檢測H₂O₂熒光探針的研究進(jìn)展

摘""""" 要：細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性的H₂O₂主要是由細(xì)胞內(nèi)的有氧呼吸中通過線粒體電子傳遞鏈過程所產(chǎn)生的，它不僅在細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中扮演著細(xì)胞毒物的角色，而且還是重要的信使分子。熒光探針法具有靈敏度和選擇性高、響應(yīng)快、操作簡單、生物相容性好、實時成像等優(yōu)點，使用熒光探針檢測與人體許多疾病相關(guān)的內(nèi)源性H₂O₂仍然是一項基本技術(shù)。綜述了小分子熒光探針檢測H₂O₂的研究進(jìn)展。

關(guān)" 鍵" 詞：H₂O₂；線粒體；熒光探針

中圖分類號：O657.3"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號：1004-0935（2024）11-1758-03

H₂O₂是已知的活性氧和氮的前體物質(zhì)，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，是一系列物理化學(xué)過程以及各種疾病（如癌癥和神經(jīng)退行性疾?。┌l(fā)生的關(guān)鍵因素。H₂O₂存在于生物系統(tǒng)中的大多數(shù)氧化過程中。內(nèi)源性H₂O₂作為一種重要的活性氧（ROS），參與細(xì)胞免疫，重塑哺乳動物血管，并充當(dāng)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動的第二信使，包括細(xì)胞增殖、分化和遷移^[1-2]。然而，細(xì)胞中H₂O₂水平異常與許多疾病密切相關(guān)，例如糖尿病、癌癥、心血管疾病^[3]，大量的H₂O₂也可以分別通過髓過氧化物酶和芬頓反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更具毒性的次氯酸和羥基自由基，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

氧化應(yīng)激是由細(xì)胞活性氧（ROS，即H₂O₂）的產(chǎn)生和解毒失衡引起的。H₂O₂是一系列生物過程的副產(chǎn)品。根據(jù)其產(chǎn)生的程度、時間和位置，它在活細(xì)胞內(nèi)具有多種生理和病理作用。由于膜對H₂O₂具有高度滲透性，它可以在隔室之間擴(kuò)散并介導(dǎo)細(xì)胞間的通信。因此，開發(fā)用于檢測和定量測定H₂O₂的方法對于監(jiān)測該物種的體內(nèi)生產(chǎn)和闡明其生物學(xué)功能具有重要意義。目前，檢測H₂O₂的方法有氧化還原滴定法、分光光度法、電化學(xué)方法、色譜法和光譜法^[4]。由于這些方法的樣品制備非常復(fù)雜，無法動態(tài)反映H₂O₂，因此無法有效檢測活細(xì)胞中的H₂O₂。熒光探針法具有靈敏度和選擇性高、響應(yīng)快、操作簡單、生物相容性好、實時成像等優(yōu)點^[5-8]，熒光成像技術(shù)表現(xiàn)出較高的時空分辨率和非侵入性檢測特性，對理解細(xì)胞中活性分子的復(fù)雜化學(xué)和生物過程更有幫助^[9-13]。熒光成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于活體生物體的臨床檢測、分子生物學(xué)研究和小分子傳感。迄今為止，許多熒光探針已成功設(shè)計用于在生物體中檢測H₂O₂。這些熒光探針通常由香豆素、羅丹明、花青和bodipy等小分子發(fā)色團(tuán)衍生物構(gòu)成^[14-17]，在生物學(xué)研究中得到了顯著發(fā)展。

通過對近幾年有關(guān)H₂O₂熒光探針設(shè)計及合成文獻(xiàn)的查閱，綜述了基于不同熒光團(tuán)檢測H₂O₂ 的熒光探針設(shè)計合成和生物應(yīng)用。

1" 基于半菁類H₂O₂熒光探針

穩(wěn)定的半菁熒光團(tuán)不僅表現(xiàn)出近紅外熒光，而且具有近紅外吸收，可以最大限度地減少生物標(biāo)本中的不良背景噪聲，半菁骨架賦予探針出色的線粒體靶向能力，從而能夠靈敏地檢測線粒體H₂O₂ ^[18]?；谏鲜隹紤]，WANG等^[19]將4-硝基-α-酮酰胺基團(tuán)引入半菁中，設(shè)計出NIR-H₂O₂觸發(fā)熒光探針，在H₂O₂的存在下，Mito-H₂O₂反應(yīng)迅速，水溶性好，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。此外，Mito-H₂O₂已成功應(yīng)用于細(xì)胞和小鼠中外源性和內(nèi)源性H₂O₂的成像，細(xì)胞毒性可忽略不計。

