ARTP誘變選育高產腺苷菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：為獲得高產腺苷菌株，實現(xiàn)降本增效，該研究基于一株腺苷產生菌枯草芽孢桿菌SB-37，對其進行ARTP誘變選育，采用單因素實驗和響應面方法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。結果表明，最佳處理時間為30 s，菌株誘變致死率為98.75%。比對初始菌株腺苷產量，獲得8株高產腺苷突變株，其中菌株Q40-2-37腺苷產量最高，為6.20 g/L，是出發(fā)菌株的2.58倍。該菌株最適發(fā)酵條件為葡萄糖99 g/L、蛋白胨25 g/L、pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時間72 h，此條件下，腺苷產量為6.92 g/L。該研究結果為高產腺苷菌株的誘變選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化提供了技術支撐。

關鍵詞：腺苷；枯草芽孢桿菌；常壓室溫等離子體；誘變；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號：TS201.3""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0063-06

Breeding of High-Producing Adenosine Strains by ARTP Mutation and

Optimization of Fermentation Conditions

YAN Geng-xuan1， LIU Wei1， LIU Chun-yan2， TIAN Yuan1， YU Chong1，

JIANG Wei1， TIAN Jie-ping1*， ZHANG Shu-mei1*

（1.Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150010， China;

2.Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150001， China）

Abstract： In order to obtain high-producing adenosine strains and realize cost reduction and efficiency enhancement， a strain of adenosine-producing bacterium， Bacillus subtilis SB-37， is breeded by ARTP mutation， and single factor experiment and response surface method are used to optimize the fermentation conditions of the strain. The results show that the optimal treatment time is 30 s and the mutation fatality rate is 98.75%. Compared with the adenosine yield of the original strain， 8 high-producing adenosine mutant strains are obtained， and strain Q40-2-37 has the highest adenosine yield of 6.20 g/L， which is 2.58 times that of the original strain. The optimal fermentation conditions of the strain are glucose of 99 g/L， peptone of 25 g/L， pH of 7.04， inoculation amount of 8.03% and fermentation time of 72 h.Under these conditions， the adenosine yield is 6.92 g/L. The results of this study have provided technical support for the mutation and breeding of high-producing adenosine strains and optimization of fermentation conditions.

Key words： adenosine; Bacillus subtilis; atmospheric and room temperature plasma; mutation; optimization of fermentation conditions

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.012

引文格式：閆更軒，劉偉，劉春燕，等.ARTP誘變選育高產腺苷菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化.中國調味品，2024，49（8）：63-68.

YAN G X， LIU W， LIU C Y， et al.Breeding of high-producing adenosine strains by ARTP mutation and optimization of fermentation conditions.China Condiment，2024，49（8）：63-68.

收稿日期：2024-01-26

基金項目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務費項目（CZKYF2023-1-B041）

作者簡介：閆更軒（1996—），男，助理研究員，碩士，研究方向：工業(yè)菌種選育。

*通信作者：田潔萍（1971—），女，高級工程師，研究方向：科技管理；

張淑梅（1969—），女，研究員，博士，研究方向：食品微生物。

呈味核苷酸作為一種新型調味品，在食品行業(yè)中應用廣泛，海鮮、蘑菇等食品中含有豐富的核苷酸，主要包括肌苷酸、鳥苷酸和腺嘌呤核苷酸。腺嘌呤核苷酸是一種苦味阻滯食品添加劑，由于成本高，尚未得到廣泛應用。腺苷又叫腺嘌呤核苷，是一類具有重要生物學功能的核苷酸衍生物，不僅是制造阿糖腺苷、腺苷三磷酸與環(huán)磷酸腺苷等核苷類藥物的重要中間體，而且是制造食品呈味劑腺嘌呤核苷酸的重要原料，在醫(yī)藥和食品領域的商業(yè)價值巨大。腺苷生產主要有化學、酶解和微生物發(fā)酵3種方式。化學合成法由于合成工藝相對復雜、成本較高且提取率低，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產。酶解法受酶成本和提純工藝的限制，已經退出市場。微生物發(fā)酵法是目前首選的腺苷生產方式，提高菌株發(fā)酵能力是腺苷行業(yè)急需解決的共性問題。

常壓室溫等離子體（ARTP）作為微生物誘變育種新技術已廣泛應用于工業(yè)菌株的改造，通過誘變育種獲得高產腺苷的優(yōu)良底盤菌，基因工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高腺苷產能、實現(xiàn)降本增效的重要途徑。本研究基于一株腺苷產生菌枯草芽孢桿菌SB-37，通過等離子體誘變技術，旨在獲得一株腺苷產量高且遺傳穩(wěn)定的誘變菌株，采用單因素實驗和響應面分析對誘變菌株進行培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期進一步提高腺苷產量，該研究為利用基因工程技術改造腺苷產生菌提供了菌株資源，為腺苷的發(fā)酵生產提供了技術參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

枯草芽孢桿菌SB-37：保存于黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2" 主要試劑

腺苷標準品：購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、瓊脂等試劑：購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3" 主要儀器與設備

