中國(guó)不同城市家用洗碗機(jī)中微生物多樣性分析

關(guān)鍵詞：洗碗機(jī)，微生物，高通量測(cè)序技術(shù)，多樣性

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.013.043

0引言

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平的提高，國(guó)內(nèi)洗碗機(jī)市場(chǎng)需求明顯增長(zhǎng)。洗碗機(jī)作為方便居民生活的新興家用電器，具有清潔高效、節(jié)能、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，可滿足消費(fèi)者對(duì)健康生活及享受閑暇時(shí)的需求，更加適應(yīng)現(xiàn)代家庭快節(jié)奏的生活，已成為現(xiàn)代化家庭廚房設(shè)計(jì)的標(biāo)配。但在洗碗機(jī)長(zhǎng)期使用過(guò)程中，其潮濕的內(nèi)環(huán)境和密閉的空間，容易發(fā)生餐具和內(nèi)部件的微生物滋生現(xiàn)象。

目前，國(guó)際上已陸續(xù)開(kāi)展了家用洗碗機(jī)內(nèi)部環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)、特征微生物菌株分離及作用機(jī)制研究。Nina等[1]于2011年在歐洲、美洲、非洲等地共采集獲得189個(gè)洗碗機(jī)樣本，通過(guò)平板培養(yǎng)法從62%的樣本中分離獲得了曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Ca nd ida）、Ma g nusiomyce s 、鐮刀菌屬（F u s a r i u m）等微生物，研究發(fā)現(xiàn)皮炎外瓶霉（Exophia la der matitidis）和類(lèi)磚型外瓶霉（Exophiala phaeomuriformis）是洗碗機(jī)中的優(yōu)勢(shì)菌種；于2015年在土耳其收集了937件洗碗機(jī)樣品，并從24.5%的樣品中檢出外屏霉屬（Exophiala）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、Magnusiomyces等微生物[2]；于2019年在斯洛文尼亞采集30臺(tái)洗碗機(jī)樣品，分離獲得632株細(xì)菌，從80%的樣品中均分離獲得蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus），對(duì)洗碗機(jī)橡膠密封條進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)放線菌門(mén)（Actinobacteria）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢(shì)微生物[3]。Brands等[4]人研究發(fā)現(xiàn)洗碗機(jī)的內(nèi)壁表面含菌量少，存儲(chǔ)過(guò)程中腸桿菌科微生物有明顯增加。綜上所述，已有大量國(guó)際研究證明了家用洗碗機(jī)中存在部分潛在風(fēng)險(xiǎn)微生物，因此開(kāi)展洗碗機(jī)內(nèi)環(huán)境微生物多樣性及菌種特性研究對(duì)于相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避和產(chǎn)品質(zhì)量升級(jí)具有重要意義。

我國(guó)目前已經(jīng)發(fā)布了多個(gè)洗碗機(jī)相關(guān)的安全性能、除菌、抗菌等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5-8]，但關(guān)于洗碗機(jī)使用過(guò)程微生物多樣性分析尚缺乏數(shù)據(jù)支持。本研究旨在研究我國(guó)洗碗機(jī)微生物群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和微生物培養(yǎng)技術(shù)，系統(tǒng)解析冬季中國(guó)不同城市家用洗碗機(jī)中微生物多樣性，深度挖掘洗碗機(jī)中極端耐受類(lèi)、致污類(lèi)、致病類(lèi)等特征性微生物資源，為洗碗機(jī)抗菌抑菌試驗(yàn)的開(kāi)展、關(guān)鍵特征微生物作用機(jī)制的研究以及抗菌材料的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

2021年12月至2022年1月，依據(jù)地理位置以及不同地域飲食習(xí)慣差異，選取北京、青島、佛山3個(gè)城市共9臺(tái)洗碗機(jī)（每臺(tái)洗碗機(jī)的使用頻率≥3次/周）作為研究對(duì)象，每臺(tái)洗碗機(jī)設(shè)置3個(gè)采樣位點(diǎn)（包括門(mén)封圈、出水口和提杯），共入戶采集到27個(gè)樣品，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 試劑與儀器

