不同耐低溫乳酸菌添加劑對(duì)天然牧草青貯品質(zhì)的影響

摘要：為了探究前期篩選出耐低溫乳酸菌對(duì)天然牧草青貯發(fā)酵的影響，本試驗(yàn)以天然牧草為原料，設(shè)置無添加劑、CH（商用菌株）、耐低溫菌株Z906、L12、復(fù)合菌株ZL共5個(gè)處理，在室溫、15℃、5℃下自然發(fā)酵60 d后進(jìn)行營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量的測(cè)定。最終結(jié)果表明：溫度對(duì)天然牧草青貯過程有十分顯著的影響，隨著溫度的降低，干物質(zhì)、乳酸、乙酸含量、大腸桿菌數(shù)量有下降趨勢(shì)，而可溶性碳水化合物、酸性洗滌纖維含量、乳酸菌數(shù)量有上升趨勢(shì)。5℃下Z906處理組的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)含量均最高，pH值最低，乳酸含量最高，未產(chǎn)生丁酸，氨態(tài)氮含量最低。V-Score評(píng)分等級(jí)為良好，排名第一，得分為93.07，青貯品質(zhì)最優(yōu)。綜上所述，在北方較冷地區(qū)對(duì)天然草青貯，可添加Z906菌株的應(yīng)用效果最好。

關(guān)鍵詞：天然牧草；耐低溫乳酸菌；青貯；發(fā)酵品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S816.53""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）11-3610-09

Effects of Different Low-temperature Tolerant Lactic Acid Bacteria Additives

on Natural Pasture Silage Fermentation

ZHU La1， WANG Zhi-jun1， BAO Jian2， LIU Ming-jian1， YAN Yu-ting1， JIA Yu-shan1， NA Ri-su1， GE Gen-tu^1*

（1.College of Grassland and Resources and Environment， Inner Mongolia Agricultural University Key Laboratory of Forage

Cultivation and the Processing and Highly Efficient Utilization of the Ministry of Agriculture， Key Laboratory of Grassland

Resources of the Ministry of Education， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China； 2.Inner Mongolia Academy of Agricultural

and Animal Husbandry Sciences， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China）

Abstract：In order to explore the impact of early screened low-temperature-tolerant lactic acid bacteria on natural pasture silage fermentation，this experiment used natural pasture as raw material and set up 5 treatments without additives，CH （commercial strain），low-temperature-resistant strain Z906，L12，and compound strain ZL. After 60 days of natural fermentation at room temperature，15℃，and 5℃ the nutritional content，fermentation quality and microbial population were determined. The final results showed that temperature had a significant effect on the silage process of natural grass. As the temperature decreases，dry matter，lactic acid，acetic acid content，and the number of coliform bacteria had a downward trend，while water soluble carbohydrate，acid detergent fiber content，and the number of lactic acid bacteria had an upward trend. At 5℃，the Z906 treatment group had the highest dry matter and crude protein contents，the lowest pH value，the highest lactic acid content，no butyric acid production，and the lowest ammonia nitrogen content. The V-Score rating ranked first with a score of 93.07，and the silage quality was the best. In summary，the application of Z906 strain was the best for natural grass silage in cold regions of northern China.

Key words：Natural pasture;Low-temperature tolerant lactic acid bacteria;Silage;Fermentation quality

收稿日期：2024-04-25；修回日期：2024-06-18

基金項(xiàng)目：功能性添加劑對(duì)全混合發(fā)酵日糧養(yǎng)分保存與養(yǎng)殖效果的調(diào)控（2022YFE0111000-3）資助

作者簡(jiǎn)介：

珠拉（1999-），女，蒙古族，內(nèi)蒙古阿拉善人，碩士研究生，主要從事牧草加工與利用研究，E-mail：1905756445@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：gegentu@163.com

