泌尿生殖道支原體感染檢測及藥敏分析進展

毛得斌

【關(guān)鍵詞】 泌尿生殖道；支原體感染檢測；藥敏分析

中圖分類號：R518.5 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.029

近年隨著時代的變遷，泌尿生殖道支原體感染發(fā)病率呈上升趨勢，現(xiàn)已成為臨床上最常見的性傳播疾病之一，其傳播速度快、感染性極強，影響了人們的健康及正常生活狀態(tài)[1]。近年來在治療泌尿生殖支原體感染過程中，由于抗生素的不合理使用，臨床分離株耐藥性日益嚴(yán)重，抗菌藥物治療效果下降，經(jīng)驗用藥治療失敗病例不斷增多。本文從泌尿生殖道支原體感染的檢測和藥敏分析進行綜述如下。

1 泌尿生殖道支原體的概念及其臨床意義

支原體是目前最簡單的原核生物，多以球體的形式存在，體內(nèi)依然有DNA、RNA和蛋白質(zhì)等基礎(chǔ)物質(zhì)。其中在特定環(huán)境下，解脲支原體（Uu）、人型支原體（Mh）以及生殖支原體（Mg）可導(dǎo)致非特異性尿道炎（NGU）、慢性前列腺炎、附睪炎等疾病[2]。其釋放的侵襲性酶和毒性產(chǎn)物有可能成為致病物質(zhì)[3]。此類患者大多年齡在22～55歲，其感染人群更集中在性生活比較活躍的年輕人，也表明了此病在不潔性行為傳播比較頻繁[4，5]。以上表明，泌尿生殖道支原體感染檢測對性病防治及優(yōu)生保健工作有重要的指導(dǎo)意義。

2 泌尿生殖道支原體感染的檢測方法

泌尿生殖系統(tǒng)感染的檢測方法有經(jīng)典的液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法，但隨著微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，像金標(biāo)免疫斑點法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光定量PCR（FQPCR）、連接酶鏈反應(yīng)、熒光核酸恒溫擴增技術(shù)（SAT）、恒溫擴增試紙條技術(shù)（LAMP）、反向斑點雜交技術(shù)（RDB）等新手段讓泌尿生殖道支原體感染的檢測走進了更深的層次。

2.1 液體培養(yǎng)法

作為WHO推薦診斷NGU的首選方法，液體培養(yǎng)法對實驗條件要求不高，而且操作簡便、快捷。其最常應(yīng)用的是鑒定藥敏一體化試劑盒法，目前國內(nèi)很多醫(yī)院的實驗室普遍采用肉湯體液培養(yǎng)法檢測泌尿生殖道感染，以肉湯顏色改變來判斷結(jié)果。其原理是肉湯培養(yǎng)液中含有酚紅指示劑和尿素。泌尿生殖道支原體在生長過程中產(chǎn)生的尿素酶分解尿素或精氨酸產(chǎn)堿時，使培養(yǎng)液堿化而變紅色，再過24～48 h來判讀陽性結(jié)果。由于泌尿生殖道標(biāo)本菌群復(fù)雜，混雜的腸桿菌、真菌（白色念珠菌）及某些葡萄球菌也能分解尿素，如果不能被液體中抑制劑抑制，在其倒置繁殖過程中分解尿素可導(dǎo)致培養(yǎng)液變紅，從而引起檢測的假陽性[6]。有研究發(fā)現(xiàn)即使培養(yǎng)基中加入青霉素以抑制細(xì)菌生長，但隨著細(xì)菌耐藥率的增高，仍有部分耐藥菌在培養(yǎng)液中大量繁殖[7]；此外當(dāng)不產(chǎn)脲酶真菌濃度高時，支原體與真菌混合感染培養(yǎng)液明顯渾濁，可能造成假陰性。因此要提高泌尿生殖支原體檢測的準(zhǔn)確率，降低假陽性率，不僅培養(yǎng)基中抗生素的配制要合理，而且培養(yǎng)液中要選擇有效抑制真菌的抑制劑，控制假陰性的產(chǎn)生。