麥芽提取粉瓊脂（MEA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、R2A瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），氯硝胺甘油瓊脂培養(yǎng)基（DG18）（青島海博生物技術(shù)有限公司），0.85%生理鹽水（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），丙三醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），QIAamp Fast DNAStool Mini Kit（德國(guó)QIAGEN公司），真菌DNA提取試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司），磁磁珠組織DNA提取試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司），PCRMasterMix、DL 2000 Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司），PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

生物安全柜（ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2），隔水式培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），微量可調(diào)移液器（德國(guó)Eppendor f公司），洗碗機(jī)（美的集團(tuán)股份有限公司），電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf 公司），生物樣品均質(zhì)器（奧然科技（北京）有限公司），PCR儀（ABI），微量核酸蛋白分析儀（英國(guó)Biochrom有限公司），凝膠成像儀（BIO-RAD Gel DoCqM EZ），高壓滅菌鍋（日本HIR AYAMA），電泳儀（美國(guó)BIO-R AD EC250 -90）。

1.3 可培養(yǎng)分析方法

1.3.1 可培養(yǎng)微生物的分離純化

將洗碗機(jī)樣品原液以10倍梯度逐級(jí)稀釋?zhuān)频?：10的樣品菌懸液。分別吸取樣品原液和稀釋后的菌懸液100 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，每組兩個(gè)平行，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件詳見(jiàn)表2。每天觀察不同條件下的菌落特征（包括大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無(wú)滲透液、有無(wú)可溶性色素等），選取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行平板劃線，純化得到菌株保存于甘油管。記錄不同菌株的菌落特征和數(shù)量。

1.3.2 可培養(yǎng)微生物的菌種鑒定

選取的單菌落通過(guò)平板劃線法進(jìn)行純化，在適宜的培養(yǎng)條件下通過(guò)兩次分離純化獲得純菌種，并通過(guò)MALDI-TOF MS進(jìn)行初步鑒定，通過(guò)甲酸萃取法制備檢測(cè)樣品，挑取培養(yǎng)基上的單菌落，混勻于300 μL ddH2O中，加900 μL無(wú)水乙醇充分振蕩，離心去除上清液，晾干后，用50 μL 70%甲醇重懸細(xì)胞，加50 μL乙腈反復(fù)吹打，將樣品混合均勻；按照MALDI-TOF MS 檢測(cè)規(guī)程進(jìn)行鑒定分析，確定菌株的分類(lèi)學(xué)地位。

對(duì)于MALDI-TOF MS無(wú)鑒定結(jié)果的菌株，提取細(xì)菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16 S rR NA基因通用引物27 F和149 2R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件參數(shù)如下：94℃，5 min，1cycle；94℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1.5 min，30cycles；72℃，10 min，1 cycle。將PCR產(chǎn)物在上海生工生物進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序。將16S rRNA測(cè)序結(jié)果通過(guò)EzBio Cloud服務(wù)器（www.ezbiocloud.net/identify）進(jìn)行相似性搜索，與已發(fā)表的有效模式菌株進(jìn)行比較，確定菌株的分類(lèi)學(xué)地位。對(duì)于真菌菌株，提取真菌菌株的基因組DNA，分別采用（I T SrDNA）、核糖體rDNA大亞基（26S D1 / D2）等分子標(biāo)記引物對(duì)絲狀真菌和酵母菌的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。得到的PCR產(chǎn)物送至生工生物進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作為靶序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與靶序列最相近的參考菌株系列進(jìn)行比較，獲得菌株的分類(lèi)學(xué)地位。