天然牧草是草原上的一種重要飼料來源，是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是維持草原生態(tài)平衡的生態(tài)屏障^［1］。天然打草場(chǎng)為家畜提供飼草儲(chǔ)備，是保證家畜安全過冬的重要草地資源^［2］，天然草地資源的開發(fā)利用尚有很大提升空間^［3］。青貯是天然草地牧草的重要利用方式之一，青貯能夠最大限度地保存天然草地牧草的營養(yǎng)成分，青貯飼料適口性好且消化率高，可延長牧草保存期^［4］，是草食家畜能量攝入的重要組成部分^［5］。青貯能夠不受氣候變化的影響，可有效地解決飼草供給季節(jié)性限制的難題，為牲畜冬春季的生長和繁殖提供可靠的保障^［6］。大多數(shù)天然草地牧草復(fù)雜多樣，屬于調(diào)制難度較大的青貯原料^［7］。天然草具有較高的緩沖能值和較低的乳酸菌附著量、含水量、可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）含量，青貯過程中pH值難以降低難發(fā)酵成為優(yōu)質(zhì)青貯飼料^［8］。因此，天然牧草在青貯過程中需要添加菌劑、酶制劑等來提高青貯的成功率。青貯發(fā)酵過程中有著微生物演替，主要微生物包括乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和梭菌等^［9］。乳酸菌添加劑在世界大部分地區(qū)已成為主要的青貯添加劑，在許多國家已經(jīng)有數(shù)十年的歷史，乳酸菌適合在低氧或無氧條件下生長，產(chǎn)酸和耐酸能力較強(qiáng)^［10］。自然條件下，天然草地牧草表面附著的乳酸菌通常數(shù)量較低且活性不足，在青貯發(fā)酵中不易成為優(yōu)勢(shì)菌種。在青貯飼料中加入乳酸菌后，可以明顯提高青貯飼料中乳酸菌的含量，同時(shí)降低中性洗滌纖維和半纖維素含量^［11］，因此利用青貯添加劑來提高青貯質(zhì)量是一種非常有效的方法^［12］。北方寒流侵襲較早^［13］，天然牧草在收獲時(shí)氣溫已降至15℃以下，青貯溫度較低，面臨青貯發(fā)酵進(jìn)程緩慢的問題。普通乳酸菌在這樣的低溫下活性較低，很難發(fā)揮應(yīng)有的作用。因此，篩選耐低溫乳酸菌也許可以有效解決這一問題。在篩選適宜天然草地牧草青貯添加的乳酸菌菌株時(shí)，需要有針對(duì)性地篩選出適合于天然牧草青貯的乳酸菌菌種。本研究以天然牧草為研究對(duì)象，針對(duì)天然牧草含糖量低，原料中的乳酸菌數(shù)量及活性不足，發(fā)酵溫度低等問題，篩選出耐低溫青貯的乳酸菌菌種。本課題組前期從燕麥（Avena sativa L.）、牧草等原材料中篩選獲得了菌株，但尚未對(duì)該菌株進(jìn)行更深層次的低溫篩選，更未對(duì)其在低溫條件下應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本研究在低溫條件下篩選出2個(gè)菌株，擬對(duì)2個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)試，比較其在不同溫度下對(duì)天然草青貯發(fā)酵的影響，能夠?yàn)樘烊徊莸啬敛莸蜏厍噘A乳酸菌添加劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于成功調(diào)制天然草地牧草青貯并提高其青貯品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 青貯原料 試驗(yàn)所用青貯原料生長在內(nèi)蒙古呼倫貝爾市海拉爾區(qū)，海拉爾區(qū)年平均氣溫為-1.3℃，1月份最低，平均為-25.8℃;7月份氣溫最高，平均為20.0℃。無霜期平均118 d，平均初霜期在9月10日，終霜期在5月24日;凍結(jié)期平均每年10月29日至次年4月9日解凍（10 cm土層）。年平均降水量348.35 mm左右。試驗(yàn)地植物主要有羊草（Leymus chinensis Trin Tzvel.）、豬毛蒿（Artemisia scoparia Waldst.amp; Kit.）、馬藺（Iris lactea Pall）、貝加爾針茅（Stipa baicalensis Roshew.）、冰草（Agropyron cristatum（L. Gaertn））、蒙古韭（Allium mongolicum Regel.）、委陵菜（Potentilla mudicaulis Ser.）、冷蒿（Artemisia frigida Wild.）、大籽蒿（Artemisia sieversiana Ehrhart ex Willd.）等。取樣時(shí)間為2023年7月29日，將天然草青貯原料，用鍘刀切碎至2 cm后取300 g添加劑混勻裝填到 25 cm×36 cm的聚乙烯袋內(nèi)。

