海南島越南油茶種質(zhì)CdS-RNase基因及其編碼蛋白的多樣性分析

摘 要：【目的】為了分析海南島本地越南油茶種質(zhì)中CdS-RNase基因及其編碼蛋白的多樣性，探索CdSRNase蛋白類型與越南油茶自交坐果率之間的關(guān)系，為依據(jù)CdS-RNase蛋白類型合理搭配越南油茶田間種質(zhì)和提高越南油茶坐果率，提供科學(xué)參考。【方法】選取60份海南島本地越南油茶種質(zhì)，以其花柱cDNA為模板，RT-RCR特異擴(kuò)增CdS-RNase基因序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測和切膠回收CdS-RNase基因特異性擴(kuò)增條帶，并把特異性擴(kuò)增條帶連接到平末端測序載體上。將測序載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性單克隆，測序得到CdS-RNase基因序列。隨后，60份越南油茶種質(zhì)與“CV1”～“CV18”的CdS-RNase基因序列一起用于基因單體型劃分、單體型聚類分析、獲得CdS-RNase蛋白氨基酸序列、CdSRNase蛋白分型、CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測等。最后，根據(jù)越南油茶種質(zhì)中CdS-RNase蛋白類型，把越南油茶種質(zhì)劃分為三類：類型I，只檢測到正常CdS-RNase蛋白；類型II，同時檢測到正常CdS-RNase和突變CdSm-RNase蛋白；類型III，只檢測到CdSm-RNase蛋白。每類越南油茶種質(zhì)挑選5份，開展自交坐果率統(tǒng)計試驗(yàn)?！窘Y(jié)果】78份海南島本地越南油茶種質(zhì)中共鑒定到171個CdS-RNase基因單體型（Hap1～Hap171），編碼35種正常CdS-RNase蛋白（CdS1-RNase～CdS35-RNase）和22種突變CdSm-RNase蛋白（CdSm1-RNase～CdSm22-RNase）。正常CdS-RNase蛋白和突變CdSm-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋比例差異不顯著，但是突變CdSmRNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的比例極顯著或顯著高于正常CdS-RNase蛋白，無規(guī)則卷曲比例顯著低于正常CdS-RNase蛋白。類型I越南油茶種質(zhì)自交坐果率顯著低于類型II，類型II越南油茶種質(zhì)自交坐果率顯著低于類型III。【結(jié)論】海南島本地越南油茶種質(zhì)CdS-RNase基因及其編碼蛋白多樣性豐富，突變CdSmRNase蛋白可能通過增加其二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的比例減少無規(guī)則卷曲比例影響其蛋白功能的發(fā)揮，突變CdSm-RNase蛋白能一定程度上提高越南油茶自交坐果率。

關(guān)鍵詞：海南島；越南油茶；自交不親和；CdS-RNase基因；CdS-RNase蛋白；多樣性分析

中圖分類號：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）11-0133-13

基金項(xiàng)目：海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（ZDYF2023XDNY026）；海南省“南海新星”科技創(chuàng)新人才平臺項(xiàng)目（NHXXRCXM202334）；海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研項(xiàng)目（HAAS2022KJCX01；HAAS2023RCQD13）；海南省科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目（KJRC2023C24）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32360414）。

Diversity analysis of CdS-RNase genes and their encoding proteins in Camellia drupifera germplasm from Hainan island

REN Jiale1，2， ZHENG Daojun1， YAO Yutong2， LIU Zuqi2， SUN Xiuxiu1， WANG Chunmei1， SHEN Shuaishuai1， CHEN Yeguang1， QI Huasha1， CHEN Jiali1， LIANG Heng1， CHEN Jianmiao2， XIA Tengfei1

（1.a. Institute of Tropical Horticulture Research； b. Sanya Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， Hainan， China； 2.a. School of Tropical Agriculture and Forestry； b. School of Breeding and Multiplication （Sanya Institute of Breeding and Multiplication）， Hainan University， Haikou 570028， Hainan， China）