2.2 固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)法檢出率較低，不能用于藥敏試驗，而且檢測成本相對昂貴。但由于其特異性高，可作為確診的標(biāo)準(zhǔn)。該法能形成“油煎蛋”樣特征菌落和經(jīng)典的棕褐色顆粒菌落，顯示支原體生長。由于固體培養(yǎng)過程中需要CO2，藥敏試驗需要培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)種，導(dǎo)致使用成本高、耗時長，制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。上海同濟大學(xué)程瓊等學(xué)者[8]研制的一種固體培養(yǎng)基中增加血清含量，添加含有多胨等基礎(chǔ)營養(yǎng)成分和0.9%瓊脂，添加促進支原體生長的細(xì)胞培養(yǎng)液（10%DMEM）；除傳統(tǒng)的青霉素外，抑菌劑還添加了非抗生素類抑菌成分；操作中將150 μL（5～6滴）的洗脫液在新型固體培養(yǎng)基上均勻平鋪，標(biāo)記好后置于CO2培養(yǎng)箱中孵育，保持培養(yǎng)箱37℃恒溫，每24 h、48 h各觀察一次，培養(yǎng)48 h后，用低倍鏡進行觀察。周良佳等[9]研究發(fā)現(xiàn)該新型固體培養(yǎng)基的優(yōu)點在于靈敏度高，選擇性強，支原體菌落出現(xiàn)早，檢測限低，微生物診斷的直接證據(jù)是通過顯微鏡觀察支原體特有的菌落形態(tài)，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上新型固體培養(yǎng)基增加血清含量，添加了促進支原體生長的細(xì)胞培養(yǎng)液（10%DMEM），使培養(yǎng)周期縮短。由于支原體菌落較小而無法用肉眼看到，所以需要用顯微鏡等觀測儀器進行觀察，且雜菌具有較高的污染率，有時會影響鏡下觀察效果導(dǎo)致假陰性判斷，因此應(yīng)在防治真菌污染方面做進一步的分析研究。

2.3 金標(biāo)免疫斑點法

又稱為ELISA法或金標(biāo)法，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)來檢測特異性結(jié)合試劑的原理進行支原體檢測。臨床上對Uu常采用金標(biāo)準(zhǔn)方法，用于檢測Uu抗原的金標(biāo)快速檢測試劑盒已經(jīng)商品化，使得Uu感染患者的抗血清抗體能快捷檢測出來，可作為人群支原體感染的醫(yī)療檢測或篩選方法。由于正常人也存在低滴度的抗體水平，根據(jù)抗體測定法，將無法對患者是現(xiàn)癥感染還是既往感染做出有效的判斷，由于目前國內(nèi)檢測支原體抗體試劑都是定性試劑，這就對支原體抗體試劑的定量化檢測有一定的要求。此外，即使患者在接受對癥治療后，血清抗支原體抗體不太可能在短時間內(nèi)消失很多。因此，使用金標(biāo)準(zhǔn)方法復(fù)查治療后患者的治療效果，其結(jié)果多是陽性，可能會對臨床診斷產(chǎn)生誤導(dǎo)。

2.4 PCR

Uu感染中被識別的主要抗原為B（multiple banded）抗原，N端包含血清特異的和交叉反應(yīng)的抗原決定簇[10]。取Uu陽性培養(yǎng)物根據(jù)MB基因序列設(shè)計的引物可進行PCR分型鑒定。由于PCR不受細(xì)菌存活與否的限制，且具有高敏感性及特異性，近幾年來被廣泛用于臨床標(biāo)本Uu的檢測，使那些不能培養(yǎng)或很難培養(yǎng)的微生物也得到快速診斷，但是較難解決混合感染的問題。由于在實驗過程中產(chǎn)物易污染，對實驗條件、試劑及操作人員要求較高。

2.5 FQPCR

該法通過熒光探針直接檢測病原體的特異DNA判斷是否有病原體存在，其靈敏度及特異度高，且快速簡便，該技術(shù)具有熒光技術(shù)和閉管檢測以及自動分析結(jié)果功能，使得PCR擴增產(chǎn)物的污染能定量，具有極高的使用價值。PCR擴增Ct的靶基因主要有MOMP、隱蔽性質(zhì)?；蚝蛂RNA基因三種，隱蔽性質(zhì)?；蛎舾行宰罡摺u的16sRNA、脲酶基因、MB抗原基因為Uu擴增的靶基因[11]。張中華等[12]采用三種方法檢測泌尿生殖道支原體，其中FQPCR法靈敏度高達95.3%，ROC曲線也證實其診斷價值高于另外的兩種檢測方法。實驗研究階段的FQPCR現(xiàn)已進入臨床應(yīng)用階段，逐漸成為臨床快速診斷的重要技術(shù)。