1.1.2 青貯添加劑 前期篩選的植物乳桿菌Z906、乳酸片球菌L12。參比乳酸菌為市售商業(yè)青貯乳酸菌添加劑LABinoculant Chikuso-1（CH，Lactobacillus plantarum，Snow Brand Seed Co.，Ltd，Sapporo，Japan）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置5個(gè)添加劑和3個(gè)溫度，共15個(gè)處理組。天然草青貯處理設(shè)置為：CK（對(duì)照組）、CH（商業(yè)青貯乳酸菌添加劑）、Z906（植物乳桿菌）、L12（乳酸片球菌）、ZL（復(fù)合菌劑：植物乳桿菌+乳酸片球菌）。溫度梯度設(shè)置為室溫、15℃、5℃?？刂魄噘A含水量在65%左右，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，抽真空封口。青貯時(shí)乳酸菌添加量均為10 lg cfu·g^-1 FM，對(duì)照加等量蒸餾水。新鮮天然草樣品烘干進(jìn)行營養(yǎng)成分分析，包括干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維及可溶性碳水化合物含量、粗脂肪的測(cè)定；部分樣品進(jìn)行微生物數(shù)量測(cè)定，數(shù)量測(cè)定的微生物包括乳酸菌、酵母菌、一般好氧性細(xì)菌和大腸菌群。青貯發(fā)酵60 d后再進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)分析。

1.3 青貯飼料測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 營養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定 將原料、青貯樣品放置在105℃的烘箱內(nèi)殺青15 min，再放置在65℃的烘箱內(nèi)烘干48 h至恒重后粉碎。采用GB/T6435干燥法測(cè)定干物質(zhì)（Dry matter，DM）的含量^［14］;采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)（Crude protein，CP）的含量^［15］；使用ANKOM（型號(hào)：A2000i）纖維分析儀測(cè)定酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）和中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）的含量^［16］;采用蔥酮-硫酸比色法測(cè)定可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）的含量^［17］;ANKOM（XT15i）自動(dòng)脂肪分析儀測(cè)定粗脂肪（Ether extract，EE）的含量。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定 青貯開袋后取10 g樣品，加入90 mL蒸餾水，使用均質(zhì)拍打儀勻速拍打 2 min，過濾得到青貯飼料浸提液。使用酸度計(jì)測(cè)量pH;使用Agilent（型號(hào)：1100）高效液相色譜儀測(cè)定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA） 和丁酸（Butyric acid，BA）的含量;采用苯酚次氯酸比色法測(cè)定氨態(tài)氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）的含量^［18］。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù) 天然草青貯開袋后，取10 g樣品，加入90 mL無菌水，使用均質(zhì)拍打儀勻速拍打2 min，過濾得到菌液。采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)好氣性細(xì)菌；伊紅美蘭培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，使用平板計(jì)數(shù)法對(duì)微生物數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 青貯飼料的V-score評(píng)分 按照高海娟等人^［19］的研究方法，使用了V-Score體系，該體系是以氨態(tài)氮/總氮、乙酸+丙酸、丁酸三個(gè)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將三個(gè)指標(biāo)的得分相加獲得最終得分。根據(jù)最終得分，將青貯飼料質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)，即80分以上為良好、60～80之間為尚可、不及60分為不良。計(jì)算公式為表1所示。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)采集到的原始數(shù)據(jù)，在Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和表格制作，SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件用于雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的化學(xué)與微生物組成

