鮮濕豆絲中優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定及ε-聚賴氨酸鹽酸鹽/丙酸鈣復(fù)配抑菌研究

摘要：鮮濕豆絲中水分含量高，易使微生物生長繁殖，導(dǎo)致鮮濕豆絲腐敗變質(zhì)。為延長鮮濕豆絲的貨架期，延緩微生物的生長速率，采用平板劃線法從腐敗鮮濕豆絲中分離出7株腐敗菌，經(jīng)鑒定為4株枯草芽孢桿菌（X1、X2、X3、X6）、1株蘇云金芽孢桿菌（X4）、1株阿氏腸桿菌（X5）、1株考氏科薩克氏菌（X7）。將無菌鮮濕豆絲接種分離出的腐敗菌，以菌落總數(shù)與酸度為檢測指標(biāo)，評價腐敗菌的致腐能力。結(jié)果表明，接種了腐敗菌的樣品，其菌落總數(shù)與酸度均大于對照組，表明7株腐敗菌均有較強的致腐能力。通過濾紙片法測定抑菌圈大小，研究不同濃度復(fù)配抑菌劑（ε-PL與CP）對7株腐敗菌的抑菌效果。其中，40% ε-PL+60% CP、20% ε-PL+80% CP兩種抑菌劑對腐敗菌有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：鮮濕豆絲；腐敗菌；致腐能力；分離與鑒定

中圖分類號：TS214""""" 文獻標(biāo)志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）08-0017-05

Isolation and Identification of Dominant Spoilage Bacteria from Fresh and Wet

Bean Shreds and Study on Antibacterial Activity of ε-Polylysine

Hydrochloride Combined with Calcium Propionate

CAO Yang1，3， HUANG Ya-qi2， XU Ping1，3， SHEN Zhang-yan4， CHEN Lei1，3*

（1.School of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430048， China;

2.College of Food Science and Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China;

3.Key Laboratory for Deep Processing of Major Grain and Oil， Ministry of Education，

Wuhan 430048， China; 4.Wuhan Laoqianji Food Co.， Ltd.， Wuhan 430072， China）

Abstract： The high moisture content in fresh and wet bean shreds can easily promote the growth and reproduction of microorganisms， leading to the spoilage and deterioration of fresh and wet bean shreds. In order to extend the shelf life of fresh and wet bean shreds and slow down the growth rate of microorganisms， seven strains of spoilage bacteria are isolated from spoiled fresh and wet bean shreds by streak plate method， and they are identified as four strains of Bacillus subtilis（X1，X2，X3，X6）， a strain of Bacillus thuringiensis（X4）， a strain of Enterobacter asburiae（X5） and a strain of Kosakonia cowanii（X7）. The isolated spoilage bacteria are inoculated onto sterile fresh and wet bean shreds， and the total number of colonies and acidity are used as the detection indexes to evaluate the spoilage ability of the spoilage bacteria. The resultsSymbol`@@show that the total number of colonies and acidity of the samples inoculated with spoilage bacteria

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.004

引文格式：曹楊，黃雅琪，徐平，等.鮮濕豆絲中優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定及ε-聚賴氨酸鹽酸鹽/丙酸鈣復(fù)配抑菌研究.中國調(diào)味品，2024，49（8）：17-21，38.

CAO Y， HUANG Y Q， XU P， et al. Isolation and identification of dominant spoilage bacteria from fresh and wet bean shreds and study on antibacterial activity of ε-polylysine hydrochloride combined with calcium propionate.China Condiment，2024，49（8）：17-21，38.

收稿日期：2024-02-06

基金項目：中央引導(dǎo)地方專項（2022BGE247）；湖北省自然科學(xué)青年基金項目（2023AFB304）

作者簡介：曹楊（1987—），女，實驗師，碩士，研究方向：谷物科學(xué)。

*通信作者：陳磊（1992—），男，講師，博士，研究方向：谷物科學(xué)。

are all higher than those of the control group， indicating that the seven strains of spoilage bacteria have strong spoilage ability. The size of the antibacterial zone is measured by filtering paper method to study the antibacterial effects of different concentrations of compound antibacterial agents （ε-PL and CP） on seven strains of spoilage bacteria. Among them， 40% ε-PL+60% CP， 20% ε-PL+80% CP have good antibacterial effects on spoilage bacteria.