1.4 樣品宏基因組提取和高通量測(cè)序

利用Q I A a m p D N A提取試劑盒，提取洗碗機(jī)樣品種的宏基因組D N A。以質(zhì)檢合格的宏基因組D N A為模板進(jìn)行P C R擴(kuò)增，利用通用引物33 8F（5'-AC T C C TACG G GAG G C AG C A-3'）和8 0 6R（5'-G GACTACH VG G GTWTCTA A T-3'）擴(kuò)增16 S r R NA 基因V3 -V4區(qū)；利用引物I T S1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGT TCT TCATCGATGC-3'）擴(kuò)增ITSrDNA區(qū)。PCR擴(kuò)增體系：5×FastPfu 緩沖液8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L，上、下游引物各2 μL，F(xiàn)astPfu 酶1 μL，DNA 30 ng，ddH2O補(bǔ)足至40 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液中，完成文庫(kù)的構(gòu)建。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)構(gòu)建文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的文庫(kù)利用HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析主要包括測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾、Tag拼接、OTU聚類(lèi)、物種注釋和物種復(fù)雜度分析等流程。利用QIIME 2的DADA2方法對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列、嵌合體并得到Clean Data。使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)Reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags聚類(lèi)為OTU，并采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在界、門(mén)、綱、目、科、屬和種水平統(tǒng)計(jì)分析各樣本的群落組成。利用QIIME2中q2-diversity方法進(jìn)行Alpha多樣性分析，chao指數(shù)、shannon指數(shù)共同表征樣品的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗碗機(jī)樣品中可培養(yǎng)微生物的分離與鑒定

為探究洗碗機(jī)使用過(guò)程中微生物多樣性，在屬水平上統(tǒng)計(jì)洗碗機(jī)分離株種類(lèi)和數(shù)量。本研究從冬季9 臺(tái)洗碗機(jī)的2 7個(gè)樣品中共分離獲得2 45株微生物菌種，其中細(xì)菌148株，涵蓋28個(gè)屬，如圖1（a）所示；真菌共分離獲得9 7株，涵蓋28個(gè)屬，如圖1（b）所示。其中，在屬水平上分離頻次較高的細(xì)菌主要芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、Cytobacillus 、微小桿菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌屬（Priestia）等；分離頻次較高的真菌主要有分離頻次較高的真菌主要有曲霉屬（A spergi l lu s）、青霉屬（Penicillium）、假絲酵母屬（Candida）、鐮刀菌屬（Fusarium）、外瓶霉屬（Exophiala）等。

通過(guò)韋恩圖分析，3個(gè)城市的共有細(xì)菌為5種，如圖2（a）所示。分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動(dòng)桿菌屬（A c i n e t o b a c t e r ）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、普里斯特氏菌屬（Priestia）、類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。芽孢桿菌屬（Bacillus）在洗碗機(jī)門(mén)封圈、下水口等區(qū)域容易富集。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在潮濕的環(huán)境中利于其生長(zhǎng)。在3個(gè)城市中共有真菌為4種，如圖2（b）所示。分別為曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、外瓶霉屬（Exophiala）和鐮刀菌屬（Fusarium）。在洗碗機(jī)樣品中存在大量曲霉，該屬菌株在高濕條件下生長(zhǎng)良好。假絲酵母屬（Candida）在室溫及37℃環(huán)境中均能生長(zhǎng)。

2.2 洗碗機(jī)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

本研究共完成了洗碗機(jī)27個(gè)樣品的16S rRNA基因V 3 -V4區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序，共測(cè)序獲得16 5 5個(gè)OTU。門(mén)水平上，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）是洗碗機(jī)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為68.38%和9.75%，如圖3（a）所示。為了進(jìn)一步明確細(xì)菌群落的物種組成，從屬水平上對(duì)洗碗機(jī)樣品細(xì)菌組成進(jìn)行分析，如圖3（b）所示，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和埃希氏桿菌屬（Escherichia）是洗碗機(jī)樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬，相對(duì)豐度占比均在5%以上，分別為14.59%、10.96%、6.11%。這幾類(lèi)屬在菌種可培養(yǎng)分離中均有分離到，埃希氏桿菌屬（Escherichia）的菌株分離頻次較高。