天然草地牧草化學(xué)成分及微生物數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定，如表2所示。其中DM含量為34.63%，CP含量為16.01%，NDF含量為60.11%，ADF含量為36.55%，WSC含量為3.68%，脂肪含量為3.22%。pH值6.16呈弱酸性，附生乳酸菌數(shù)量為3.08 lg cfu·g^-1，酵母菌數(shù)量為3.23 lg cfu·g^-1，一般好氧性細(xì)菌數(shù)量為3.34 lg cfu·g^-1，大腸菌群數(shù)量為3.88 lg cfu·g^-1。

2.2 青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯營養(yǎng)成分的影響

表3為青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯營養(yǎng)成分的影響。青貯添加劑和青貯溫度互作對(duì)天然草青貯的WSC有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)ADF，EE有顯著影響（P＜0.05）。青貯添加劑對(duì)天然草青貯的DM，CP，WSC，ADF，EE有極顯著影響（P＜0.01）。青貯溫度對(duì)天然草青貯的WSC，ADF有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)DM有顯著影響（P＜0.05）。

隨著溫度的降低DM含量有下降趨勢(shì)，CH的DM含量在不同溫度下均顯著低于其他處理組。室溫下，L12處理組的DM含量最高，為37.54%，5℃下Z906處理組的DM含量最高，35.94%。隨著溫度的降低CP含量沒有顯著差異，不同溫度下的Z906，L12，ZL處理組的CP含量均高于CK及CH。室溫下，ZL處理組的CP含量顯著高于其他四組，為15.29%。隨著溫度的降低WSC含量有上升趨勢(shì)，室溫下，Z906處理組的WSC最高，為1.33%。5℃下，L12處理組的WSC含量顯著高于其他處理組。隨著溫度的降低NDF含量沒有顯著差異。室溫下，Z906處理組的NDF含量明顯低于其他處理組，為50.32%。5℃下，各處理組的NDF含量差異不顯著。隨著溫度的降低ADF含量上升趨勢(shì)，不同處理間的ADF含量差異不顯著，5℃下，ZL處理組的ADF最低，為38.37%。室溫下，添加耐低溫乳酸菌處理組的EE含量明顯高于CK、CH，而ZL處理組EE含量顯著高于其他四組，為3.8%。5℃下，ZL處理組EE含量最高。

2.3 青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

如表4所示，青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響。青貯添加劑和青貯溫度互作對(duì)天然草青貯的氨態(tài)氮有顯著影響（P＜0.05）。青貯添加劑對(duì)天然草青貯的pH值、乳酸、乙酸、丁酸、氨態(tài)氮有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)丙酸有顯著影響（P＜0.05）。青貯溫度對(duì)天然草青貯的乳酸、乙酸有顯著影響（P＜0.05）。

室溫下，Z906處理組的pH最低，為4.23，與CK、CH組有顯著差異。隨著溫度的下降，乳酸含量各組間差異不顯著。室溫下Z906處理組的乳酸含量最高，10.57%。不同溫度下Z906處理組的乳酸含量均高于其他處理組。隨著溫度的下降，乙酸含量有降低趨勢(shì)。5℃下CK組的乙酸含量最低。不同溫度下，CH及ZL處理組未檢出丙酸，15℃下的Z906、L12處理組未檢出丙酸。室溫下的L12處理組丙酸含量最高，為0.69%。不同處理組間的丁酸含量沒有顯著差異。室溫、15℃下，Z906處理組丁酸均最低，為0.13%，0.09%，5℃下，Z906處理組未檢出丁酸。各處理組間的氨態(tài)氮/總氮含量沒有顯著差異。室溫下的ZL處理組氨態(tài)氮/總氮含量最低，為0.65%，5℃下的Z906處理組的氨態(tài)氮/總氮含量最低，為0.7%。

