復(fù)合酶酶解法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的工藝優(yōu)化

摘要：該研究探討了不同種類蛋白酶對(duì)中華草龜皮膠原蛋白酶解液的水解度和DPPH自由基清除率的影響，并進(jìn)一步研究了復(fù)合蛋白酶對(duì)膠原蛋白的酶解效果。此外，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合酶酶解條件。結(jié)果表明，由胰蛋白酶和堿性蛋白酶按1∶1組成的復(fù)合酶對(duì)龜皮膠原蛋白進(jìn)行酶解，可顯著提高酶解液的水解度和DPPH自由基的清除率（Plt;0.05）；優(yōu)化的復(fù)合酶酶解工藝為復(fù)合酶添加量5 000 U/g、酶解pH值7.5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h，在該酶解工藝條件下，水解度達(dá)（51.19±2.45）%，DPPH自由基清除率達(dá)（51.78±2.21）%。影響復(fù)合酶酶解效果的主次順序?yàn)槊柑砑恿縢t;酶解pH值gt;酶解時(shí)間gt;酶解溫度。

關(guān)鍵詞：中華草龜；膠原蛋白肽；復(fù)合酶酶解；胰蛋白酶；堿性蛋白酶

中圖分類號(hào)：TS201.25""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）08-0028-06

Optimization of Preparation Technology of Chinemys reevesii Skin Collagen

Peptide by Compound Enzymes Enzymatic Hydrolysis Method

YU Dan-dan1， WEI Wen-zhi2， GUAN Li1， CHEN Wen-zhuo1， CAO Hui1*

（1.College of Tourism and Culinary Science， Yangzhou University， Yangzhou 225127， China;

2.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225001， China）

Abstract： In this study， the effects of different types of proteases on the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate of Chinemys reevesii skin collagen enzymatic hydrolysate are studied， and the enzymatic hydrolysis effect of compound proteases on collagen is further studied. In addition， the enzymatic hydrolysis conditions of compound enzymes are optimized by orthogonal test. The results show that the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate are significantly improved （Plt;0.05） when Chinemys reevesii skin collagen is hydrolyzed by the compound enzymes composed of trypsin and alkaline protease at 1∶1.The optimized compound enzymatic hydrolysis process is as follows： the addition amount of compound enzymes is 5 000 U/g， enzymatic hydrolysis pH value is 7.5， enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃， and enzymatic hydrolysis time is 3 h. Under such enzymatic hydrolysis process conditions， the hydrolysis degree reaches （51.19±2.45）%， and the DPPH free radical scavenging rate reaches （51.78±2.21）%.The primary and secondary order that affects the compound enzymatic hydrolysis effect is enzyme addition amountgt;enzymatic hydrolysis pH valuegt;enzymatic hydrolysis timegt;enzymatic hydrolysis temperature.

Key words： Chinemys reevesii; collagen peptide; compound enzymes enzymatic hydrolysis; trypsin; alkaline protease

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.006

引文格式：虞丹丹，魏文志，關(guān)利，等.復(fù)合酶酶解法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的工藝優(yōu)化.中國(guó)調(diào)味品，2024，49（8）：28-33.

YU D D， WEI W Z， GUAN L， et al.Optimization of preparation technology of Chinemys reevesii skin collagen peptide by compound enzymes enzymatic hydrolysis" method.China Condiment，2024，49（8）：28-33.

收稿日期：2024-01-14

基金項(xiàng)目：蘇北科技專項(xiàng)（2021022）

作者簡(jiǎn)介：虞丹丹（1998—），女，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生。

*通信作者：曹暉（1968—），女，副教授，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與加工。

龜甲膠是我國(guó)的名貴中藥材，而中華草龜是加工龜甲膠的主要原料，在中國(guó)、韓國(guó)和日本分布廣泛。近年來(lái)，隨著中藥材龜板的取用以及市場(chǎng)上對(duì)龜甲膠需求量的增大，產(chǎn)生了大量中華草龜皮，研究表明中華草龜皮富含膠原蛋白。膠原蛋白為大分子物質(zhì)，具有抗氧化性，進(jìn)入人體小腸后難以被吸收，但降解為多肽后較易被吸收。近年來(lái)，酶解制備膠原蛋白肽的研究表明，膠原蛋白肽具有抗氧化、抑菌、降血壓等生物功能，可增強(qiáng)食品的保健功能；而蛋白酶酶解所制備的膠原蛋白肽含有豐富的呈味氨基酸，呈味性能較好，可用于開發(fā)新型調(diào)味品。

