生素對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)的初步研究

摘要：目的 通過(guò)了解喹諾酮類抗生素對(duì)浮游動(dòng)物存活率及繁殖能力的影響，以期為全面評(píng)價(jià)這類污染物所帶來(lái)的生態(tài)后果提供數(shù)據(jù)支撐。 "方法 本文通過(guò)急性和慢性毒性試驗(yàn)探究了恩諾沙星和環(huán)丙沙星對(duì)大型溞（Daphnia magna）的急性毒性效應(yīng)和生活史特征的影響。結(jié)果 恩諾沙星和環(huán)丙沙星對(duì)大型溞的96 h LC50值分別為 0.34 和75.79 mg/L；安全濃度分別為0.003和0.758 mg/L。隨著恩諾沙星、環(huán)丙沙星濃度的升高，大型溞的世代平均時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)溞總數(shù)、產(chǎn)溞次數(shù)、凈生殖率和內(nèi)稟生殖率均呈下降趨勢(shì)。最高濃度組的恩諾沙星（9.645 mg/L）、環(huán)丙沙星（19.84 mg/L）處理組中大型溞的世代平均時(shí)間分別為11.34和10.35 d，極顯著地長(zhǎng)于空白對(duì)照組的世代平均時(shí)間9.46 d（P＜0.01）；產(chǎn)溞總數(shù)分別為46和91只，僅有對(duì)照組的10%和19%；產(chǎn)溞次數(shù)由空白對(duì)照組的11次分別減少至3次和7次；凈生殖率與對(duì)照組相比分別下降了89%和81%，種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率下降了76%和57%。低濃度的恩諾沙星、環(huán)丙沙星也會(huì)抑制大型溞種群的繁殖能力。結(jié)論 對(duì)大型溞來(lái)說(shuō)，即使是在安全濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)期暴露也會(huì)顯著抑制大型溞的生存和繁殖能力，并且這種抑制作用隨著抗生素濃度與暴露時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星；環(huán)丙沙星；大型溞；急性毒性；慢性毒性

中圖分類號(hào)： R978.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preliminary study on the toxic effects of enrofloxacin and ciprofloxacin on Daphnia magna

Xia Yu1， Dai Shao1， and Xie Qinming1，2

（1 Fisheries College， Jimei University， Xiamen 361021;

2 Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xiamen 361021）

Abstract Objective The purpose of this study is to understand the effects of quinolone antibiotics on the survival rate and reproductive ability of zooplankton in order to provide data support for the comprehensive evaluation of the ecological consequences of these pollutants. Methods The acute toxic effects and life history characteristics of enrofloxacin and ciprofloxacin on Daphnia magna were studied by acute and chronic toxicity tests. Results The LC50 96 h values of enrofloxacin and ciprofloxacin to D. magna were 0.34 and 75.79 mg/L， respectively; the safe concentrations of enrofloxacin and ciprofloxacin to D. magna were 0.003 and 0.758 mg/L， respectively. With the increase in concentration of enrofloxacin and ciprofloxacin， the average generation time of D. magna prolonged， and the total number of offspring， spawning times of D. magna， net reproductive rate， and innate rate of increase decreased. The average generation time of D. magna in the highest concentration group of enrofloxacin and ciprofloxacin （9.645 "and 19.84 mg/L） was 11.34 and 10.35 d respectively， which was very significantly longer than that in the blank control group （9.67 d）. The total number of offspring was 46 and 91， respectively， which was only 10% and 19% of that of the control group; Spawning times of D. magna decreased from 11 times in the blank control group to 3 and 7 times， respectively. Compared with the control group， the net reproductive rate decreased by 89% and 81%， respectively， and the innate rate of increase decreased by 76% and 57%， respectively. The low concentrations of enrofloxacin and ciprofloxacin can also inhibit the population reproduction of D. magna. Conclusion For Daphnia Magna， even in the safe concentration range， long-term exposure significantly inhibited the survival and reproduction of Daphnia Magna， and the inhibitory effect increased with the increase of antibiotic concentration and exposure time.