ZHANG等^[20]構(gòu)建了一種用于檢測H₂O₂的新型近紅外熒光探針，并成功應(yīng)用于體內(nèi)內(nèi)源性H₂O₂成像。值得注意的是，探針1是通過將4-（溴甲基）苯硼酸頻哪醇酯作為傳感單元連接到IR-780半菁骨架而設(shè)計的，該骨架具有出色的性能，如超過700 nm的NIR熒光發(fā)射。探針 1 對H₂O₂具有令人滿意的靈敏度，檢測限低至 0.14 μmol·l^-1（S/N= 3），這歸因于導(dǎo)致苯硼酸頻哪醇酯氧化從而釋放熒光團(tuán) 2 的反應(yīng)機(jī)制。此外，探針1對H₂O₂表現(xiàn)出優(yōu)于其他物質(zhì)的優(yōu)異選擇性。利用這些特性，探針被證明是細(xì)胞滲透性的。基于N-乙酰半胱氨酸和魚藤酮的結(jié)果，探針1能夠清楚地看到活HepG2細(xì)胞和小鼠中內(nèi)源性產(chǎn)生的H₂O₂。該探針作為一種可靠的化學(xué)工具，其優(yōu)越的性能使其在探索H₂O₂在生物系統(tǒng)中發(fā)揮的作用具有巨大的潛在應(yīng)用前景。

2" 基于萘酰亞胺類H₂O₂熒光探針

萘酰亞胺衍生物是對環(huán)境敏感的獨特?zé)晒饣鶊F(tuán)。這些化合物具有良好的光穩(wěn)定性、較大的斯托克斯位移和高熒光量子產(chǎn)率。硒嗎啉可以以特定的REDOX方式與H₂O₂反應(yīng)。2022年，MA等^[21]設(shè)計合成了一種新的水溶性H₂O₂熒光探針MNG。探針MNG主要由2部分組成，即具有PET機(jī)理的萘酰亞胺衍生物和作為識別基團(tuán)的硒嗎啉。在PBS緩沖液（10 mmol·L^-1、pH=7.4、1%DMSO）中，探針上的硒嗎啉能夠定性和定量檢測H₂O₂。探針遵循硒嗎啉中的Se（Ⅱ）轉(zhuǎn)化為Se（Ⅳ）的機(jī)制，從而改變探針MNG的光譜。值得注意的是，MNG可以連續(xù)檢測H₂O₂和谷胱甘肽（GSH），因此它可以在體內(nèi)實現(xiàn)氧化還原過程成像。此外，該課題通過模擬計算和質(zhì)譜法驗證了高斯09程序中探針連續(xù)氧化還原響應(yīng)的氧化還原過程。研究證明該探針具有很高的生物相容性。此外，它可以檢測MCF-7細(xì)胞和阿根廷血鰭中的H₂O₂。

2021年，ZHOU等^[22]利用芐基硼酸作為H₂O₂反應(yīng)部分（一種眾所周知的H₂O₂反應(yīng)性部分）構(gòu)建了熒光探針NPT- H₂O₂用于H₂O₂的選擇性檢測。在不存在H₂O₂的情況下，它會發(fā)出明亮的藍(lán)光，但在存在H₂O₂時，它會發(fā)射明亮的黃光，從而實現(xiàn)H₂O₂的比率檢測。此外，由于吡啶基團(tuán)是弱堿性的，它可以作為溶酶體靶向基團(tuán)主動靶向溶酶體。相反，NPT-H₂O₂對H₂O₂表現(xiàn)出優(yōu)異的傳感性能：它表現(xiàn)出對H₂O₂的熒光目標(biāo)調(diào)節(jié)比率反應(yīng)；一個很大的斯托克斯位移具有雙阱分辨通道（425、550 nm）；快速響應(yīng)時間（lt;1 min）和對其他分析物的高選擇性。此外，對于在活細(xì)胞中和組織中的H₂O₂熒光成像，由于藍(lán)色通道和黃色通道之間有明顯的比率信號，從而獲得了大的信號背景比，證明了新構(gòu)建的比率探針NPT-H₂O₂成功應(yīng)用于生物系統(tǒng)中H₂O₂的檢測和成像。