膠原蛋白肽的制備方法主要分為化學(xué)法、生物酶酶解法。化學(xué)法制備膠原蛋白肽，肽損失嚴(yán)重；生物酶酶解法制備膠原蛋白肽，污染風(fēng)險(xiǎn)低，但大多采用單酶水解，水解度較低。提高動(dòng)物皮膠原蛋白的水解度及其肽的生物活性備受廣大科研者的關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，復(fù)合酶酶解工藝可以產(chǎn)生數(shù)量更多、分子量更小的多肽，于文影研究表明，單酶酶解膠原蛋白，酶解液的水解度最大為18.03%，而胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)合酶酶解水解度提高到21.41%。彭易鑫等研究表明雙酶復(fù)合酶解得到的多肽的抗氧化能力明顯高于單酶酶解。

目前，使用復(fù)合酶法制備中華草龜皮膠原蛋白肽的研究較少，本研究探討了不同蛋白酶對(duì)中華草龜皮膠原蛋白酶解效果的影響，并優(yōu)化了復(fù)合酶酶解工藝，以期為新型調(diào)味品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)原料與試劑

中華草龜皮膠原蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制；胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶：均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；乙酸、氫氧化鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鄰苯二甲醛、四硼酸鈉、PBS緩沖液：均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2" 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

BBA124S/224S分析天平" 山東歐萊博儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)" 上海儀分科學(xué)儀器有限公司；LyoBeta冷凍干燥機(jī)" 西班牙Telstar公司；Allegra X-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)" 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器" 金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀" 北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。

1.3" 試驗(yàn)方法

1.3.1" 中華草龜皮膠原蛋白酶解工藝流程

稱取適量中華草龜皮膠原蛋白，用PBS緩沖液溶解，制備底物濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液。將溶液的pH值調(diào)至蛋白酶最適pH值，酶解4 h，沸水浴10 min，冷卻至室溫后調(diào)pH值至中性。以4 000 r/min離心15 min，過(guò)濾，取上清液，真空冷凍干燥。

1.3.2" 水解度（DH）的測(cè)定

膠原蛋白肽的水解度采用鄰苯二甲醛（OPA）法測(cè)定。

OPA試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）：將200 mg OPA溶解于5 mL無(wú)水乙醇中，加入125 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液（pH 9.75）、0.5 mL β-巰基乙醇和12.5 mL 10% SDS溶液，定容至250 mL。

酶解液水解度的測(cè)定：將50 μL膠原蛋白酶解液與3 mL OPA試劑混合，室溫下靜置5 min，在340 nm處測(cè)定其吸光值。

Serine NH2=A樣品-A空白A標(biāo)準(zhǔn)-A空白×CSerine NH2×10-3×DX×P。

式中：CSerine NH2為每克蛋白中所含L-絲氨酸含量，0.951 6 mmol/g；D為稀釋倍數(shù)；X為樣品質(zhì)量，g；P為樣品中蛋白質(zhì)含量，%。

水解度（%）=（Serine NH2-β）/αHhot×100%。

式中：Hhot為膠原蛋白中含有的肽鍵總數(shù)，11.1 mmol/g；α=0.8，β=0.5。

1.3.3" DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Huang等的方法，準(zhǔn)確稱取DPPH，配制成0.2 mmol/L DPPH溶液，于棕色瓶中避光低溫保存。取2 mL樣品液于試管內(nèi)，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合均勻，室溫下避光靜置30 min 后，測(cè)定其在517 nm 處的吸光值。樣品的DPPH·清除率按下式計(jì)算：