Key words Enrofloxacin; Ciprofloxacin; Daphnia Magna; Acute toxicity; Chronic toxicity

喹諾酮類抗生素因其具有抗菌譜廣、抑菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性、毒副作用較小等特點(diǎn)[1]，已被廣泛應(yīng)用于人類或畜禽等的疾病防治。喹諾酮類藥物最早應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌病的防治可以追溯到20世紀(jì)70年代。最初，這類藥物開始在我國(guó)南方養(yǎng)鰻業(yè)中使用，隨著其價(jià)格的下降，目前已廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物的疾病治療。然而，在使用這類藥物治療水生動(dòng)物的細(xì)菌性疾病時(shí)，多借鑒于對(duì)哺乳動(dòng)物的研究成果，這就導(dǎo)致了其在水產(chǎn)動(dòng)物中的盲目使用[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)喹諾酮類抗生素年產(chǎn)量約700噸，其中一半以上用于養(yǎng)殖業(yè)[3]。這些廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的抗生素，可在畜、魚和蝦等動(dòng)物體內(nèi)蓄積，并可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，一旦這些殘留的抗生素和耐藥性細(xì)菌進(jìn)入人體，就會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生影響[4]。另一方面，由于抗生素在生物體內(nèi)的代謝率為20%～30%，人類和動(dòng)物服用的大多數(shù)抗生素并不能被機(jī)體充分代謝，約有20.0%～97.0%以活性物質(zhì)的形式排出體外而進(jìn)入環(huán)境[5]，對(duì)環(huán)境中的非靶生物及生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。目前，已在各類水體中檢測(cè)到超過(guò)50種抗生素[6]，其中最常見的抗生素是氟喹諾酮類藥物，其在醫(yī)院廢水中的濃度最高（超過(guò)100 μg/L），其次是磺胺類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類[7]。而恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星在水體中的污染物檢出率較高，是水產(chǎn)品中最常見且最容易檢測(cè)的兩種抗生素[8]，而且恩諾沙星在部分水產(chǎn)品中的殘留量已經(jīng)超過(guò)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）規(guī)定的50 μg/kg，檢出率為46.9%，最大殘留量為67 μg/kg[9-12]。這2種抗生素長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，卻缺乏必要的用藥管理和科學(xué)使用的指導(dǎo)，導(dǎo)致其濫用現(xiàn)象普遍存在，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，由此帶來(lái)的水產(chǎn)品質(zhì)量和生態(tài)安全問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。

目前，對(duì)喹諾酮類抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究主要集中在其對(duì)病原菌的藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)方面[13-15]，尚缺乏系統(tǒng)而深入的藥理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)研究，因此其對(duì)水生生物的生態(tài)效應(yīng)、對(duì)水域生態(tài)環(huán)境潛在影響的認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)仍不夠清晰明確[16]。因此，各種藥物施用后對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中非靶生物及生態(tài)環(huán)境的影響越來(lái)越受到關(guān)注[17]。大型溞是浮游動(dòng)物中枝角類的代表物種，是連接水生食物鏈的重要中間體，對(duì)凈化水體有重要作用，其初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[18-19]。并且由于大型溞具有普遍性、敏感性和生命周期短等特點(diǎn)[20]，使其成為了國(guó)內(nèi)外水生生物毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物，廣泛用于水生生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估測(cè)試[21]。研究水環(huán)境中殘留污染物對(duì)大型蚤的毒性效應(yīng)可對(duì)其毒性可能引起的食物鏈高端生物的潛在危害起到監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)作用[22]。

當(dāng)前對(duì)于抗生素污染引起浮游生物的生態(tài)響應(yīng)效應(yīng)研究，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用短時(shí)間高濃度暴露的方法，探討其對(duì)某一物種的急性毒理效應(yīng)，而本研究則以2種仍在大量使用的喹諾酮類抗生素（恩諾沙星和環(huán)丙沙星）為毒性物質(zhì)，在測(cè)定它們對(duì)大型溞急性毒性作用計(jì)算出其對(duì)大型溞的安全濃度，然后以這兩種喹諾酮的安全濃度為基數(shù)，通過(guò)慢性毒性試驗(yàn)，探究了在安全濃度的抗生素中長(zhǎng)期暴露，對(duì)大型溞主要生活史特征的影響，為喹諾酮抗生素類藥物在水體中對(duì)非靶生物的影響及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)生物：試驗(yàn)所用普通小球藻（Chlorella pyrenoidosa， FACHB-5）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室多代馴化培養(yǎng)。試驗(yàn)所用大型溞（Daphia magna）采于廈門市集美區(qū)敬賢湖，并于實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)三代以上的單克隆品系。