Abstract：【Objective】The study aimed to investigate the diversities of CdS-RNase genes and their coding proteins in Camellia drupifera germplasm from Hainan island， explore the relationship between CdS-RNase protein types and the self-pollination setting rate of C. drupifera， and provide scientific reference for a rational combination of C. drupifera germplasm in the field conditions based on CdS-RNase protein types and to improve the fruit setting rate of C. drupifera.【Method】Sixty local C. drupifera germplasm from Hainan island were selected， and their style cDNA was used as a template for RT-PCR-specific amplification of the CdS-RNase gene sequence. These CdS-RNase gene sequences were separated and re-purified with agarose gel electrophoresis， and further connected to the blunt sequencing vector. The constructed sequencing vector was transformed into E. coli competent cells and the positive clones were further screened with an LB solid plate with Kanamycin resistance. The resulting positive clones were sequenced to obtain CdSRNase gene sequences. Subsequently， these CdS-RNase gene sequences were analyzed together with that from the “CV1”-“CV18”for gene haplotype classification， haplotype clustering analysis， obtain CdS-RNase protein amino acid sequences， categorize CdSRNase protein types， and prediction of CdS-RNase protein secondary structure. Finally， based on the CdS-RNase protein types， these C. drupifera germplasm from Hainan island can be classified into three categories， including only detecting CdS-RNase protein （type I）， codetecting of CdS-RNase and CdSm-RNase proteins （type II）， and only detecting CdSm-RNase protein （type III）. Germplasms of each 5 of the three types were selected to do experiments of fruit setting percentage of self-pollination.【Result】A total of 171 CdS-RNase gene haplotypes （Hap1-Hap171）， which encoding 35 normal CdS-RNase proteins （CdS1 RNase-CdS35 RNase） and 22 mutant CdSm-RNase proteins （CdSm1 RNase-CdSm22 RNase）， were identified from these 78 C. drupifera germplasms from Hainan island. In the secondary structure CdS-RNase proteins and mutant CdSm-RNase proteins， the ratios of α-helix were not significant difference， the ratios of β-turn and β-sheet were very significantly higher in the mutated CdSm-RNase proteins， the ratio of the coil was significantly lower in the mutated CdSm-RNase proteins. Additionally， the fruit setting percentage of self-pollination in type I germplasm was significantly lower than that of type II germplasm， which was further significantly lower than that of type III germplasm.【Conclusion】The diversity of CdS-RNase gene and its encoding protein is abundant in the local C. drupifera germplasm from the Hainan Island. The increase ratios ofβ-turn and β-sheet and decrease ratio of coil in the mutant CdSm-RNase protein secondary structure probably affect CdS-RNase normal function， which lead to the improve of the self-pollination fruit setting rate of C. drupifera germplasm to some extent.

Keywords： Hainan island； Camellia drupifera； self-incompatibility； CdS-RNase gene； CdS-RNase protein； diversity analysis

油茶是山茶屬（Camellia）中種子含油率高且具有較高經(jīng)濟(jì)價值植物的統(tǒng)稱，系原產(chǎn)于我國的特色食用油料樹種，包括普通油茶（C. oleifera）、小果油茶（C. meiocarpa）和越南油茶（C. drupifera）等60多個物種[1-4]。油茶成熟種仁加工而成的油茶籽油，又被稱為“茶油”“山茶油”“山柚油”，富含油酸和亞油茶等不飽和脂肪酸（90%左右）、生育酚、角鯊烯、茶多酚等多種對人體健康有益的物質(zhì)，長期食用可以減緩心血管疾病的發(fā)生[4-6]。油茶餅泊還是篩選殺線蟲、滅菌、消炎和抗氧化活性物質(zhì)的重要來源[7-8]。近年來，隨著國際局勢的變化，我國越來越重視油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展，國家多部門聯(lián)合印發(fā)了《加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展三年行動方案（2023-2025）年》，對全國油茶種植面積和油茶籽油產(chǎn)能提出了明確要求，油茶產(chǎn)業(yè)迎來了新的發(fā)展機(jī)遇。但是，普遍的低產(chǎn)問題是目前制約我國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“卡脖子”問題。