清除率（%）=（1－A1－A2A3）×100%。

式中：A1為樣品加DPPH溶液的吸光值；A2為樣品加95%乙醇溶液的吸光值；A3為DPPH溶液加95%乙醇溶液的吸光值。

1.3.4" 單一蛋白酶的篩選

將冷凍干燥的膠原蛋白用0.02 mol/L、pH值為7.5的PBS溶液配制成5 mg/mL的膠原蛋白溶液，用恒溫磁力攪拌器加熱至所需溫度，5種酶的最佳酶解條件見表1。在不同蛋白酶最適條件下酶解，比較各組的水解度。

1.3.5" 復(fù)合蛋白酶的篩選

將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶兩兩復(fù)配，復(fù)配比為1∶1，酶添加量為4 000 U/g，復(fù)合蛋白酶的酶解條件見表2，酶解4 h后比較各組酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6" 復(fù)合酶酶解單因素試驗(yàn)

1.3.6.1" 酶解pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調(diào)至5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)配比為1∶1，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為4 h，測(cè)定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.2" 酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.5，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)配比為1∶1，分別在40，45，50，55，60 ℃的酶解溫度下酶解4 h，測(cè)定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.3" 酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.5，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為4 000 U/g，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)配比為1∶1，分別酶解2，3，4，5，6 h，測(cè)定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.4" 復(fù)合酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.5，酶解溫度為50 ℃，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)配比為1∶1，分別加入3 000，3 500，4 000，4 500，5 000 U/g的復(fù)合酶酶解4 h，測(cè)定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.6.5" 復(fù)配比對(duì)酶解反應(yīng)的影響

取20 mL濃度為5 mg/mL的膠原蛋白溶液，將溶液的pH值調(diào)至8.5，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為4 000 U/g，分別加入復(fù)配比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解4 h，測(cè)定酶解液的水解度和DPPH·清除率。

1.3.7" 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解度（DH）、DPPH·清除率的總評(píng)歸一值（OD）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時(shí)間的四因素三水平正交試驗(yàn)L9（34），試驗(yàn)方案見表3。

1.3.8" 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，利用Excel 2016、Origin 2021軟件繪制圖表，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。Plt;0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單一蛋白酶的篩選

由圖1可知，中華草龜皮膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解效果最好，水解度達(dá)35.37%，DPPH·清除率達(dá)28.98%，顯著高于其他4種蛋白酶（Plt;0.05）；堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果較好，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解效果較差。5種蛋白酶的水解度和DPPH·清除率從大到小是Trygt;Alcgt;Neugt;Pepgt;Pap。結(jié)果表明，不同蛋白酶的酶解效果不同，主要是由于蛋白酶具有專一性，單酶只能水解固定的肽鍵，水解程度受到限制。復(fù)合酶切斷肽鍵的位置不同，能進(jìn)一步降低產(chǎn)物的分子量，得到分子量合理分布的膠原蛋白肽。因此，本試驗(yàn)選定胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種蛋白酶兩兩復(fù)配來(lái)酶解膠原蛋白。

2.2" 復(fù)合蛋白酶的篩選

由圖2可知，中華草龜皮膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解效果最好，其水解度明顯高于其他兩組復(fù)合酶，且DPPH·清除率最高可達(dá)43.54%。因此，本研究確定采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配來(lái)酶解中華草龜皮膠原蛋白。

2.3" 復(fù)合酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1" 復(fù)合酶酶解pH值的確定

由圖3可知，pH值在5.5～8.5之間時(shí)，水解度和DPPH·清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為8.5時(shí)，水解度和DPPH·清除率均達(dá)到最大；當(dāng)pH值gt;8.5時(shí)，水解度和DPPH·清除率均逐漸下降。由于蛋白酶的空間構(gòu)型會(huì)受pH值的影響而產(chǎn)生變化，當(dāng)pH值不適宜時(shí)蛋白酶活力降低甚至失活；并且底物與蛋白酶的解離狀態(tài)也會(huì)受到pH值的影響，從而影響蛋白質(zhì)的水解度。pH值為8.5時(shí)復(fù)合酶的酶活力最強(qiáng)，酶解效果最好。