2.4 青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯微生物數(shù)量的影響

表5為青貯添加劑和青貯溫度對(duì)天然草青貯微生物數(shù)量的影響。青貯添加劑和青貯溫度互作對(duì)天然草青貯的乳酸菌數(shù)量有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)大腸桿菌數(shù)量有顯著影響（P＜0.05）。青貯添加劑對(duì)天然草青貯的乳酸菌數(shù)量有極顯著影響（P＜0.01），大腸桿菌數(shù)量有顯著影響（P＜0.05）。青貯溫度對(duì)天然草青貯的乳酸菌、酵母菌、好氣性細(xì)菌、大腸桿菌數(shù)量有極顯著影響（P＜0.01）。

隨著溫度的下降，CK處理組乳酸菌數(shù)量有降低趨勢(shì)，其他處理組的乳酸菌數(shù)量有上升趨勢(shì)。室溫下，Z906處理組的乳酸菌數(shù)量最多，顯著高于CK組。5℃下ZL處理組的乳酸菌數(shù)量最多，與其他處理組差異顯著。隨著溫度的下降，各處理組的酵母菌數(shù)量有上升趨勢(shì)。室溫、15℃下各處理組之間差異均不顯著，5℃下ZL處理組的酵母菌數(shù)量顯著高于其他處理組。不同溫度下CH組的酵母菌數(shù)量均有顯著差異。室溫下，添加耐低溫乳酸菌處理組的好氣性細(xì)菌數(shù)量明顯低于CK和CH組，CH組的好氣性細(xì)菌數(shù)量最多。15℃下各處理組的好氣性細(xì)菌數(shù)量沒有顯著差異，5℃下ZL處理組好氣性細(xì)菌數(shù)量最多。隨著溫度的下降，各處理組的大腸桿菌數(shù)量有下降趨勢(shì)。室溫下CK、Z906處理組的大腸桿菌數(shù)量顯著低于其他處理組，Z906處理組的大腸桿菌數(shù)量最低。15℃下各處理組的大腸桿菌數(shù)量差異不顯著，Z906處理組的大腸桿菌數(shù)量最少、CK最多。5℃下Z906，L12處理組未檢出大腸桿菌。

2.5 青貯發(fā)酵品質(zhì)V-Score評(píng)分分析

表6為不同處理青貯發(fā)酵的V-Score評(píng)分。所有處理組的氨態(tài)氮/總氮得分均一樣。三個(gè)溫度梯度下Z906處理組的得分均是最高，在5℃下總分最高排名第一，為93.07，等級(jí)為良好。15℃下的總分為82.54，排名第二，等級(jí)為良好。其他所有處理組的等級(jí)均為尚可。

3 討論

3.1 原料特性

乳酸菌青貯發(fā)酵需要底物，底物來自青貯原料的營養(yǎng)成分，其含量是決定青貯品質(zhì)的關(guān)鍵因素。因此，首先要了解青貯原料的干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、可溶性碳水化合物（WSC）、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）等成分的含量^［20］。青貯原料的DM含量以32%～38%為宜^［21］。本研究中，天然草的DM含量為34.63%，符合青貯條件。粗蛋白質(zhì)含量是反映飼料營養(yǎng)價(jià)值高低的重要指標(biāo)^［22］。本研究中，CP含量為16.01%。同時(shí)，還需了解不同的植物部位和不同青貯原料中的乳酸菌和WSC是影響青貯發(fā)酵的重要因素，青貯過程中乳酸菌加入量為5～6 lg cfu·g^-1時(shí)即可超過原料所附生菌數(shù)而成為優(yōu)勢(shì)菌種，從而達(dá)到在短期內(nèi)迅速生產(chǎn)大量乳酸的效果^［23］。青貯原料中的可溶性碳水化合物是乳酸發(fā)酵的基礎(chǔ)^［24］，其含量的高低直接關(guān)系到青貯飼料的品質(zhì)。在青貯飼料中，可溶性碳水化合物（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）產(chǎn)生具有調(diào)控pH值和抑制有害微生物生長的有機(jī)酸。在本研究中，原料的可溶性碳水化合物含量為3.68%。NDF和ADF是反映飼草營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，ADF和NDF含量的高低直接影響牧草的品質(zhì)及其消化，ADF含量越低，牧草的營養(yǎng)價(jià)值及發(fā)酵品質(zhì)越好，動(dòng)物消化率越高^［25］。本研究中，NDF含量偏高，為60.11%，但ADF含量偏低，為36.55%。原料表面附著的菌群直接決定了最初的發(fā)酵過程，并對(duì)其發(fā)酵過程和方式產(chǎn)生了影響，從而改變了飼料中的多種營養(yǎng)物質(zhì)^［26］。本研究中，原料的乳酸菌數(shù)量為3.08 lg cfu·g^-1，酵母菌數(shù)量為3.23 lg cfu·g^-1，一般好氧性細(xì)菌數(shù)量為3.34 lg cfu·g^-1，大腸菌群數(shù)量為3.88 lg cfu·g^-1。乳酸菌數(shù)量需要通過使用添加劑來抑制雜菌的生長，促進(jìn)乳酸菌的發(fā)酵作用，保障青貯飼料的品質(zhì)。