ARTP誘變育種儀" 無錫源清天木生物科技有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計" 北京普析通用儀器有限責任公司；ZQLY-300V恒溫搖床" 上海知楚儀器有限公司。

1.4" 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，瓊脂1.5%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，泡敵0.03%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖7%，蛋白胨2.5%，磷酸二氫鉀0.3%，七水硫酸鎂0.1%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，硫酸銨1.5%，一水硫酸錳0.001%，硫胺素0.015%，豆餅粉水解液1.5%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

1.5" 方法

1.5.1" ARTP誘變

用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌SB-37至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用無菌水重懸使菌濃度為106～108 個/mL，在超凈臺上取10 μL菌液均勻涂布在無菌載片表面，用無菌鑷子將載片放到ARTP誘變儀對應凹槽中，按以下參數(shù)處理：電源功率120 W，作用距離 2 mm，氣流速度 10 SLM，分別照射20，30，40，50，60，80，100 s，以無照射作為對照。照射后，用無菌鑷子將載片放置于無菌水中洗脫，適當稀釋后涂布于LB培養(yǎng)皿。于30 ℃培養(yǎng)24 h后，計算菌落數(shù)，根據(jù)致死率篩選合適的誘變時間。致死率（%）=（對照活菌數(shù)-處理活菌數(shù)/對照活菌數(shù)）×100%。

1.5.2" 高產腺苷菌株的篩選

依次挑取單菌落接種到 10 mL種子培養(yǎng)液中，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵上清液在水浴鍋中煮沸5 min，以8 000 r/min離心5 min。取1 μL上清液加入1 mL 0.1 mol/L pH 3的鹽酸溶液，混勻，在260 nm波長下測定OD260 nm吸光度。通過腺苷標準品的標準曲線計算腺苷產量。

1.5.3" 單因素實驗

通過單因素實驗研究碳源葡萄糖的添加量、氮源尿素和蛋白胨的添加量、接種量、發(fā)酵時間、培養(yǎng)基初始pH等因素對腺苷產量的影響，篩選出主要影響因素，進行響應面分析。單因素實驗設計見表1。

1.5.4" Box-Behnken設計

基于單因素實驗結果，以葡萄糖添加量（A）、初始pH（B）和接種量（C）為因素設計三因素三水平實驗，優(yōu)化所選突變株的腺苷生產能力，Box-Behnken設計見表2。

1.5.5" 數(shù)據(jù)處理

全部實驗進行3次生物學重復，應用SPSS Statistics 26.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理，結果以平均值±標準差表示，采用Origin 2021軟件繪圖，使用Design-Expert 12軟件進行響應面相關結果分析。

2" 結果與分析

2.1" ARTP誘變時間對菌株生存的影響

ARTP處理時間是影響菌株生存和誘變效果的主要因素，菌株致死率與照射時間呈正相關，延長照射時間，菌株致死率提高。由圖1可知，照射處理20 s時誘變致死率為89.50%，照射處理 60 s時誘變致死率達到100%。ARTP誘變處理時間的選擇因菌株而異，研究表明，誘變時間過長會導致枯草芽孢桿菌產生不可逆的DNA損傷，無法進行自我修復。本研究中枯草芽孢桿菌SB-37在通氣量10 SLM、功率120 W、照射距離2 mm的條件下，處理時間為30 s時誘變致死率已經達到98.75%，遠遠高于楊心萍等的約60%，推測與誘變處理操作方式或菌種特性有關。

2.2" 突變菌株的篩選

將不同處理時間下的單菌落進行液體培養(yǎng)后測定腺苷含量，從1 642個菌株中獲得131個腺苷產量較高的正突變菌株，正突變率為7.97%，有8個菌株腺苷產量顯著提高，見表3。其中編號為Q40-2-37的菌株產量最高，為6.20 g/L，是原始菌株的2.58倍。對Q40-2-37菌株進行傳代培養(yǎng)5次后，菌株生長穩(wěn)定，其腺苷產量在5.86～6.20 g/L之間，表明Q40-2-37菌株的遺傳性能較穩(wěn)定。

2.3" 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1" 單因素實驗

2.3.1.1" 碳源添加量對腺苷產量的影響

比較了在相同發(fā)酵條件下葡萄糖的添加量對Q 40-2-37菌株腺苷產量的影響，結果見圖2。

由圖2可知，當葡萄糖添加量為50～90 g/L時，腺苷產量隨著葡萄糖添加量的增加而升高，當葡萄糖添加量為90 g/L時腺苷產量達到最大，為6.46 g/L。當葡萄糖添加量大于90 g/L時，腺苷產量不再上升，反而略有下降。批次發(fā)酵葡萄糖濃度過高，培養(yǎng)液的黏度增加，傳質能力和溶解氧降低，滲透壓增大，影響芽孢桿菌的生長和初級代謝物的產量。葡萄糖添加量為90 g/L最適合Q40-2-37菌株產生腺苷。

2.3.1.2" 氮源添加量對腺苷產量的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵一般應用復合氮源，本研究參考楊心萍等的報道，選用尿素與蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源。固定培養(yǎng)基中尿素含量為5 g/L，比較了相同發(fā)酵條件下蛋白胨的添加量對Q40-2-37菌株腺苷產量的影響，結果見圖3。