3" 基于苯并咪唑類H₂O₂熒光探針

MA等^[23]設(shè)計并合成了基于ICT機(jī)制的熒光探針BBS，探針對H₂O₂的響應(yīng)在464 nm 處顯示出增強(qiáng)的熒光信號，可用于檢測在生理環(huán)境中的H₂O₂。熒光強(qiáng)度與H₂O₂（0～40 μmol·L^-1）濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測限為132 μmol·L^-1。在Gaussian 09程序上，利用紫外-可見光譜、滴定光譜和密度泛函理論對探針BBS的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了驗證和分析。結(jié)果表明，BBS可用于活細(xì)胞的生物成像。MCF-7細(xì)胞成像研究表明，探針BBS具有良好的生物學(xué)適應(yīng)性和通透性，可以高效、準(zhǔn)確地分散在細(xì)胞質(zhì)中，并且BBS可有效檢測內(nèi)源性和外源性H₂O₂。

2022年，TANG等^[24]設(shè)計了一種新型的基于苯并噻唑的熒光化學(xué)傳感器（TZ-BO），該傳感器具有ESIPT發(fā)光機(jī)制，用于檢測H₂O₂作為典型的活性氧（ROS）。該探針分子TZ-BO中的硼酸懸鏈線既是ESIPT的阻斷基團(tuán)，也是H₂O₂的反應(yīng)基團(tuán)。合成的探針TZ-BO具有斯托克斯位移大、靈敏度高、選擇性好、對H₂O₂反應(yīng)速度快等優(yōu)點。研究了該探針通過熒光信號檢測水介質(zhì)中H₂O₂和細(xì)胞中外源H₂O₂的能力。實驗結(jié)果表明，TZ-BO探針在H₂O₂濃度為0～60 μmol·L^-1的良好線性范圍內(nèi)（R²=0.994），能靈敏地檢測H₂O₂，檢測限為1.0×10^-6 mol·L^-1。最重要的是，具有低細(xì)胞毒性的探針TZ-BO可以有效地檢測HeLa細(xì)胞中的外源性H₂O₂。該探針為相關(guān)生理和病理研究中監(jiān)測H₂O₂的真實濃度水平提供了一種很有前途的工具。

4" 結(jié)束語

總結(jié)了幾種基于不同熒光團(tuán)的H₂O₂小分子熒光探針，目前識別H₂O₂的反應(yīng)性有機(jī)小分子熒光探針的研究主要基于苯基硼酸酯的氧化機(jī)理、Baeyer-Villiger氧化重排反應(yīng)和磺酸鹽裂解機(jī)理。有機(jī)小分子熒光探針檢測痕量H₂O₂主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。研究人員對染料基質(zhì)結(jié)構(gòu)和具有優(yōu)異熒光性能的多個活性位點進(jìn)行了修飾，以識別H₂O₂。反應(yīng)機(jī)理影響熒光信號的變化，最終達(dá)到檢測的目的。開發(fā)具有雙重檢測功能的優(yōu)秀熒光探針受到了廣泛關(guān)注。

總之，熒光探針不僅能用于檢測H₂O₂還能檢測其他的活性氧物種，如次氯酸^[25]，探索合成性能優(yōu)異、成本低、靈敏度高、特異性好、反應(yīng)時間短、檢測實時的多功能熒光探針是未來的研究目標(biāo)。

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Research Progress of Fluorescence Probes for Detecting H₂O₂

WANG Chunmei， XIAO Bin， HAN Zhenghao

（Yunnan Normal University， Kunming Yunnan 650500， China）

Abstract：" Endogenous H₂O₂ in cells is mainly produced by the process of mitochondrial electron transfer chain during aerobic respiration in cells. It not only plays the role of cytotoxic agent in oxidative stress in cells， but also is an important messenger molecule.The fluorescence probe method has the advantages of high sensitivity and selectivity， fast response， simple operation， good biocompatibility， and real-time imaging. The use of fluorescence probes to detect endogenous H₂O₂ related to many human diseases is still a basic technology. In this article， the research progress of small molecule fluorescence probes for detecting H₂O₂ was reviewed.

Key words：" H₂O₂; Mitochondrion; Fluorescence probe