3.2 青貯溫度和添加劑對(duì)天然草青貯營養(yǎng)成分的影響

青貯是一個(gè)通過乳酸菌發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)長期保存青綠飼料的過程。乳酸菌是青貯發(fā)酵的主要菌種，其適宜的生長溫度通常為37℃，發(fā)酵溫度的過高過低都會(huì)影響菌株的生長^［27］。因此，環(huán)境溫度的改變將通過對(duì)微生物活力的影響，從而對(duì)發(fā)酵過程產(chǎn)生影響。由于我國北方天然牧草收割時(shí)，溫度已經(jīng)低于15℃，青貯溫度較低，所以需要耐低溫的乳酸菌為添加劑，對(duì)天然草進(jìn)行青貯。近年，許多研究者就青貯用耐高溫乳酸菌進(jìn)行了篩選，青貯用耐低溫乳酸菌的報(bào)道較少^［28］，對(duì)能夠用于天然草青貯的耐低溫乳酸菌也鮮有報(bào)道。前期添加乳酸菌可為青貯料提供大量乳酸菌，促進(jìn)有機(jī)酸的生成，迅速降低pH值加快進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段，進(jìn)而抑制梭菌、腐敗菌等有害微生物的繁殖，降低青貯飼料中的營養(yǎng)損失。青貯添加劑對(duì)天然牧草感官性狀具有一定的影響，可以通過添加劑提升天然牧草青貯的感官品質(zhì)^［29］。靳思玉等^［30］的研究表明低溫環(huán)境下的干物質(zhì)消失率顯著高于常溫組。本研究隨著溫度的降低DM含量有下降趨勢(shì)，這與靳思玉研究中一致。本研究中，不同溫度下的Z906，L12，ZL處理組的CP含量均高于CK及商用組。這與呂好新等^［31］研究一致，其研究將兩株具有耐低溫性的乳酸菌添加到小麥秸稈5℃青貯發(fā)酵。青貯過程在發(fā)酵結(jié)束階段，與對(duì)照組（不加菌）相比，實(shí)驗(yàn)組具有較高的蛋白質(zhì)。WSC在青貯過程中的變化反映了乳酸菌對(duì)其利用并產(chǎn)生乳酸的情況。秦麗萍等^［32］研究中由于15℃時(shí)限制了部分乳酸菌的活動(dòng)，消耗了相對(duì)較少的WSC，青貯后保存有較多的WSC，與本研究一致。本研究中，5℃下的WSC含量最高。溫度對(duì)可溶性碳水化合物有極顯著影響。青貯添加劑對(duì)天然草青貯的可溶性碳水化合物有極顯著影響。田瑞霞等^［33］研究指出NDF，ADF能很好地反映纖維質(zhì)量好壞，其含量受青貯初期細(xì)胞呼吸作用和后期的酶解作用的影響較大，本研究與其研究結(jié)果一致。本研究中，隨著溫度的降低ADF含量上升趨勢(shì)。有研究表明，低溫青貯時(shí)添加耐低溫乳酸菌可以有效改善發(fā)酵進(jìn)程，調(diào)控低溫對(duì)青貯造成的負(fù)面影響，提升青貯品質(zhì)^［34］。