供試藥品：恩諾沙星注射液，純度5％（上海同仁藥業(yè)股份有限公司上海獸藥廠）；鹽酸環(huán)丙沙星注射液，純度5％（江西省和光藥業(yè)有限公司）；BG11液體培養(yǎng)基[23]。

1.2 試驗(yàn)方法

稀釋水的配制：取二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）

11.76g，七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）4.93 g，碳酸氫鈉（NaHCO3）2.59 g，氯化鉀（KCl）0.25 g，分別用超純水定容至1 L。各取以上4種溶液各25 mL混合后，稀釋定容至1 L。新配置的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水pH為（7.8±0.2），硬度（250±25） mg/L。

大型溞的培養(yǎng)：將大型溞放置在上述稀釋水中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（21±1）℃，溶解氧為6 mg/L，光、暗周期16 h/8 h。每周換水3次，每次換水2/3，每天定時(shí)喂食普通小球藻 [24]。

急性毒性試驗(yàn)：正式實(shí)驗(yàn)之前，為確定實(shí)驗(yàn)濃度范圍， 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。先將大型溞暴露于范圍較廣的恩諾沙星、環(huán)丙沙星濃度系列中24 h，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)找出0～100%大型溞死亡的濃度范圍，然后在此范圍內(nèi)設(shè)計(jì)出正式試驗(yàn)中各組的濃度。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置抗生素的7個(gè)正式試驗(yàn)濃度如下表1。試驗(yàn)在90 mm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每個(gè)濃度組中分別放入出生6～48 h，大小一致且健康活力強(qiáng)的為同一母溞后代的幼溞5只，每組4個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果按照總幼溞數(shù)20只進(jìn)行計(jì)算。按上述方法培養(yǎng)，暴露期間不換水、不喂食。實(shí)驗(yàn)開始后，于24、48、72和96 h定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄每個(gè)容器中仍能活動(dòng)的大型溞數(shù)，并計(jì)算半致死濃度（LC50）。

慢性毒性試驗(yàn)：參考OECD（1984）[25]的慢性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)急性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置大型溞慢性毒性試驗(yàn)的抗生素濃度范圍。恩諾沙星和環(huán)丙沙星各設(shè)置5個(gè)濃度的處理組，分別為其LC50值（48 h）的0.1%、0.5%、1%、5%和10%，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組，進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)皿中試驗(yàn)液為20 mL，加6～24 h幼溞1個(gè)，每個(gè)濃度15個(gè)平行。試驗(yàn)溫度（20±1） ℃，光照1500 Lx，光、暗培養(yǎng)時(shí)間比16h/8h， 試驗(yàn)共歷時(shí)15 d。試驗(yàn)溶液每24 h更換1次，每天喂食藻密度約為1×105 個(gè)/mL的小球藻液。每天觀察1次，記錄每組大型溞的存活率、產(chǎn)溞總數(shù)、產(chǎn)溞次數(shù)等數(shù)據(jù)，以便計(jì)算大型溞的主要生活史參數(shù)。在記錄完后，將新生幼溞吸出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

（1）大型溞存活率

（1）

A代表大型溞存活率，N代表大型溞總個(gè)數(shù)，N0代表死亡的大型溞個(gè)數(shù)。

（2）濃度效應(yīng)曲線：本試驗(yàn)采用概率單位法計(jì)算半致死濃度（LC50），數(shù)據(jù)在GraphPad Prism 9軟件中進(jìn)行處理，將濃度轉(zhuǎn)換為濃度對(duì)數(shù)值，作為橫坐標(biāo)；大型溞的存活率作為縱坐標(biāo)，運(yùn)用非線性函數(shù)“l(fā)og（inhibitor） vs. normalized response -- variable slope”進(jìn)行擬合，得到濃度效應(yīng)曲線和方程以及LC50。

