酶底物法測定湖泊水中糞大腸菌群的不確定度評(píng)定

摘 要：根據(jù)《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），對(duì)湖泊水中糞大腸菌群的測量不確定度進(jìn)行評(píng)估。按照《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ 1001—2018）要求，對(duì)湖泊水樣進(jìn)行連續(xù)10次重復(fù)測定，分別評(píng)估MPN的不確定度和樣品體積的不確定度。測得水樣糞大腸菌群濃度為5.2×102MPN/L，拓展不確定度為0.15lg（MPN/L）。結(jié)果表明，MPN是影響糞大腸菌群濃度不確定度的主要分量，對(duì)MPN的不確定度評(píng)定需要同時(shí)考慮MPN值的不確定度和重復(fù)測量的不確定度。

關(guān)鍵詞：不確定度；酶底物法；MPN；糞大腸菌群

中圖分類號(hào)：X52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2024）10-154-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.10.035

0 引言

糞大腸菌群主要來源于人和動(dòng)物的糞便，因其能反映水體受糞便污染的程度而被作為環(huán)境指示菌［1］。酶底物法根據(jù)酶原反應(yīng)檢測糞大腸菌群，用最大可能數(shù)法（MPN法）計(jì)算結(jié)果，檢出限低，準(zhǔn)確度高，操作簡便［2］。目前，尚未有文獻(xiàn)系統(tǒng)評(píng)定酶底物法檢測糞大腸菌群的測量不確定度。

測量不確定度不僅是判定基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)精度、檢測水平高低及測量質(zhì)量的一個(gè)重要依據(jù)，也是評(píng)估實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可評(píng)審，均對(duì)實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)估作出了明確規(guī)定［3-4］。

以湖泊表層水為試驗(yàn)材料，按照《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ 1001—2018）、《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），用科立得試劑盒分析糞大腸菌群測定過程中主要的不確定度分量來源，通過計(jì)算合成不確定度和拓展不確定度，建立用酶底物法檢測糞大腸菌群的結(jié)果不確定度評(píng)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：酶底物法試劑（科立得）、無菌取樣瓶（含硫代硫酸鈉）120 mL、97孔定量盤、科立得97孔陽性比色盤、江西省南昌市進(jìn)賢縣軍山湖表層湖水。

儀器：SN310C立式蒸汽滅菌器、9900Z Sealer plus智能程控定量封口機(jī)、BSP-150生化培養(yǎng)箱、YP2102電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種

根據(jù)《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ 1001—2018），由一名操作人員在同一試驗(yàn)環(huán)境下對(duì)水樣重復(fù)測定10次。

1.2.2 培養(yǎng)

將封口的97孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱中，在37 ℃±1 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 結(jié)果判讀

將培養(yǎng)后的97孔定量盤與標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤比較，樣品孔變?yōu)辄S色判斷為糞大腸菌群陽性；記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量，據(jù)此查閱MPN表，得到相應(yīng)MPN值；結(jié)合樣品取樣體積，計(jì)算樣品中糞大腸菌群的含量。

2 不確定度分析

2.1 數(shù)學(xué)模型建立

根據(jù)《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ 1001—2018），樣品中糞大腸菌群濃度C（MPN/L）計(jì)算公式見式（1）。

[C=MPN×1 000v]" " " " " " " " " " " " " " （1）

式中：MPN為每100 mL樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群或大腸埃希氏菌群數(shù)；[v]為接種量，mL。

在使用科立得試劑盒進(jìn)行糞大腸菌檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論采取何種方式傾倒樣品與培養(yǎng)基的混合液，定量瓶中始終存在一定量的液體殘留。因此，在糞大腸菌群濃度的計(jì)算公式中應(yīng)除以實(shí)際加入97孔定量盤的樣品體積[v1]。糞大腸菌群濃度計(jì)算公式見式（2）。

[C=MPN×1 000v1]" " " " " " " " " " " " " "（2）

模型采取重量法間接測量97孔定量盤中的水樣體積，即假定水樣與培養(yǎng)基在定量瓶中經(jīng)充分混勻后才會(huì)進(jìn)行液體轉(zhuǎn)移，此時(shí)溶液中液體（水樣）與可溶性固體（培養(yǎng)基）比例始終等于加入樣品瓶中水樣質(zhì)量[m1]與培養(yǎng)基質(zhì)量[m2]之比。因此，加入97孔定量盤的水樣質(zhì)量[m4]可通過這一比例與混合液質(zhì)量[m3]相乘得到，再除以水樣密度即為水樣體積[v1]，計(jì)算公式見式（3）（[ρ]為水樣密度，取1.000 g/mL）。

[v1=m1×m3（m1+m2）×ρ]" " " " " " " " " " " " "（3）

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型、不確定度分量評(píng)定的可行性、文獻(xiàn)報(bào)道，確定樣品體積、MPN為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的不確定度分量。

3 不確定度評(píng)定

3.1 樣品體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uc（v1）]