油茶低產(chǎn)受授粉天氣、傳粉媒介等多種外界因素影響，但自交不親和（self-incompatibility，SI）是導(dǎo)致油茶“千花一果”甚至“千花無果”的內(nèi)在原因。前期研究表明，普通油茶和越南油茶自交不親和類型屬于后期自交不親和類型（Late-acting self-incompatibility，LSI），其自交不親和主要受S位點(diǎn)控制（S-locus），包括緊密連鎖的雌蕊決定因子（S-RNase）和雄蕊決定因子（SLF/SFB，S-locus F-box）[9-12]。目前，在普通油茶和越南油茶中，已經(jīng)鑒定了S位點(diǎn)雌蕊決定因子S-RNase基因[11-12]。在普通油茶中，江南等[11]首先鑒定并在10份普通油茶品種中檢測到了28種CoS-RNase基因單體型（CoS-RNase1～CoS-RNase28），編碼理化性質(zhì)相近的CoS-RNase蛋白，氨基酸數(shù)目均為238。在越南油茶中，Ma等[12]首先鑒定了越南油茶自交不親和雌蕊決定因子CdS-RNase基因，并在18份越南油茶種質(zhì)（“CV1”～“CV18”）中鑒定了28種CdS-RNase蛋白，其中22種CdSRNase蛋白（CdS1-RNase～CdS22-RNase）氨基酸數(shù)目為238，6種CdSm-RNase蛋白（CdSm1-RNase～CdSm6-RNase）氨基酸數(shù)目<238。另外，Ma等[12]鑒定到的含有CdSm-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)自交授粉，一定程度上能提高越南油茶的自交坐果率，既越南油茶自交親和率提高，說明篩選或創(chuàng)制CdS-RNase純合突變體可能獲得自交親和率高或自交親和的越南油茶種質(zhì)。

在中國，越南油茶主要栽培于廣東省、廣西壯族自治區(qū)和海南省，尤其是廣東西南部、廣西南部、海南北部[13-15]。海南島是中國越南油茶分布的最南端，島上越南油茶資源豐富，有研究表明越南油茶可能起源于海南島并由海南島擴(kuò)散到中國大陸[16]。獨(dú)特的熱帶氣候條件，賦予了海南島越南油茶特有的遺傳變異。鑒于海南島越南油茶豐富的遺傳多樣性，有學(xué)者把海南本地越南油茶種質(zhì)資源與海南野生稻資源相媲美。由于海南本地越南油茶基因組大且復(fù)雜，多為八倍體或十倍體[17]，分子研究起步較晚，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)不成熟等因素的限制，海南島本地越南油茶的基因組和分子水平的研究還有待深入。鑒于海南島本地越南油茶豐富的遺傳多樣性，本研究擬在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[12]，在海南島本地越南油茶種質(zhì)資源中深入挖掘CdS-RNase基因的多樣性，從而為解析海南島本地越南油茶種質(zhì)資源中豐富的CdS-RNase蛋白類型提供契機(jī)。海南島本地越南油茶種質(zhì)資源中不同CdS-RNase蛋白類型的鑒定，一方面可以指導(dǎo)不同CdS-RNase蛋白類型的越南油茶種質(zhì)的田間搭配，另一方面挖掘到突變CdSmRNase蛋白類型可以為篩選或創(chuàng)制高自交坐果率越南油茶種質(zhì)資源提供科學(xué)參考。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)材料

海南島本地越南油茶60份種質(zhì)，為2014年12月從海南島油茶主產(chǎn)區(qū)收集的越南油茶農(nóng)家品種。這些越南油茶種質(zhì)種植于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所油茶試驗(yàn)基地（19°51′N，118°38′E）。2021年12月，采集越南油茶含苞待放花蕾中的花柱，每份種質(zhì)取30個花柱，置于干凈離心管中，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 越南油茶花柱cDNA合成

采用RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒（DP452，天根，中國），提取越南花柱總RNA，并進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋后的花柱cDNA，作為模板用于后續(xù)RT-PCR擴(kuò)增CdSRNase基因序列。

1.3 CdS-RNase基因序列的RT-PCR擴(kuò)增和單克隆載體測序

CdS-RNase基因序列RT-PCR擴(kuò)增參考Ma等[12]的方法。瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離目的條帶后，切膠回收純化目的條帶。隨后，將目的條帶連接到pEASY blunt平末端載體上，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，用帶有卡那霉素抗性LB固體培養(yǎng)基篩選陽性單克隆。每個越南油茶種質(zhì)對應(yīng)挑選20個單克隆，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。最后，用Vector NTI 11.5.2（Invitrogen， 美國）軟件拼接和整理基因序列。