2.6 SAT

該技術(shù)核酸擴增在42℃下進行，直接以病原體特異性RNA為擴增靶標(biāo)，以擴增產(chǎn)物RNA為檢測靶標(biāo)，15～30分鐘即可將模板擴增109倍，其檢測靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于其他核酸檢測技術(shù)，SAT采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶進行核酸擴增，反應(yīng)抑制物有效減少，假陰性結(jié)果也有效下降。擴增產(chǎn)物的污染是核酸檢測的控制難點。SAT采用實時熒光閉管檢測，擴增產(chǎn)物為RNA，其在環(huán)境中易降解，有效控制污染，從而使檢測結(jié)果大幅提高。鄭雅萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在初診、未經(jīng)治療的患者病原體檢測中SAT和FQPCR均可作為判斷病原體感染的方法，且作用相當(dāng)，但FQPCR在治療過程中，不能排除患者治療后病灶處已經(jīng)死亡的病原體殘留的DNA對檢測結(jié)果的影響，而SAT只檢測病原體的RNA，而完整的RNA片段只存在于活的病原體中，因此治療后SAT能有效排除病灶處已經(jīng)死亡的病原體，有利于臨床治療后的療效觀察及愈后判斷，避免過度治療。

2.7 LAMP

該法是基因擴增技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合建立的一種新型的檢測解脲支原體的方法，具有反應(yīng)時間短、特異性強、擴增效率高等優(yōu)點，擴增1～10個拷貝的目的基因能夠在1 h內(nèi)完成，其擴增效率為普通PCR的10～100倍。潘克女等[14]基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)，根據(jù)解脲支原體序列特征設(shè)計對引物進行解脲支原體DNA切口酶核酸恒溫擴增，擴增過程在一對引物中標(biāo)記生物素，隨著擴增的進行生物素直接引入擴增片段中，擴增結(jié)束后產(chǎn)物在密閉裝置中進行免疫試紙條顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色卡的顏色判定結(jié)果的陰陽性。該技術(shù)檢測解脲支原體的靈敏度較實時熒光PCR技術(shù)要高10倍以上，其特異性與實時熒光PCR技術(shù)相當(dāng)。由于該技術(shù)不需要昂貴的特殊儀器，試劑成本低，具有較高的臨床應(yīng)用價值，可在各級醫(yī)院開展。

2.8 RDB

該技術(shù)是利用堿基互補配對原理，特異性探針與擴增的靶基因互補結(jié)合，產(chǎn)生一種雜交信號，該技術(shù)以其高通量、簡便快捷等優(yōu)點在多種病原體的快速檢測中優(yōu)勢明顯[15]。石正琪等[16]利用RDB技術(shù)結(jié)合多重PCR方法可單管擴增并可同時進行多種病原體的檢測，該方法通過GenBank獲取相關(guān)基因序列，并對gD糖蛋白基因和保守序列16SrRNA進行對比，設(shè)計2對通用引物，分別擴增HSV1、HSV2的gD糖蛋白基因和Ng、Ct、Mg的16SrRNA基因。該研究證實通用引物的保守性，結(jié)合寡核苷酸的特異性和減少多病原體DNA擴增中的引物對數(shù)，以達到對病原體的鑒定，同時優(yōu)化雙重PCR和雜交的反應(yīng)條件，使其具有很好的雜交強度和擴增效率，這種方法具有較高的檢出率，能同時檢測多種病原體，在病因?qū)W篩查和性病的快速診斷等方面意義重大。