函數(shù)公式為

（2）

式中，X為濃度對(duì)數(shù)值，LogLC50為半抑制濃度對(duì)數(shù)值，HillSlope為曲線的陡度。

（3）安全濃度[26]

SC=LC50（96h）×0.01（3）

（4）大型溞主要生活史參數(shù)[27]

特定年齡存活率（lx，%）：x試驗(yàn)時(shí)間時(shí)大型溞的存活率A（%）。

特定年齡繁殖率（mx）：

（4）

凈生殖率（R0，ind.）：

（5）

世代平均時(shí)間（T，h）：

（6）

式中， x為試驗(yàn)時(shí)間（h）。

種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率（rm，ind./h）：

（7）

生命期望（e0，h）：個(gè)體出生后存活時(shí)長(zhǎng)的估計(jì)值，計(jì)算公式為：

（8）

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在SPSS 22軟件中進(jìn)行處理，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析法（one-way ANOVA）分析抗生素濃度對(duì)各大型溞主要生活史參數(shù)的影響， 對(duì)樣本平均數(shù)間的差異顯著性進(jìn)行LSD多重比較，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 兩種抗生素對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn)

（1）兩種抗生素暴露對(duì)大型溞存活率的影響。圖1顯示了大型溞96 h內(nèi)暴露在不同濃度恩諾沙星下的存活率變化情況。

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)6個(gè)處理組的大型溞的存活率均有所下降。最低濃度組（1.956 mg/L）在前72 h時(shí)存活率下降緩慢，能保持在86.7%，但在96 h時(shí)驟降到20%。19.56 mg/L組的大型溞存活率在48 h后就開始快速下降，當(dāng)濃度超過(guò)19.56 mg/L時(shí)大型溞在24 h后就開始快速死亡并在72 h時(shí)全部死亡。這說(shuō)明隨著恩諾沙星的濃度升高不僅降低了大型溞的存活率，也會(huì)縮短大型溞的存活時(shí)間。

圖2顯示了96 h內(nèi)暴露在不同濃度環(huán)丙沙星下的存活率變化情況。

從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)6個(gè)處理組的大型溞的存活率均有所下降。但與恩諾沙星不同，在濃度不超過(guò)136.58 mg/L時(shí)，大型溞存活率在96 h內(nèi)下降較為緩慢，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活率仍保持在50%以上。而當(dāng)環(huán)丙沙星濃度超過(guò)136.58 mg/L時(shí)，大型溞在24 h時(shí)就大量死亡，存活率大幅下降至50%以下。但除最高濃度組（546.3 mg/L）外，其余5個(gè)處理組在96 h內(nèi)都未全部死亡。這說(shuō)明環(huán)丙沙星雖然也會(huì)降低大型溞的存活率，但與恩諾沙星相比，但在96 h內(nèi)其對(duì)大型溞的毒性作用得更為緩慢。大型溞的存活率隨著抗生素濃度與暴露時(shí)間的增加而降低，表明濃度越高、暴露時(shí)間越長(zhǎng)，2種抗生素對(duì)大型溞的毒性越強(qiáng)，說(shuō)明抗生素濃度與暴露時(shí)間對(duì)于污染物對(duì)大型溞的毒性具有關(guān)鍵性作用。

（2）兩種抗生素對(duì)大型溞的LC50值。兩種抗生素濃度與大型溞存活率以非線性函數(shù)“l(fā)og（inhibitor） vs. normalized response-variable slope”擬合所得的回歸方程、擬合系數(shù)（R2）見表2。

如表2所示回歸方程的擬合系數(shù)（R2）均在0.9以上，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與該模型的擬合程度較好。兩種抗生素對(duì)大型溞的LC50值與安全濃度的計(jì)算結(jié)果見表3。