1.4 CdS-RNase基因序列的生物信息學(xué)分析

本研究的60份海南島本地越南油茶種質(zhì)和“CV1”～“CV18”[12]一起用于CdS-RNase基因單體型劃分和CdS-RNase蛋白分型?；騿误w型劃分使用DnaSP（version 5.10）軟件，蛋白分型使用DNAMAN（LynnonBiosoft，美國）軟件。普通油茶（CoS-RNase1～CoS-RNase28；ON203968.1～ON203995.1）、茶樹（Cs-SRNase；KU852488.1）、蘋果（MdS-RNase；U12199.1）、扁桃（PdS-RNase；DQ157874.1）、小果咖啡（CaS-RNase；FN547919.1）、棗（ZjS-RNase；MG553633.1）、甜櫻桃（PaS-RNase；AB010305.1）等植物的S-RNase基因序列，下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）?；蛐蛄斜葘途垲悩錁?gòu)建（鄰接法），使用MEGA-X（version 10.2.6）軟件。CdS-RNase蛋白的氨基酸序列預(yù)測、理化性質(zhì)分析、二級結(jié)果預(yù)測，分別使用在線網(wǎng)站NovoPro、ProtParam、SOPMA。CdS-RNase蛋白氨基酸序列中RNase T2蛋白家族兩個保守區(qū)域的標(biāo)注參照江南等[11]。

1.5 含有CdS-RNase蛋白和CdSm-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)自交坐果率統(tǒng)計

根據(jù)CdS-RNase蛋白類型，挑選只檢測到CdS-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)材料（類型I）、同時檢測到CdS-RNase和CdSm-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)材料（類型II）以及只檢測到CdSmRNase蛋白的越南油茶材料（類型III）各5份用于統(tǒng)計自交坐果率。自交坐果率試驗(yàn)，參考Ma等[12]的方法。

1.6 統(tǒng)計分析

在SAS9.4軟件中采用Duncan多重比較法，完成CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)比例和三類越南油茶種質(zhì)自交坐果率平均值的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南島本地越南油茶種質(zhì)CdS-RNase基因單體型劃分和聚類分析

海南島本地越南油茶78份種質(zhì)中，共鑒定CdS-RNase基因單體型171個（Hap1～Hap171），包括117個新發(fā)現(xiàn)的CdS-RNase基因單體型（圖1）。海南島本地越南油茶種質(zhì)“CV1”～“CV18”中[12]，共鑒定到54種CdS-RNase基因單體型，其中13種基因單體型也存在于本研究選擇的60份海南島本地越南油茶種質(zhì)中（圖1）。單個海南島本地越南油茶種質(zhì)中，CdS-RNase基因單體型數(shù)量為1～9種，大部分（88.46%）種質(zhì)中基因單體型數(shù)量< 6種，其中在11份種質(zhì)材料（“10-6”“3-6”“4-3”“5-17”“5-9”“9-12”“Y5-2”“Z3-2”“Z4-2”“Z5-13”和“Z5-24”）中只鑒定到了1種基因單體型。小部分（11.54%）種質(zhì)中鑒定了≥6種基因單體型，其中，“8-2”和“CV13”種質(zhì)中鑒定了8種基因單體型；“CV15”“CV17”和“CV18”種質(zhì)中鑒定了9種基因單體型（表1）。這些結(jié)果表明，海南島本地越南油茶種質(zhì)資源中CdS-RNase基因的變異十分豐富。

海南島本地越南油茶與普通油茶（C. oleifera）、茶樹（C. sinensis）、蘋果（Malus domestica）、扁桃（Prunus dulcis）、小果咖啡（Coffea arabica）、棗（Ziziphus jujuba）和甜櫻桃（Prunus avium）等植物的S-RNase基因序列的聚類分析結(jié)果，能把棗、扁桃、甜櫻桃、蘋果、小果咖啡等木本植物與越南油茶、普通油茶、茶樹等山茶屬植物的S-RNase基因明顯區(qū)分開，說明棗、扁桃、甜櫻桃、蘋果、小果咖啡等植物的S-RNase基因與山茶屬植物S-RNase基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，山茶屬不同植物種間的S-RNase基因親緣關(guān)系較近（圖1）。