3 泌尿生殖道支原體感染的藥敏分析

3.1 喹諾酮類藥物的作用機理

由于支原體無細(xì)胞壁，所以β內(nèi)酰胺類抑制細(xì)胞壁合成的抗菌藥對其無效，環(huán)丙沙星、氧氟沙星等是Uu、Mh、Mg耐藥率較高的抗生素，主要是通過抑制脲支原體屬DNA回旋酶來破壞DNA合成，通過干擾脲支原體屬生長而達到抗菌的效果[17]。由于喹諾酮類藥物的濫用，位于支原體屬染色體上的旋轉(zhuǎn)酶基因發(fā)生突變，導(dǎo)致支原體DNA旋轉(zhuǎn)酶靶位發(fā)生改變，從而使喹諾酮類藥物阻斷支原體DNA的復(fù)制能力降低[18]。

3.2 常見抗生素耐藥的原因

由于支原體對影響細(xì)胞蛋白合成的抗生素非常敏感，在臨床上大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)都會選擇一些核蛋白體、抑制或影響菌體蛋白合成的抗生素，如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。有研究證實Uu可以形成生物膜[19～21]，可以改變細(xì)菌表面細(xì)胞膜的通透性，細(xì)菌可以采用各種不同方式阻止抗生素進入細(xì)菌內(nèi)部，這樣抗生素也不能輕易地滲透到細(xì)菌內(nèi)，因此生物膜的形成使Uu對大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類等多種常用抗生素的抵抗力也有所增強。

3.3 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥敏分析

目前，國外性傳播疾?。⊿TD）治療指南推薦大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作為治療Mg陽性男性非淋菌性尿道炎的一線方案[22]，但有研究證實[23，24]，阿奇霉素1 g單劑量療法對Mg感染的清除率僅為67%～84%，這一現(xiàn)象可能反映阿奇霉素誘導(dǎo)Mg對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的出現(xiàn)，也提示了人群中已經(jīng)存在對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的Mg。交沙霉素等類似藥物在人體的胃酸中穩(wěn)定性極差，很容易被分解，人體胃腸反應(yīng)較大，對其使用有一定的局限性。

3.4 半合成四環(huán)素的藥敏分析及作用機理

作為半合成四環(huán)素類抗生素，多西環(huán)素及米諾環(huán)素半衰期長，藥品脂溶性很高，容易滲透很多組織液或體液，能在核糖體水平抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成達到抑菌作用。它是通過阻斷氨?；秃颂呛说鞍左w的合體，并且讓肽鏈的增長以及合成蛋白質(zhì)的速度減慢甚至降至零，從而達到抑制細(xì)菌成長的作用。

3.5 支原體感染首選藥物

國內(nèi)學(xué)者[25，26]研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類及四環(huán)素類抗生素是目前用于泌尿生殖道支原體感染治療的主要藥物，但無論是Uu單一感染還是Uu+MH混合感染，患者對喹諾酮類藥物的敏感性絕大部分都低于40%，藥敏實驗中米諾環(huán)素、交沙霉素、多西環(huán)素對Uu及Mh敏感率較高，其較高的體外抗菌活性，可用于支原體屬感染的首選用藥。

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，泌尿生殖道支原體感染檢測水平不斷發(fā)展。目前各種檢測方法中，液體培養(yǎng)法可作為支原體感染的初篩手段，但需要固體培養(yǎng)法作為確診標(biāo)準(zhǔn)；PCR敏感性高但特異性稍差，易產(chǎn)生假陽性；FQPCR靈敏度及特異度高，但無法同時進行藥敏試驗；SAT、LAMP、RDB具有高通量、快速簡便等特點，是未來快速診斷、鑒定和病因?qū)W篩查的重要檢查方法。目前在治療泌尿生殖道支原體感染藥物中，喹諾酮類藥物敏感性差，已不適合作為經(jīng)驗用藥的選擇，米諾環(huán)素、交沙霉素、多西環(huán)素可作為治療支原體感染的首選藥物。醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)認(rèn)真監(jiān)測泌尿生殖道支原體藥物敏感試驗結(jié)果，分析其耐藥性變化，根據(jù)各地區(qū)耐藥及藥敏情況合理使用敏感抗菌藥物，對減少和防止耐藥菌株的產(chǎn)生和疾病傳播具有重要的意義。

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（收稿日期：2015-07-17 修回日期：2015-10-25）

（編輯：潘明志）