如表2所示，環(huán)丙沙星、恩諾沙星對(duì)大型溞的LC50值均隨著暴露時(shí)間的增加而下降。在24 h時(shí)其對(duì)大型溞的LC50值分別為353.40和199.20 mg/L；在96 h時(shí)其LC50值為0.34 和75.79 mg/L，與24 h時(shí)相比分別下降了99.90%和61.95%，說(shuō)明二者對(duì)大型溞的毒性隨暴露時(shí)間的增加而增強(qiáng)。這也更為直觀地印證了上文中所述，隨時(shí)間的增長(zhǎng)，雖然2種抗生素對(duì)大型溞的毒性都有所升高，但恩諾沙星的毒性增長(zhǎng)更為劇烈這一觀點(diǎn)。同時(shí)說(shuō)明，2種抗生素對(duì)大型溞的毒性隨時(shí)間的變化程度不同。環(huán)丙沙星、恩諾沙星對(duì)大型溞的48 h LC50值分別為198.40 和96.45 mg/L，其對(duì)大型溞的安全濃度分別為0.758和0.003 mg/L。

《溞類急性活動(dòng)抑制毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》[28]依據(jù)48 h

LC50的大小，將化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分為極高毒（≤1.0 mg/L）、高毒（1.0～10.0 mg/L）、中毒（10.0～

100.0 mg/L）和低毒（≥100.0 mg/L）等4級(jí)。按照上述毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)大型溞應(yīng)分別屬于低毒物質(zhì)和中毒物質(zhì)。由此可知，2種抗生素對(duì)大型溞的毒性大小不同，恩諾沙星的急性毒性強(qiáng)于環(huán)丙沙星。

2.2 抗生素對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)

（1）抗生素慢性毒性對(duì)大型溞生命期望的影響。從圖3可見：大型溞的生命期望隨恩諾沙星濃度的升高而降低。各處理組的大型溞生存期望都極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），且各處理組間的差異也極顯著（P＜0.01）?？瞻讓?duì)照組的生命期望最大為（17.86±0.2） d，最低濃度組（0.0965 mg/L）的生命期望為（16.10±0.17） d，此后濃度每增大一倍，大型溞的生命期望就下降1 d左右。最高濃度組（9.6450 mg/L）的生命期望僅有（11.08±0.2） d，與空白對(duì)照組相比下降了6.78 d。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間暴露在低濃度的恩諾沙星中會(huì)顯著地影響大型溞的生命期望，縮短大型溞的存活時(shí)間。

從圖4可見：大型溞的生命期望隨環(huán)丙沙星濃度的升高而降低。各處理組的大型溞生存期望都極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），且各處理組間的差異也極顯著（P＜0.05）。空白對(duì)照組的生命期望最大為（17.86±0.2） d，最低濃度組（0.1980 mg/L）的生命期望為（16.10±0.17） d，此后濃度每增大一倍，大型溞的生命期望就下降1 d左右。最高濃度組（19.8400 mg/L）的生命期望僅有（11.08±0.2） d，與空白對(duì)照組相比下降了6.78 d。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間暴露在低濃度的環(huán)丙沙星中會(huì)顯著地影響大型溞的生命期望，縮短大型溞的存活時(shí)間。

（2） 抗生素慢性毒性對(duì)大型溞主要生殖參數(shù)的影響。

暴露在不同恩諾沙星濃度下對(duì)大型溞主要生殖參數(shù)影響的結(jié)果見表4。

表4所示隨著恩諾沙星濃度的升高，在試驗(yàn)時(shí)間的15 d內(nèi)，大型溞的產(chǎn)溞總數(shù)與產(chǎn)溞次數(shù)均呈下降趨勢(shì)。空白對(duì)照組的產(chǎn)溞總數(shù)為470只，最高濃度組（9.645 mg/L）的產(chǎn)溞總數(shù)共46只，僅有空白對(duì)照組的10%。產(chǎn)溞次數(shù)由空白對(duì)照組的11次減少至3次。大型溞的凈生殖率、種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，最高濃度組（9.645 mg/L）與對(duì)照組相比凈生殖率下降了89%，種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率下降了76%，極顯著地低于空白對(duì)照組（P＜0.001），其余各處理組也均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。大型溞的世代平均時(shí)間隨恩諾沙星濃度的升高呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，空白對(duì)照組大型溞的世代時(shí)間最短為（9.670±0.215） d，最高濃度組的世代平均時(shí)間最長(zhǎng)為（11.341±0.009） d極顯著（P＜0.01）的長(zhǎng)于對(duì)照組，其余各處理組也均顯著（P＜0.05）長(zhǎng)于對(duì)照組。