2.2 海南島本地越南油茶種質(zhì)CdS-RNase蛋白分析

2.2.1 CdS-RNase蛋白分類和理化性質(zhì)分析

如表2所示，根據(jù)CdS-RNase蛋白氨基酸數(shù)目和氨基酸序列變異，本研究把海南島本地越南油茶種質(zhì)的171個CdS-RNase基因單體型的編碼蛋白，共劃分為57種類型。其中，35種CdSRNase蛋白（CdS1-RNase～CdS35-RNase）的氨基酸數(shù)目是238，21種CdS-RNase蛋白（CdSm1-RNase～CdSm21-RNase）的氨基酸數(shù)目< 238，1種CdS-RNase蛋白（CdSm22-RNase）的氨基酸數(shù)目>238。通常情況下，單個CdS-RNase蛋白對應(yīng)1～5種CdS-RNase基因單體型，但是CdS28-RNase和CdSm9-RNase蛋白對應(yīng)6種CdS-RNase基因單體型，CdS30-RNase蛋白對應(yīng)7種CdS-RNase基因單體型，CdS23-RNase對應(yīng)8種CdS-RNase基因單體型，CdS20-RNase對應(yīng)10種CdS-RNase基因單體型，CdSm10-RNase蛋白對應(yīng)11種CdS-RNase基因單體型。

不同CdS-RNase蛋白類型之間的理化性質(zhì)存在差異，蛋白分子量為25.19～29.00 kDa，不穩(wěn)定指數(shù)為37.37～72.47，脂肪指數(shù)為48.7～101.99，總平均疏水指數(shù)為-0.541～0.145。蛋白分子量最小的是CdSm7-RNase蛋白，氨基酸數(shù)目為216，其等電點(diǎn)（10.62）和脂肪指數(shù)（101.99）最大。蛋白分子量最大的是CdSm22-RNase蛋白，氨基酸數(shù)目為258，其理化性質(zhì)與正常CdS-RNase蛋白類型相似。另外，CdSm10-RNase蛋白氨基酸數(shù)目為223，對應(yīng)了11種CdS-RNase基因單體型，此種蛋白的等電點(diǎn)（10.43）、脂肪酸指數(shù)（101.03）和總平均疏水性（0.145）與正常CdS-RNase蛋白差異較大，尤其是總平均疏水性指標(biāo)為正值。這些結(jié)果表明，海南島本地越南油茶種質(zhì)中CdSRNase蛋白變異豐富，變異會導(dǎo)致該蛋白理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而可能影響其正常生理功能。

2.2.2 正常CdS-RNase蛋白變異位點(diǎn)分析

本研究鑒定的35種正常CdS-RNase蛋白（CdS1-RNase～CdS35-RNase）氨基酸序列變異主要發(fā)生在27個氨基酸位點(diǎn)上，包括兩個發(fā)生在RNase T2蛋白家族保守區(qū)域的變異（位點(diǎn)66和117）（表3）。在這27個氨基酸變異位點(diǎn)中，其中25個位點(diǎn)的氨基酸變異均發(fā)生在兩個固定氨基酸之間，只有位點(diǎn)141（S，N，K）和208（K，E，N）發(fā)生了3種氨基酸之間的變異，說明正常CdS-RNase蛋白的單個氨基酸位點(diǎn)變異相對保守，可能存在固定變異模式。其中，11個位點(diǎn)（15，44，66，71，74，150，171，185，200，202，220）的氨基酸變異只發(fā)生在一種CdS-RNase蛋白中，表明這11個位點(diǎn)可以分別作為標(biāo)志性變異，用于后續(xù)對應(yīng)CdS-RNase蛋白種類的快速分型。