由圖3可知，初期蛋白胨濃度較低時，隨著蛋白胨添加量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷產量隨之增大，當?shù)鞍纂颂砑恿窟_到30 g/L時，繼續(xù)添加蛋白胨，腺苷產量基本保持不變，因此考慮綜合應用成本，選擇蛋白胨的最佳添加量為30 g/L。

2.3.1.3" 接種量對腺苷產量的影響

接種量直接影響發(fā)酵液中后期菌體含量，是影響初級代謝物發(fā)酵水平的重要因素。比較了相同發(fā)酵條件下不同接種量對Q40-2-37菌株腺苷產量的影響，結果見圖4。

由圖4可知，初期接種量較低時，隨著接種量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷產量隨之增大，當接種量達到8%時，腺苷產量達到最高，為6.13 g/L，繼續(xù)升高接種量會使腺苷產量下降，故選擇8%為最佳接種量。

2.3.1.4" 發(fā)酵時間對腺苷產量的影響

菌體的生長和代謝水平會隨著發(fā)酵過程逐漸達到飽和，比較了在相同發(fā)酵條件下不同發(fā)酵時間對Q40-2-37菌株腺苷產量的影響，結果見圖5。

由圖5可知，菌株腺苷產量隨著發(fā)酵時間的增加而升高，當發(fā)酵時間為24 h時，部分菌體仍處于生長期，此時腺苷產量較低，當發(fā)酵時間為72 h時，菌體生產腺苷的水平基本達到峰值，此時腺苷產量為5.84 g/L，而發(fā)酵時間為96 h和120 h時，檢測到的腺苷產量變化較小。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為72 h。

2.3.1.5" 培養(yǎng)基初始pH對腺苷產量的影響

通過改變培養(yǎng)基初始pH明確在不同酸堿度條件下Q40-2-37菌株的腺苷產量，結果見圖6。

由圖6可知，pH為7.0時腺苷產量最高，為5.92 g/L，pH過高或過低均會使腺苷產量下降，這與楊心萍等的研究結果一致。因此，選擇腺苷發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基初始pH為7.0。

2.3.2" 響應面實驗設計

基于單因素實驗結果，以對腺苷產量影響較大的3個因素（葡萄糖添加量、初始pH、接種量）設計3個水平共17組實驗，實驗號6，9，11，14的腺苷產量較高，與其他實驗號相比差異顯著（見表4）。對A（葡萄糖添加量）、B（初始pH）、C（接種量）3 個單因素進行二次多項式回歸擬合，構建響應值Y（腺苷產量）的回歸模型方程：Y=6.86-0.053 7A+0.232 5B+0.043 8C+0.157 5AB-0.015 0AC-0.052 5BC-0.480 0A2-1.06B2-0.660 0C2。

對回歸模型進行方差分析和差異顯著性檢驗，見表5。

由表5可知，回歸模型的F值為289.43（Plt;0.000 1），極顯著；失擬項的F值為1.99（P=0.257 8），不顯著，表明模型擬合良好。葡萄糖添加量（A）對腺苷產量的影響顯著（Plt;0.05），初始pH（B）對腺苷產量的影響極顯著（Plt;0.01），接種量（C）對腺苷產量的影響不顯著（Pgt;0.05）；交互項AB對腺苷產量的影響極顯著（Plt;0.01），AC、BC對腺苷產量的影響不顯著（Pgt;0.05）；二次項A2、B2、C2對腺苷產量的影響均極顯著（Plt;0.01）。

圖7中響應面三維曲面圖能夠體現(xiàn)出A（葡萄糖添加量）、B（pH）、C（接種量）3 個單因素之間的交互作用對腺苷產量的影響。

由圖7可知，3個因素對腺苷產量影響的顯著性順序為B（初始pH）＞A（葡萄糖添加量）＞C（接種量）。由回歸模型推測的最佳發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時間72 h、蛋白胨添加量25 g/L。

2.3.3" 最佳發(fā)酵條件的確定及驗證

通過對所得模型進行分析，得到腺苷生產的最佳發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時間72 h、蛋白胨添加量25 g/L，預測的腺苷產量為6.85 g/L。搖瓶實驗驗證得到腺苷產量為6.92 g/L，與預測值相近，表明該模型的擬合度較好，具有參考價值。

3" 結論

采用ARTP技術誘變選育高產腺苷菌株，獲得8株產量較高的正突變菌株。采用單因素實驗和響應面分析優(yōu)化了腺苷產量最高的突變株的液體發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、蛋白胨添加量25 g/L、pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時間72 h，此條件下，腺苷產量為6.92 g/L，是出發(fā)菌株的2.93倍，比優(yōu)化前提高了0.42 g/L。腺苷是生產核苷酸類食品呈味劑的重要原料，高產菌株是促進產業(yè)規(guī)?；l(fā)展的核心，本研究選育了一株產量比較高的菌株，未來將以該菌株為底盤菌，通過阻斷組氨酸合成途徑、增加腺苷代謝流等策略對菌株進行改良，以期進一步提高腺苷生產水平。

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