（3） 暴露在不同濃度環(huán)丙沙星下大型溞主要生殖參數(shù)的變化

暴露在不同環(huán)丙沙星濃度下對(duì)大型溞主要生殖參數(shù)影響的結(jié)果見表5。所示隨著環(huán)丙沙星濃度的升高，在試驗(yàn)時(shí)間的15 d內(nèi)，大型溞的產(chǎn)溞總數(shù)與產(chǎn)溞次數(shù)整體呈下降趨勢(shì)?？瞻讓?duì)照組的產(chǎn)溞總數(shù)為470只，最高濃度組（9.645 mg/L）的產(chǎn)溞總數(shù)共91只，僅有空白對(duì)照組的19%。產(chǎn)溞次數(shù)由空白對(duì)照組的11次減少至7次。大型溞的凈生殖率、種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，最高濃度組（19.84 mg/L）與對(duì)照組相比凈生殖率下降了81%，種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率下降了57%，極顯著地低于空白對(duì)照組（P＜0.001），其余各處理組也均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。大型溞的世代平均時(shí)間隨恩諾沙星濃度的升高呈顯著（P＜0.05）增長(zhǎng)的趨勢(shì)，空白對(duì)照組的世代時(shí)間最短為（9.670±0.215） d，最高濃度組的世代平均時(shí)間最長(zhǎng)為（10.351±0.020） d，極顯著（P＜0.01）的長(zhǎng)于對(duì)照組，其余各處理組也均顯著（P＜0.05）長(zhǎng)于對(duì)照組。

（4） 大型溞主要生命參數(shù)與抗生素濃度的回歸方程

不同濃度恩諾沙星、環(huán)丙沙星組大型溞的主要生命參數(shù)的回歸方程見表6。

表6的回歸分析顯示，在本試驗(yàn)中設(shè)置的抗生素范圍內(nèi)，兩種抗生素組大型溞的生命期望、凈生殖率、世代時(shí)間、種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率均與抗生素濃度呈顯著相關(guān)。

3 討論

3.1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星等抗生素的毒性強(qiáng)度差異

不同種類抗生素對(duì)大型溞的毒性強(qiáng)度不同，楊燦以4種典型抗生素，氯霉素、磺胺甲惡挫、四環(huán)素和恩諾沙星為研究對(duì)象探究了其急性和慢性毒性效應(yīng)，其對(duì)大型溞的LC5048h分別為129.560、175.780、91.155和78.380 mg/L，對(duì)于大型溞分別屬于低毒、低毒、低毒和中毒物質(zhì)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大型溞的存活率隨著抗生素濃度與暴露時(shí)間的增加而降低，濃度越高、暴露時(shí)間越長(zhǎng)，兩種抗生素對(duì)大型溞的毒性越強(qiáng)，并且恩諾沙星的毒性增長(zhǎng)比環(huán)丙沙星更為劇烈。當(dāng)恩諾沙星濃度為1.956 mg/L時(shí)，大型溞在96 h時(shí)的存活率僅有20%；當(dāng)濃度超過(guò)19.56 mg/L時(shí)，大型溞在24 h后就開始快速死亡并在72 h時(shí)全部死亡。環(huán)丙沙星濃度超過(guò)136.58 mg/L時(shí)，大型溞在24 h時(shí)就大量死亡，存活率大幅下降至50%以下。而在本研究結(jié)果得出的環(huán)丙沙星、恩諾沙星對(duì)大型溞的LC5048h值分別為198.4和96.45mg/L，根據(jù)《溞類急性活動(dòng)抑制毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》分別屬于低毒和中毒物質(zhì)?？梢姡髦Z沙星對(duì)大型溞的急性毒性強(qiáng)于環(huán)丙沙星。

同時(shí)，由于各物種之間的生理機(jī)能的不同，同種物質(zhì)的毒性對(duì)不同物種來(lái)說(shuō)毒性也具有較大差異，有時(shí)即使是相同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的不同物種間，對(duì)同種物質(zhì)的敏感性也存在明顯差異。有研究報(bào)道，恩諾沙星、環(huán)丙沙星對(duì)藻類的EC50值分別為3.10和2.97 mg/L；對(duì)植物的EC50值分別為0.32和3.75 mg/L；對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的EC50值分別為53.30和12.00 mg/L；對(duì)魚類的EC50值分別為79.5和60 mg/L[30]。