Key words： fresh and wet bean shreds; spoilage bacteria; spoilage ability; isolation and identification

豆絲是長江中下游地區(qū)的農(nóng)家傳統(tǒng)美食，主要分布在湖北、安徽、江西等地。制作原料主要以大米為主，也可混合小麥或蕎麥等，以豆類為輔，如黃豆、綠豆、紅豆、豌豆、蠶豆等食用豆子的一種或幾種。原料經(jīng)浸泡、磨漿、燙制、攤涼、切絲、晾曬制成豆絲。成品色澤微黃，滋味鮮美，口感綿軟，營養(yǎng)豐富。目前，市售豆絲包括干豆絲與濕豆絲兩種，其中鮮濕豆絲的口感細(xì)膩，風(fēng)味濃郁，備受人們歡迎。

然而，因鮮濕豆絲水分含量高，微生物極易生長繁殖。微生物的大量繁殖是導(dǎo)致鮮濕豆絲腐敗變質(zhì)的主要原因。為延長鮮濕豆絲的貨架期，需采取有效的抑菌和殺菌措施，抑制鮮濕豆絲中腐敗微生物的生長繁殖，延緩其生長速率，達(dá)到延長鮮濕豆絲貨架期的作用。在適宜的貯藏環(huán)境下，微生物互相競爭、拮抗、互惠共生，促進自身的生長和繁殖。一種或多種微生物會成為導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要優(yōu)勢腐敗菌。優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定有助于發(fā)現(xiàn)指標(biāo)菌，為后續(xù)有針對性地選擇抑菌劑提供依據(jù)。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（ε-polylysine hydrochloride，ε-PL）是鏈霉菌屬發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物經(jīng)分離提取精制而獲得的一種生物防腐劑，水溶性好、熱穩(wěn)定性強，具有廣譜性，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有抑制作用，通過破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，造成物質(zhì)外滲，影響蛋白質(zhì)合成等正常生理功能，抑制微生物生長。丙酸鈣（calcium propionate，CP）是一種新型食品添加劑，為安全、可靠的食品防霉劑，具有抑制微生物增殖和消滅微生物的作用，是天然防腐劑的重要組成部分，能參與人體正常新陳代謝，對人體無害，用于食品的防腐和防霉，在作為防腐保鮮劑的同時能為人體提供必需的鈣質(zhì)，起到強化食品營養(yǎng)的作用。對革蘭氏陰性桿菌、好氧芽孢桿菌及各類霉菌有較強的抑制作用，是一種被廣泛應(yīng)用在富含淀粉和蛋白質(zhì)的食品中的抑菌劑。根據(jù)柵欄原理，將不同種類的防腐劑綜合應(yīng)用，可發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，在增強抑菌效果的同時可降低單一防腐劑的使用量。

因此，本文擬對鮮濕豆絲中的優(yōu)勢腐敗微生物進行分離與初步鑒定，同時選用ε-PL與CP兩種防腐劑復(fù)配成不同濃度梯度的抑菌劑，對分離出來的優(yōu)勢腐敗菌進行抑菌實驗。為進一步有針對性地尋找關(guān)于鮮濕豆絲有效的防腐保鮮措施、延長鮮濕豆絲的貨架期提供理論依據(jù)。

1" 材料和方法

1.1" 材料

大米、黃豆、綠豆：武漢老謙記食品有限公司。

1.2" 試劑

平板計數(shù)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；可溶性淀粉瓊脂、芽孢染色液：青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液：常德比克曼生物科技有限公司；丙酸鈣：河南萬邦實業(yè)有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽：浙江諾一生物科技有限公司；NaCl、香柏油：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；75%酒精：武漢東湖星科技有限公司。

1.3" 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈化工作臺" 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱" 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SOPTOP CX40電子顯微鏡" 北京悅昌行科技有限公司；JM-L50立式膠體磨" 上海諾尼輕工機械有限公司；MC-JCN30S電餅鐺" 廣東美的生活電器制造有限公司；QL-866均質(zhì)器" 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DZ-280/2SD多功能真空包裝機" 東莞市益健包裝機械有限公司。