天平的拓展不確定度[U]=0.02 g，k=2，則天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uB（m）]為0.01 g。

水樣質(zhì)量、試劑質(zhì)量、樣品培養(yǎng)基混合液質(zhì)量均由減重法獲得，具體數(shù)據(jù)見表1。

水樣質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[um1]計(jì)算公式見式（4）。

[um1=u2m1+2u2Bm=0.129 8 g]" " " "（4）

試劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[um2]計(jì)算公式見式（5）。

[um2=u2m2+2u2Bm=0.019 0 g]" " " "（5）

樣品培養(yǎng)基混合液質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[um3]計(jì)算公式見式（6）。

[um3=u2m3+2u2Bm=0.120 6 g]" " " "（6）

由于[m1]、[m2]、[m3]均由同一臺(tái)天平測得，在計(jì)算[v1]的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)需要考慮[m1]、[m2]、[m3]間的相關(guān)性。加入97孔定量盤樣品體積的合成不確定度平方[u2cv1]、相對(duì)不確定度[ucrelv1]計(jì)算公式分別見式（7）、式（8）。

[u2cv1=?v1?m12u2m1+?v1?m22u2m2+?v1?m32u2m3+2?v1?m1?v1?m2×um1，m2+2?v1?m1?v1?m3×um1，m3+2?v1?m2?v1?m3×um2，m3=0.023 7 mL2]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （7）

[ucrelv1=uv1v1=0.001 6]" " " " " " " " "（8）

3.2 MPN的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[ucMPN]

軍山湖水樣10次糞大腸菌群濃度測定結(jié)果的MPN值及其標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。

MPN值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度包括MPN值自身的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uMPN1]和重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uMPN]。

MPN值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uMPN1]計(jì)算公式見式（9）。

[uMPN1=i=1N=101N2u2MPNi=0.025 5]

[lg（MPN/100 mL）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（9）

MPN值重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[uMPN]計(jì)算公式見式（10）。

[uMPN=sMPNn=0.041 5lg（MPN/100 mL）]" " " nbsp; " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（10）

MPN的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[ucMPN]計(jì)算公式見式（11）。

[ucMPN=u2MPN1+u2MPN=0.048 7]

[lg（MPN/100 mL）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（11）

MPN值的相對(duì)不確定度[ucrelMPN]計(jì)算公式見式（12）。

[ucrelMPN=ucMPNMPN=0.028 4]" " " " " " " " （12）

3.3 糞大腸菌群濃度的合成不確定度[ucC]

糞大腸菌群濃度的合成不確定度[ucC]計(jì)算公式見式（13）。

[ucC=ucrelC×C=u2crelMPN+u2crelv1×C=0.077lg（MPN/L）]" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （13）

3.4 擴(kuò)展不確定度計(jì)算

在95%置信水平下，取k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度，即[U=2ucC=0.15lg（MPN/L）]。

3.5 結(jié)果報(bào)告

樣品中糞大腸菌群濃度檢測結(jié)果為5.2×102 MPN/L，換算成常用對(duì)數(shù)為2.72lg（MPN/L），最終拓展不確定度為（2.72±0.15）lg（MPN/L）（包含因子k=2，置信水平95%）。

4 討論

研究建立了符合《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ 1001—2018）的數(shù)學(xué)模型，可依據(jù)此模型進(jìn)行檢測結(jié)果的測量不確定度評(píng)價(jià)。模型中不確定度分量為樣品體積和MPN。由于樣品量取使用的無菌定量瓶缺少可供參考的不確定度參數(shù)，研究采取重復(fù)測量加入97孔定量盤水樣重量的方法，間接測量水樣體積的A類不確定度。不同于以往研究［5-6］，該模型認(rèn)為MPN的不確定度包括MPN值的不確定度和重復(fù)測量的不確定度。MPN值的不確定度可根據(jù)MPN值給出的95%置信區(qū)間，以B類不確定度評(píng)定方法計(jì)算。

從計(jì)算過程可以發(fā)現(xiàn)，MPN的相對(duì)不確定度遠(yuǎn)大于樣品體積的相對(duì)不確定度，即酶底物法檢測糞大腸菌群濃度的不確定度是由MPN的不確定度決定的。這與微生物檢測的隨機(jī)性及MPN表是基于先驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分布給出檢測量的可能范圍而非一個(gè)確定的值有關(guān)。

MPN不確定度的計(jì)算應(yīng)根據(jù)樣品測量次數(shù)確定。單次測量時(shí)，MPN不確定度即MPN值的不確定度；當(dāng)測量次數(shù)不小于2次時(shí)，MPN不確定度包括MPN值的不確定度和重復(fù)測量的不確定度。當(dāng)測量次數(shù)為2～9次時(shí)，使用極差法計(jì)算重復(fù)測量的不確定度；當(dāng)測量次數(shù)不少于10次時(shí)，使用貝塞爾公式計(jì)算重復(fù)測量的不確定度。

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（欄目編輯：董清芝）