3.2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星等抗生素對(duì)枝角類的致毒機(jī)理

有研究表明，暴露在高濃度的抗生素下，浮游動(dòng)物體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng)都將受到破壞[31]。由于各物質(zhì)對(duì)生物的制毒機(jī)理的不同，不同物質(zhì)對(duì)同一物種的毒性具有較大差異。Kim等[32]研究了3種抗生素對(duì)月牙藻的毒性作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)月牙藻對(duì)抗生素的敏感程度顯著強(qiáng)于大型蚤和費(fèi)氏弧菌。Andreozzi等[33]研究發(fā)現(xiàn)不同種藻類對(duì)同種抗生素的敏感度有差異，潔霉素對(duì)賀氏偽枝藻不起作用，但明顯影響藍(lán)藻類的生長(zhǎng)狀況。此外，大型溞的心跳頻率、運(yùn)動(dòng)能力、攝食效率等指標(biāo)，均隨著諾氟沙星暴露濃度的升高而下降[34-35]。這意味著，在高濃度抗生素的作用下，大型溞的各項(xiàng)生理機(jī)能都會(huì)損傷，嚴(yán)重影響大型溞個(gè)體的存活率。即使是在恩諾沙星和環(huán)丙沙星的安全濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)期暴露也會(huì)降低大型溞的生命期望，縮短大型溞的存活時(shí)間，恩諾沙星、環(huán)丙沙星最高濃度組大型溞的生命期望比對(duì)照組分別減少了6.78和6.45 d。

3.3 恩諾沙星和環(huán)丙沙星等抗生素對(duì)枝角類種群繁殖的影響

在自然界實(shí)際濃度下，抗生素等環(huán)境污染物很少能直接對(duì)浮游動(dòng)物產(chǎn)生致死效應(yīng)[36]，因此通過(guò)低濃度長(zhǎng)時(shí)間的慢性毒性試驗(yàn)，得到的各項(xiàng)生活史參數(shù)能夠預(yù)測(cè)個(gè)體受損后，對(duì)整個(gè)種群的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，抗生素會(huì)抑制浮游動(dòng)物的攝食效率與消化酶活性，擾亂浮游動(dòng)物的腸道微生物群，從而危害浮游動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖，甚至可以縮短其壽命[37-40]。

Ji等[41]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于磺胺噻唑等3種抗生素中，均會(huì)延遲大型溞首胎繁殖時(shí)間、減少子代繁殖數(shù)量。在本試驗(yàn)中，隨著恩諾沙星、環(huán)丙沙星濃度的升高，大型溞的世代平均時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)溞總數(shù)、產(chǎn)溞次數(shù)、凈生殖率、內(nèi)稟生殖率均呈下降趨勢(shì)。恩諾沙星、環(huán)丙沙星最高濃度組大型溞的世代平均時(shí)間分別為（11.341±0.009）和（10.351±0.020） d，極顯著（P＜0.01）的長(zhǎng)于對(duì)照組，其余各處理組也均顯著（P＜0.05）長(zhǎng)于對(duì)照組；產(chǎn)溞總數(shù)分別為46和91只，僅有對(duì)照組的10%和19%；產(chǎn)溞次數(shù)由空白對(duì)照組的11次減少至3次和7次；凈生殖率與對(duì)照組相比分別下降了89%和81%；種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率分別下降了76%和57%?？梢钥闯觯词乖诙髦Z沙星、環(huán)丙沙星的安全濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間的暴露仍會(huì)顯著影響大型溞的生命期望，縮短大型溞的存活時(shí)間，本試驗(yàn)結(jié)果也與其他研究者出一致的結(jié)論[42]，即抗生素的過(guò)度濫用是對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害。并且在受到抗生素脅迫時(shí)，產(chǎn)溞總量、產(chǎn)溞次數(shù)、凈生殖率、內(nèi)稟生殖率，與空白對(duì)照組相比顯著下降，而世代平均時(shí)間顯著延長(zhǎng)，這反映出大型溞的繁殖能力受到明顯的抑制。

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