3.3 青貯溫度和添加劑對(duì)天然草發(fā)酵品質(zhì)的影響

在青貯發(fā)酵過程中，pH值是影響青貯效果的重要因素。優(yōu)質(zhì)青貯飼料應(yīng)具有較高乳酸含量的同時(shí)具有較低的pH值。低pH值有助于青貯飼料在厭氧儲(chǔ)存期間保持穩(wěn)定的條件^［35］。本研究中青貯添加劑對(duì)天然草青貯的pH值有極顯著影響，5℃下Z906處理組的pH值最低。Zhu等^［36］在燕麥（Avena sativa）青貯中添加耐低溫LAB FO3，5℃青貯60 d后pH值均顯著降低。本研究與Zhu等^［36］的結(jié)果一致。有機(jī)酸是衡量青貯飼料品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，其中不同種類的有機(jī)酸能直觀地反映出哪些微生物在青貯飼料中占優(yōu)勢(shì)^［37］。氨態(tài)氮是由蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生的，反映了青貯飼料蛋白質(zhì)的降解程度^［38］。本研究中，青貯添加劑和青貯溫度互作對(duì)天然草青貯的氨態(tài)氮有顯著影響。青貯添加劑對(duì)天然草青貯的pH值、氨態(tài)氮有極顯著影響。青貯溫度對(duì)pH、氨態(tài)氮沒有顯著影響。5℃下Z906處理組的pH、NH3-N含量均最低。段娜寧等^［39］研究表明，溫度過低也不利于發(fā)酵的進(jìn)行，在低溫發(fā)酵條件下，發(fā)酵速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高溫發(fā)酵，青貯產(chǎn)生乳酸不足，致使發(fā)酵品質(zhì)不佳。乳酸由乳酸菌發(fā)酵底物產(chǎn)生，可以迅速降低青貯飼料pH值^［40］。在本研究中，Z906處理組產(chǎn)生的乳酸含量顯著高于其他處理組，pH也相對(duì)較低，與荊佩欣等^［40］的研究一致。陳明霞等^［41］的研究中，耐低溫乳酸菌處理組相對(duì)于CK處理，可提高乳酸含量，顯著降低青貯材料的pH值及NH3-N含量，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。本研究中，5℃下，耐低溫乳酸菌處理組的乳酸含量高于對(duì)照組。與陳明霞的研究結(jié)果一致。低溫乳酸菌能夠使青貯體快速形成酸性環(huán)境，抑制植物蛋白酶活性和大腸桿菌活性，形成較少的乙酸含量和氨態(tài)氮/總氮比值。本研究中，隨著溫度的下降，乙酸含量有降低趨勢(shì)，5℃下的Z906處理組的氨態(tài)氮/總氮含量最低，為0.7%。BA含量超過一定閾值被認(rèn)為是發(fā)酵質(zhì)量差。此外也有研究指出少量的BA含量有助于干物質(zhì)的積累和能量的減少。包健等^［42］的研究中青貯飼料檢測(cè)到了BA，但低于0.20%，表明發(fā)酵品質(zhì)良好。本研究中，Z906處理組的三個(gè)溫度下的丁酸含量均很低，5℃下未檢出丁酸，與包健的研究一致。本研究中，V-Score評(píng)分體系是評(píng)價(jià)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)常用且重要方法之一，袁英良等^［43-44］在研究中均采用V-Score評(píng)分體系評(píng)價(jià)青貯品質(zhì)，由此說明V-Score評(píng)分體系具有一定代表性。本研究中15℃，5℃下Z906處理組的V-Score評(píng)分等級(jí)為良好，得分為82.54，93.07，其余處理組均為尚可，5℃下Z906處理組得分排名第一。