對(duì)洗碗機(jī)27個(gè)樣品進(jìn)行I T S rDNA序列高通量測(cè)序，共測(cè)序獲得691個(gè)OT U。其中，子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）是洗碗機(jī)樣品中的優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度分別為6 5 .14%和2 6 . 2 0 %，如圖4（a）所示，為了進(jìn)一步明確真菌群落的物種組成，從屬水平上對(duì)洗碗機(jī)樣品真菌組成進(jìn)行分析，如圖4（b）所示，假絲酵母屬（Candida）是洗碗機(jī)樣品優(yōu)勢(shì)真菌菌屬，相對(duì)豐度占比達(dá)到10.14%，枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）相對(duì)豐度占比均在5%以上，分別為8.11%、8.08%、6.05%。其中，假絲酵母屬（Candida）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）均是子囊菌門(mén)（Ascomycota）中的種類(lèi)，在洗碗機(jī)可培養(yǎng)分離過(guò)程中均有分離，也是非培養(yǎng)中豐度較高的菌屬；擔(dān)子菌門(mén)（Bsidiomycota）的絲孢酵母屬（Trichosporon ）和紅酵母屬（Rhodotorula）在大部分洗碗機(jī)樣品中占有相對(duì)較高的豐度，在可培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均有分離。

2.3 洗碗機(jī)樣品中微生物多樣性分析

根據(jù)地理位置和不同的飲食習(xí)慣，本研究選取了北京、青島和佛山3個(gè)具有典型飲食習(xí)慣的城市，以shannon指數(shù)和chao指數(shù)作為代表，探究不同地域?qū)ξ⑸铴炼鄻有灾笖?shù)的影響，詳見(jiàn)圖5。在3個(gè)城市中，青島地區(qū)微生物物種總數(shù)最高，見(jiàn)圖5（a）和5（c），細(xì)菌chao指數(shù)在52～ 4 0 9之間，真菌chao指數(shù)在82～127.6之間，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的微生物物種總數(shù)較低，細(xì)菌c h a o 指數(shù)在4 4.75～ 667.21之間，真菌chao指數(shù)在29～111.6之間，佛山地區(qū)的不同樣品間細(xì)菌物種總數(shù)差異較大；shannon指數(shù)主要反應(yīng)群落的異質(zhì)性，青島地區(qū)的不同樣品間細(xì)菌多樣性差異較大，青島地區(qū)的洗碗機(jī)真菌多樣性最高，北京地區(qū)的不同樣品間真菌多樣性差異較大，見(jiàn)圖5（b）和5（d）。青島地區(qū)的微生物在物種總數(shù)和多樣性上均比其它兩個(gè)城市的高，不同樣品間的物種總數(shù)和多樣性差異較大可能與該地區(qū)所選取三臺(tái)洗碗機(jī)的微生物污染狀況差異較大有關(guān)。

基于OTU的PCA主成分分析，如圖6（a）所示，北京和青島細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，佛山其他兩個(gè)城市具有較大的差異性；如圖6（b）所示，佛山和青島真菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，北京其他兩個(gè)城市具有較大的差異性。不同地域?qū)ο赐霗C(jī)中共有微生物的影響研究發(fā)現(xiàn)，北京、青島和佛山3個(gè)城市注釋到的細(xì)菌OTU數(shù)目分別為750、957和987，共有OTU數(shù)目為328個(gè)，如圖7（a）所示，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和埃希氏桿菌屬（Escherichia）是豐度排名前3位的共有細(xì)菌菌屬，其中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）與可培養(yǎng)分離共有細(xì)菌菌屬一致；北京、青島和佛山3個(gè)城市注釋到的真菌OTU數(shù)目分別為249、416和329，共有真菌OTU數(shù)目為87個(gè)，如圖7（b）所示，其中假絲酵母屬（Candida）、外瓶霉屬（Exophiala）和曲霉屬（Aspergillus）是豐度排名前3位的共有真菌菌屬，與可培養(yǎng)分離共有真菌菌屬基本一致。