1.4" 方法

1.4.1" 鮮濕豆絲的制備

1.4.1.1" 生產(chǎn)工藝流程

秈米、黃豆、綠豆→清洗→浸泡→磨漿→燙制→攤涼→切絲→包裝→貯藏。

1.4.1.2" 操作要點

浸泡：將秈米、黃豆、綠豆（干基比10∶2∶1）分別用水浸泡4，8，4 h。

磨漿：將浸泡后的秈米、黃豆、綠豆瀝干、混合，以1∶1.2（原料干基∶水，質(zhì)量比）的比例加入清水后使用膠體磨磨漿10 min，得豆絲漿料。

燙制：在電餅鐺中倒入定量漿料，于180 ℃燙制50 s后成型。

攤涼、切絲與包裝：將燙好的豆絲在室溫下通風(fēng)設(shè)備中放置1 h，隨后切成條狀，進行真空包裝。

貯藏：在25 ℃下貯藏。

1.4.2" 鮮濕豆絲的腐敗處理

將1.4.1中的鮮濕豆絲進行普通封口包裝，在25 ℃貯藏3 d至腐敗變質(zhì)。

1.4.3" 腐敗菌的分離純化

在無菌條件下取1.4.2中的鮮濕豆絲25 g放入225 mL無菌生理鹽水中，用均質(zhì)器拍打1.5 min，隨后取1 mL鮮濕豆絲的懸濁液進行10倍梯度稀釋，稀釋至10-7，取上述稀釋梯度為10-4，10-5，10-6，10-7的稀釋液1 mL涂布于PCA培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取菌落形態(tài)不同的菌落，采用平板劃線法進行純化培養(yǎng)，連續(xù)純化4～5次，直至長出單個菌落，將純化后所得的菌種斜面培養(yǎng)后于4 ℃保存，備用。

1.4.4" 腐敗菌的鑒定

1.4.4.1" 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察并記錄分離純化腐敗菌菌株的菌落形態(tài)，包括單菌落的顏色、質(zhì)地、形狀、大小、表面、透明度、隆起度。挑取細(xì)菌培養(yǎng)物制成載片標(biāo)本，觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄。

1.4.4.2" 生理生化鑒定

通過革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、葡萄糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣和淀粉水解實驗對分離的細(xì)菌菌株進行生理生化鑒定。

1.4.4.3" 16S rDNA鑒定

將所得菌株送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。將所得16S rDNA序列提交至NCBI的GenBank基因庫中進行同源比對，選取與目的基因序列同源性較高的菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步確定菌株的種屬性質(zhì)。

1.4.5" 腐敗菌致腐能力測定

1.4.5.1" 無菌豆絲制備

將1.4.1中制得的鮮濕豆絲在75%的酒精中浸泡1 min，用無菌風(fēng)風(fēng)干酒精，在紫外燈下照射30 min，得無菌豆絲。

1.4.5.2" 菌懸液制備

將1.4.3中保存的已純化的7種腐敗菌分別接種于PCA培養(yǎng)基上，放入生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，在無菌環(huán)境下分別挑取一定量的7種腐敗菌加入250 mL無菌水中，充分搖勻，得到待試腐敗菌菌懸液。

1.4.5.3" 無菌豆絲染菌

將制得的無菌鮮濕豆絲置于菌懸液中浸泡30 s后取出，在無菌風(fēng)下放置10 min，待晾干鮮濕豆絲表面多余的水分后，用無菌包裝袋包裝，即得經(jīng)腐敗菌接種處理過的鮮濕豆絲，每株腐敗菌設(shè)置3個平行實驗組。同時，取無菌水代替菌懸液作為空白對照組（CK）。

1.4.5.4" 致腐能力評價

將所有處理好的樣品放入25 ℃恒溫箱中貯藏72 h，每隔24 h取樣，測定待測樣品的菌落總數(shù)與酸度，以評價7株腐敗細(xì)菌對鮮濕豆絲的致腐能力。

1.4.6" 鮮濕豆絲菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016進行菌落總數(shù)測定。