3.4 青貯溫度和添加劑對(duì)天然草青貯微生物數(shù)量的影響

在青貯原料中加入乳酸菌能顯著提高乳酸菌的含量，從而加速發(fā)酵過程。青貯飼料中乳酸菌的數(shù)量對(duì)其青貯品質(zhì)有很大的影響，乳酸菌的活性又是決定青貯是否能夠順利發(fā)酵的關(guān)鍵因素^［45］。張寧等^［46］發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行水稻秸稈青貯時(shí)，添加乳酸菌添加劑的處理組在任何青貯階段，其青貯體系中乳酸菌的數(shù)量都高于對(duì)照組。Zhang等^［47］從高山牧場(chǎng)中分離得到2株耐低溫的植物乳桿菌QZ227和QZ887，其可在5℃發(fā)酵條件下提高小麥秸稈青貯的發(fā)酵質(zhì)量，可作為低溫青貯體系中的有效啟動(dòng)劑，在寒冷地區(qū)具有潛在的青貯應(yīng)用前景。本研究中，青貯添加劑和青貯溫度互作對(duì)天然草青貯的乳酸菌數(shù)量極顯著影響、大腸桿菌數(shù)量有顯著影響。隨著青貯溫度從室溫降至5℃，乳酸菌從4.48～6.59 lg cfu·g^-1增至6.74～7.37 lg cfu·g^-1。添加乳酸菌添加劑的處理組的乳酸菌數(shù)量均高于CK組的乳酸菌數(shù)量。這一結(jié)果與張紅梅^［48］研究一致，隨著溫度的降低，除了CK處理組，其他處理組的乳酸菌數(shù)量均增加，在5℃下乳酸菌數(shù)量最多，也證實(shí)了耐低溫乳酸菌在低溫環(huán)境下生存良好。室溫下，Z906處理組的乳酸菌數(shù)量最高，酵母菌和好氣性細(xì)菌數(shù)量CK組少，CK組的乳酸菌數(shù)量最少。這說明有害微生物數(shù)量的降低從某種程度上減少了青貯飼料的耗氧腐敗，減少了DM的損失，提高了發(fā)酵品質(zhì)。外源乳酸菌的添加導(dǎo)致乳酸的大量產(chǎn)生，青貯內(nèi)部環(huán)境pH值快速下降，抑制了酵母菌的繁殖^［49］。在李平等^［50］的研究中，低溫乳酸菌能夠使青貯快速形成酸性環(huán)境，抑制植物蛋白酶活性和大腸桿菌活性，形成較少的乙酸含量。這表明，低溫乳酸菌比青貯原料中附著乳酸菌更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，能夠快速利用植物性糖分產(chǎn)生乳酸，抑制異型乳酸菌活性。在本研究中，隨著溫度的降低，大腸桿菌的數(shù)量下降，乙酸含量也下降，這與李平研究一致。低溫條件下增加耐低溫乳酸菌的接種劑量可顯著提高青貯品質(zhì)，有效抑制大腸桿菌等有害細(xì)菌生長^［51］。

4 結(jié)論

通過營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)，同時(shí)應(yīng)用V-Score評(píng)分體系，添加不同乳酸菌對(duì)天然草低溫青貯品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。最終結(jié)果表明：溫度對(duì)天然牧草青貯過程有十分顯著的影響，隨著溫度的降低，干物質(zhì)、乳酸、乙酸含量、大腸桿菌數(shù)量有下降趨勢(shì)，而可溶性碳水化合物、酸性洗滌纖維含量、乳酸菌數(shù)量有上升趨勢(shì)。5℃下Z906處理組的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)含量均最高，pH值最低，乳酸含量最高，未產(chǎn)生丁酸，氨態(tài)氮含量最低。V-Score評(píng)分等級(jí)為良好，排名第一，得分為93.07，青貯品質(zhì)最優(yōu)。綜上所述，若在北方地區(qū)保存為主要目標(biāo)，可添加Z906菌株來提高青貯品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）