2.3.2" 復(fù)合酶酶解溫度的確定

由圖4可知，酶解溫度在40～50 ℃之間時(shí)，水解度和DPPH·清除率均逐漸上升；當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，水解度和DPPH·清除率均達(dá)到最大；當(dāng)酶解溫度大于50 ℃時(shí)，水解度和DPPH·清除率均呈下降趨勢(shì)。由于蛋白酶活力會(huì)受到溫度的影響，酶解溫度過(guò)低時(shí)，蛋白酶活力會(huì)降低，酶解反應(yīng)速率降低；酶解溫度過(guò)高時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活力下降甚至失活，從而影響蛋白質(zhì)的水解度。因此，復(fù)合酶酶解的最佳溫度為50 ℃。

2.3.3" 復(fù)合酶酶解時(shí)間的確定

由圖5可知，酶解時(shí)間在2～4 h之間時(shí)，水解度和DPPH·清除率均呈上升趨勢(shì)，此時(shí)酶解反應(yīng)處于加速反應(yīng)階段；當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，水解度和DPPH·清除率均達(dá)到最大，酶與底物反應(yīng)完全；當(dāng)酶解時(shí)間大于4 h時(shí)，水解度和DPPH·清除率均呈下降趨勢(shì)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物濃度相應(yīng)降低，生成的復(fù)合物濃度增加使蛋白酶的活性中心被覆蓋，抑制了酶解反應(yīng)，從而導(dǎo)致膠原蛋白的水解度下降。因此，選擇4 h為最適酶解時(shí)間。

2.3.4" 復(fù)合酶添加量的確定

由圖6可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，酶解液的水解度和DPPH·清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。由于起初復(fù)合蛋白酶添加量增加，底物膠原蛋白得到充分水解，水解度增加。當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到4 000 U/g時(shí)，水解度和DPPH·清除率均趨于平緩，由于底物膠原蛋白不足，酶用量達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)。因此，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，選擇4 500 U/g為最適復(fù)合酶添加量。

2.3.5" 復(fù)合酶復(fù)配比的確定

由圖7可知，隨著胰蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)配比逐漸減小，酶解液的水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)配比為2∶1時(shí)，水解度為48.88%，當(dāng)復(fù)配比為1∶1時(shí)，水解度為48.69%，兩者相差不大，且當(dāng)復(fù)配比為1∶1時(shí)，DPPH自由基清除率最大，因此，選擇1∶1為最適復(fù)配比。

2.4" 復(fù)合酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，影響復(fù)合酶酶解效果的主次順序?yàn)閺?fù)合酶添加量gt;酶解pH值gt;酶解時(shí)間gt;酶解溫度，最優(yōu)組合A3B2C1D1。復(fù)合蛋白酶酶解中華草龜皮膠原蛋白的最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時(shí)間3 h、復(fù)合酶添加量5 000 U/g。

由表5可知，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，復(fù)合酶添加量、酶解pH值、酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響極顯著（Plt;0.01），而酶解溫度對(duì)酶解效果的影響顯著（0.01lt;Plt;0.05）。對(duì)上述工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在A3B2C1D1條件下測(cè)得水解度和DPPH·清除率較好，分別為（51.19±2.45）%和（51.78±2.21）%。因此，最終確定復(fù)合酶的最佳酶解條件為復(fù)合酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時(shí)間3 h。

采用最優(yōu)酶解條件制備的中華草龜皮膠原蛋白多肽液凍干粉見圖8，膠原蛋白肽呈粉末狀，顏色呈乳白色，稍有腥味，沒有肉眼可見的雜質(zhì)，符合國(guó)家質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 31645—2018。

3" 結(jié)論

以水解度和DPPH·清除率為指標(biāo)，篩選出胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種單一蛋白酶。胰蛋白酶酶解膠原蛋白酶解液的水解度最高，為（35.37±1.25）%，DPPH·清除率最高，為（28.98±1.12）%。最佳復(fù)合酶組合為胰蛋白酶和堿性蛋白酶按照1∶1的比例進(jìn)行復(fù)配。復(fù)合酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)酶解條件為復(fù)合酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH值7.5、酶解時(shí)間3 h，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得水解度為（51.19±2.45）%，DPPH·清除率為（51.78±2.21）%。綜上所述，采用復(fù)合酶法制備中華草龜皮膠原蛋白肽顯著提高了膠原蛋白酶解液的水解度和DPPH·清除率（Plt;0.05），縮短了酶解時(shí)間，為制備新型調(diào)味品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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