1.4.7" 鮮濕豆絲酸度測定

參照GB 5009.239—2016中第一法酚酞指示劑法進行酸度測定。

1.4.8" 抑菌實驗

1.4.8.1" 抑菌劑濃度梯度的選擇

根據(jù)GB 2760—2014中的規(guī)定，所選兩種抑菌劑的最大使用限量見表1，將兩種抑菌劑復(fù)配使用，復(fù)配方案見表2，符合食品添加劑復(fù)配原則。將各組添加劑溶于無菌水中，得抑菌劑備用。對照組（CK）使用無菌水取代抑菌劑。

1.4.8.2" 抑菌圈法測定抑菌劑對腐敗菌的抑制效果

采用濾紙片法測定抑菌圈大小。分別取一定量的腐敗菌株加入225 mL無菌生理鹽水中充分搖勻，制得7株供試腐敗菌菌液。吸取1 mL菌液至無菌培養(yǎng)皿中，然后向培養(yǎng)皿中傾注15～20 mL冷卻至50 ℃左右的PCA培養(yǎng)基，混合均勻，水平靜置，凝固后備用。選用質(zhì)地均勻的濾紙，用直徑為10 mm的打孔器將濾紙打成相同大小的圓片，滅菌后備用。

待平板上的水分被瓊脂完全吸收后，吸取45 μL抑菌劑滴加到濾紙片上，將含有抑菌液的濾紙片貼到平板表面，并用鑷子輕壓，使其貼平，不再移動位置。隨后，將上述平板放入4 ℃冰箱中預(yù)擴散2 h，使濾紙片中的抑菌液擴散到培養(yǎng)基中。預(yù)擴散結(jié)束后，將平板取出，待恢復(fù)至室溫后放置于35 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈大小。

1.4.9" 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理及作圖，采用SPSS Statistics 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（Duncan法），采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。顯著差異水平取Plt;0.05。所有數(shù)據(jù)均為3次平行測量的平均值。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

2.1.1" 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

采用平板劃線法分離純化鮮濕豆絲中的腐敗細(xì)菌。從鮮濕豆絲中獲得7種腐敗菌，分別編號為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。對所獲得的7株腐敗菌株的菌落形態(tài)進行觀察鑒定，并進行生理生化特性實驗，結(jié)果見表3。將結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進行對比，初步鑒定X1、X2、X3、X4、X6為芽孢桿菌屬，X5、X7為腸桿菌屬，進一步采用分子生物學(xué)技術(shù)對7株腐敗細(xì)菌進行菌種鑒定。

2.1.2" 分子生物學(xué)鑒定

將篩選得到的7種主要腐敗細(xì)菌進行16S rDNA序列鑒定。從中選取若干個基因序列相似性高的菌株序列，使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

由圖1可知，菌株X1、X2、X3、X6與Bacillus subtilis聚為一支，親緣關(guān)系最近。菌株X4與Bacillus proteolyticus聚為一支，菌株X5與Enterobacter asburiae聚為一支，X7與Enterobacter sp.聚為一支。

將各個菌種的16S rDNA序列在NCBI基因庫中進行同源性比較，結(jié)果見表4。

由表4可知，7株菌種的序列與已知序列的同源性均在99%以上，說明鑒定結(jié)果可靠。結(jié)果顯示，X1、X6為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），X2、X3為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），X4為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），X5為阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae），X7為考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）。

2.2" 腐敗微生物致腐能力測定

分別接種7種腐敗菌的鮮濕豆絲在貯藏期間均出現(xiàn)腐敗氣味，判定7種腐敗菌均有較強的致腐能力，為優(yōu)勢腐敗菌。以菌落總數(shù)與酸度為致腐能力評價指標(biāo)，判斷腐敗菌致腐能力的強弱。

2.2.1" 菌落總數(shù)

微生物的生長繁殖所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是引起鮮濕豆絲腐敗的主要因素之一。菌落總數(shù)的變化是其中最明顯的品質(zhì)指標(biāo)之一。接種7株腐敗菌的鮮濕豆絲在25 ℃條件下貯藏過程中菌落總數(shù)的變化趨勢見圖2。

wet bean shreds inoculated with spoilage bacteria

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，菌落總數(shù)呈上升趨勢。其中接種菌株X2的菌落總數(shù)增長幅度最大，由貯藏0 h時的3.66 lg CFU/g增長到貯藏第72 h時的8.67 lg CFU/g，其次依次是接種X3、X6、X1、X4、X5、X7的樣品。