2.4 洗碗機(jī)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)影響因素分析

為了進(jìn)一步探究不同地域、不同采樣位置、使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對(duì)樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，選取chao和shannon指數(shù)，采用單因素方差分析，探究影響洗碗機(jī)微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，詳見(jiàn)表3。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，不同采樣位置對(duì)洗碗機(jī)樣品細(xì)菌物種總數(shù)和多樣性具有顯著影響，不同地域?qū)ο赐霗C(jī)樣品真菌物種總數(shù)和多樣性具有顯著影響，使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對(duì)樣品微生物總數(shù)和多樣性均無(wú)顯著影響。

3 討論

根據(jù)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序結(jié)果可知，細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、普里斯特氏菌屬（Priestia）、不動(dòng)桿菌屬（Aci netob a cter）等；真菌主要有曲霉屬（A sp er g i l lu s）、假絲酵母屬（Ca nd id a）、外瓶霉屬（Exophiala）、青霉屬（Penicillium）、Magnusiomyces、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）等。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是自然界分布極為廣泛的一類(lèi)微生物，在廚房環(huán)境中普遍存在，尤其在洗碗機(jī)門(mén)封圈、下水口等區(qū)域容易富集，在不同城市大部分樣品中均分離培養(yǎng)出芽孢桿菌屬的微生物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)芽孢桿菌屬細(xì)菌是無(wú)害的，但有一些對(duì)人和動(dòng)物是有致病性的，該屬的蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，已知蠟樣芽孢桿菌在免疫受損患者中引起菌血癥以及其他癥狀如嘔吐和腹瀉[9]，一些菌株產(chǎn)生不耐熱腸毒素，在食入后10～15 h內(nèi)引起腹瀉。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）廣泛分布于水、空氣、食品之中，具有較強(qiáng)粘附力，能夠形成生物膜，潮濕的環(huán)境利于其生長(zhǎng)[10]，容易在洗碗機(jī)門(mén)封圈與出水口處富集。埃希氏桿菌屬（Escherichia）為人和動(dòng)物腸道中的一種細(xì)菌，大多數(shù)菌株是無(wú)害的，但某些血清型（EPEC、ETEC等）會(huì)在其宿主中引起感染[11]，能夠引起人體或動(dòng)物胃腸道感染，除胃腸道感染以外，還會(huì)引起尿道感染、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及敗血型感染等[12]。曲霉菌屬（Aspergillus）是自然界分布極廣一類(lèi)微生物，在洗碗機(jī)零部件中也存在大量曲霉，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該屬菌是空調(diào)系統(tǒng)積塵主要伴生真菌之一[13]，能夠引起過(guò)敏反應(yīng)并會(huì)導(dǎo)致霉變，在高濕條件下生長(zhǎng)良好。假絲酵母屬（Candida）對(duì)熱的抵抗力不強(qiáng)，加熱至60℃ 1小時(shí)后即可死亡，但對(duì)干燥、日光、紫外線及化學(xué)制劑等抵抗力較強(qiáng)，在室溫及37℃環(huán)境中均能生長(zhǎng)[14]。

洗碗機(jī)樣品中分離到的大部分優(yōu)勢(shì)真菌廣泛分布于自然環(huán)境中，如曲霉屬、青霉屬、枝孢菌屬等；部分洗碗機(jī)樣品中存在條件致病菌，如曲霉屬、青霉屬、假絲酵母屬等；部分洗碗機(jī)樣品中存在抗逆特性菌，如外瓶霉、假絲酵母、Magnusiomyces 等；外瓶霉、Magnusiomyces 是文獻(xiàn)報(bào)道洗碗機(jī)中常見(jiàn)的真菌菌屬[15 ]，在本研究洗碗機(jī)樣品中均有分離到；外瓶霉屬（Exophiala）的菌株分布廣泛，通常從土壤、木材以及一些植物材料上分離得到，且耐高溫（4 ～ 47℃），該屬菌株是文獻(xiàn)報(bào)道洗碗機(jī)中出現(xiàn)頻率最高的黑酵母菌種，洗碗機(jī)橡膠類(lèi)零部件是該類(lèi)菌種的主要聚集地，研究推測(cè)橡膠類(lèi)部件表面粗糙、具有疏水性、釋放芳香烴類(lèi)化合物是該類(lèi)菌種聚集的主要原因[16 -17]。Magnusiomyces 分離自洗碗機(jī)、乳制品、醫(yī)療器械、土壤、水、空氣、植物等環(huán)境，耐高溫（5～47℃），生長(zhǎng)pH范圍（2.5～12），耐高鹽（17% NaCl），可引起肺部感染，口腔感染，血液腫瘤病人敗血癥[18-19]。青霉屬（Penicillium）廣泛存在于空氣、土壤及腐爛的水果、蔬菜、肉類(lèi)中，洗碗機(jī)內(nèi)部高濕的環(huán)境有利于青霉菌的生長(zhǎng)，該屬的種類(lèi)很多，在蔬菜、糧食、肉類(lèi)和食物上常有分布，多呈灰綠色，部分該屬菌株有致病性，引起角膜、皮膚、外耳、呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染和心內(nèi)膜炎，可在嚴(yán)重免疫功能低下患者中引起播散性疾病，許多菌株產(chǎn)生真菌毒素[20]。邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）的菌株可用于發(fā)酵食品釀造，具有耐鹽特性[21]。