隨著貯藏時間的延長，不同菌株的生長狀況呈現(xiàn)出一定的差異。實驗組的鮮濕豆絲在0～24 h貯藏期間，菌落總數(shù)上升速率較快，隨后增長速率減緩，這可能是因為貯藏前期營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物大量生長繁殖，而在24 h后，胺類、酸類等代謝產(chǎn)物增多，從而抑制了微生物生長，且可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，微生物數(shù)量達(dá)到相對飽和狀態(tài)，致使增長速率減慢。實驗組初始菌落總數(shù)相差不大，但后期差異較大，這可能是由于不同微生物的生長代謝速度和致腐機制不同，從而造成了菌落總數(shù)的差異，其結(jié)果與7種腐敗菌對鮮濕豆絲酸度影響的結(jié)果大致相同。

2.2.2" 酸度

接種腐敗菌的鮮濕豆絲在25 ℃條件下貯藏過程中酸度變化見圖3。

由圖3可知，接種了不同腐敗菌株的鮮濕豆絲的酸度差異較大，且實驗組的酸度值遠(yuǎn)大于CK組。隨著貯藏時間的延長，所有樣品的酸度均呈上升趨勢，在貯藏0～24 h內(nèi)，酸度上升速率最快，貯藏24 h后，上升速率減緩，在貯藏72 h時達(dá)到最大值。其中接種X2的鮮濕豆絲酸度變化幅度最大，在貯藏72 h時達(dá)最大值2.40 mL/10 g，其次依次為接種X3、X1、X6、X7、X4、X5的樣品。酸度與微生物的生長呈正相關(guān)，這是因為在貯藏期間，微生物生長代謝會產(chǎn)生酸類物質(zhì)，導(dǎo)致鮮濕豆絲的酸度升高。

2.3" 抑菌劑對腐敗菌的抑制作用

于35 ℃培養(yǎng)18 h后，CK組（0% ε-PL+0% CP）濾紙片周圍及與培養(yǎng)基接觸面均未出現(xiàn)抑菌圈。不同濃度抑菌液對7株腐敗菌的抑制作用見圖4。

由圖4可知，抑菌劑對7株腐敗菌均有抑制作用，且使用復(fù)配抑菌劑的抑菌效果優(yōu)于單一抑菌劑。隨著丙酸鈣含量的增大，7株腐敗菌的抑菌圈直徑整體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。復(fù)配抑菌劑濃度為40% ε-PL+60% CP（實驗序號4）時，菌株X1、X3、X2的抑菌圈較大。復(fù)配抑菌劑濃度為20% ε-PL+80% CP（實驗序號5）時，菌株X1、X3、X2、X5的抑菌圈較大，對腐敗菌株的抑制效果較好。ε-PL主要通過破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，造成物質(zhì)外滲，影響蛋白質(zhì)合成等正常生理功能，從而抑制微生物生長。丙酸鈣的作用機制主要是丙酸通過抑制微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活動，使微生物蛋白質(zhì)變性，從而達(dá)到抑制微生物生長的作用。

3" 結(jié)論

采用平板劃線法從腐敗鮮濕豆絲中分離出7株腐敗細(xì)菌，經(jīng)鑒定為4株枯草芽孢桿菌（X1、X2、X3、X6）、1株蘇云金芽孢桿菌（X4）、1株阿氏腸桿菌（X5）、1株考氏科薩克氏菌（X7）。將無菌鮮濕豆絲接種分離出的腐敗菌，以菌落總數(shù)與酸度為檢測指標(biāo)，評價腐敗菌的致腐能力。結(jié)果顯示，接種了腐敗菌的樣品，其菌落總數(shù)與酸度均大于對照組，表明7株腐敗菌均有較強的致腐能力。通過濾紙片法測定抑菌圈大小，研究不同濃度復(fù)配抑菌劑（ε-PL與 CP）對7株腐敗菌的抑菌效果。其中，40% ε-PL+60% CP、20% ε-PL+80% CP兩種抑菌劑對腐敗菌有較好的抑制作用。

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