4 結(jié)論

（1）本研究基于可培養(yǎng)技術(shù)共分離獲得2 45株微生物菌種，其中細(xì)菌148株，涵蓋28個(gè)屬；真菌共分離獲得97株，涵蓋28個(gè)屬。其中，在屬水平上細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escher ich ia）、纖維芽孢桿菌屬（Cytobacillus）、微小桿菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌屬（Priestia）等；真菌優(yōu)勢(shì)菌屬主要有曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、假絲酵母屬（Candida）、鐮刀菌屬（Fusarium）、外瓶霉屬（Exophiala）等。通過(guò)高通量測(cè)序分析，門(mén)水平上，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）是洗碗機(jī)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門(mén)；子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Bsidiomycota）是洗碗機(jī)樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌菌門(mén)。從屬水平上，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和埃希氏桿菌屬（Escher ichia）是洗碗機(jī)樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬；假絲酵母屬（Ca ndida）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）是非培養(yǎng)中豐度較高的菌屬。

（2）對(duì)洗碗機(jī)樣品中的微生物多樣性分析，在3個(gè)城市中，青島地區(qū)細(xì)菌物種總數(shù)最高，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的細(xì)菌物種總數(shù)較低，佛山地區(qū)的不同樣品間細(xì)菌物種總數(shù)差異較大，青島地區(qū)的不同樣品間細(xì)菌多樣性差異較大；青島地區(qū)真菌物種總數(shù)和多樣性最高，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的真菌物種總數(shù)較低，北京地區(qū)的不同樣品間真菌多樣性差異較大。

（3）對(duì)洗碗機(jī)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)影響因素分析，不同采樣位置對(duì)洗碗機(jī)樣品細(xì)菌物種總數(shù)和多樣性的具有顯著影響，不同地域?qū)ο赐霗C(jī)樣品真菌物種總數(shù)和多樣性具有顯著影響，使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對(duì)樣品微生物總數(shù)和多樣性均無(wú)顯著影響。

（4）對(duì)洗碗機(jī)優(yōu)勢(shì)菌屬特性分析，芽孢桿菌屬（Bacillus）在廚房環(huán)境中普遍存在，在洗碗機(jī)門(mén)封圈、下水口等區(qū)域容易富集，曲霉菌屬（Aspergillus）高濕條件下生長(zhǎng)良好，假絲酵母屬（Candida）對(duì)干燥、日光、紫外線及化學(xué)制劑等抵抗力較強(qiáng)，外瓶霉屬（Exophiala）主要在洗碗機(jī)橡膠類(lèi)零部件區(qū)域聚集，耐高溫，是文獻(xiàn)報(bào)道洗碗機(jī)中出現(xiàn)頻率最高的黑酵母菌種。

作者簡(jiǎn)介

許華，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)橄赐霗C(jī)消殺技術(shù)。

姚粟，通信作者，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物。

（責(zé)任編輯：張佩玉）