2.2.3 突變CdSm-RNase蛋白變異分析

海南島本地越南油茶種質(zhì)中的22種突變CdSm-RNase蛋白，氨基酸長度為216～258（表2，圖2）。突變CdSm-RNase氨基酸數(shù)目雖然不同，但是大多數(shù)都保留有RNase T2蛋白家族的兩個保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)。只有CdSm7-RNase～CdSm10-RNase等4種突變類型，沒有保留RNase T2蛋白家族的兩個保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)。RNase T2蛋白家族的兩個保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)的缺失很有可能會導(dǎo)致CdSm7-RNase～CdSm10-RNase等4種突變型丟失核糖核酸酶活性，從而不能正常發(fā)揮功能。然而，CdSm7-RNase～CdSm10-RNase等4種突變型能否提高越南油茶的自交親和率，還有待自交坐果率試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2.4 越南油茶種質(zhì)中CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

57種CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，氨基酸序列和氨基酸數(shù)目變化對CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)具有影響（表4）。與35種CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)相比，22種CdSm-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)比例數(shù)據(jù)的變化幅度更大，說明氨基酸數(shù)目的突變更能引起CdS-RNase蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變。

35種正常CdS-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲的比例范圍分別為27.73%～34.18%、2.52%～5.46%、10.92%～14.71%和49.79%～55.88%。α-螺旋占比在CdS14-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最低（27.73%），在CdS14-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最高（34.18%）。β-轉(zhuǎn)角占比在CdS12-RNase和CdS13-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中低至2.52%，而在CdS2-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中的比例高至5.46%。β-折疊比例在CdS3-RNase和CdS28-RNase二級結(jié)構(gòu)中最低（10.92%），在CdS14-RNase和CdS34-RNase二級結(jié)構(gòu)中最高（14.71%）。無規(guī)則卷曲比例在CdS10-RNase和CdS29-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最高（55.88%），而在CdS25-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最低（49.79%）。CdS14-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)具有最低比例的α-螺旋，但是卻具有最高比例的β-折疊。CdS25-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋占比最高但是無規(guī)則卷曲占比最低。22種突變CdSm-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲的構(gòu)成比例范圍分別為16.59%～41.26%、1.79%～6.99%、9.91%～19.05%、39.46%～59.83%。CdSm12-RNase和CdSm16-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)具有最低比例的α-螺旋（16.59%），但卻具有最高比例的β-轉(zhuǎn)角（6.99%）和無規(guī)則卷曲（59.83%）。然而，CdSm10-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最高（41.26%），β-轉(zhuǎn)角（1.79%）和無規(guī)則卷曲（39.46%）占比卻最低。β-轉(zhuǎn)角比例在CdSm17-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最?。?.91%），而在CdSm13-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)中最大（19.05%）。

2.2.5 正常CdS-RNase蛋白和突變CdSm-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

為評估35種正常CdS-RNase蛋白和22種突變CdSm-RNase蛋白二級結(jié)構(gòu)的總體差異，我們對這些蛋白的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲等四種二級結(jié)構(gòu)比例進(jìn)行了統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，35種CdS-RNase蛋白和22種CdSmRNase蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋比例差異不顯著（P>0.05），β-轉(zhuǎn)角的比例差異極顯著（P<0.01），β-折疊和無規(guī)則卷曲的比例差異顯著（P<0.05）（圖3）。CdSm-RNase蛋白的β-轉(zhuǎn)角的比例極顯著高于CdS-RNase蛋白，β-折疊顯著高于CdSRNase蛋白，而無規(guī)則卷曲則顯著低于CdS-RNase蛋白。

2.2.6 突變CdSm-RNase蛋白顯著提高越南油茶自交坐果率

為了評價CdS-RNase蛋白類型對越南油茶坐果率的影響，筆者選取了只檢測到CdS-RNase蛋白（類型I）、同時檢測到CdS-RNase和CdSmRNase蛋白（類型II）、以及只檢測到CdSmRNase蛋白（類型III）的三種類型越南油茶種質(zhì)資源，開展自交坐果率統(tǒng)計試驗(yàn)。所選的三種類型越南油茶種質(zhì)材料及其檢測到的CdS-RNase蛋白類別如下：類型I，“8-1”（CdS28-RNase， CdS32-RNase， CdS33-RNase）、“9-12”（CdS23-RNase）、“9-16”（CdS2-RNase， CdS16-RNase， CdS18-RNase）、“Z3-22”（CdS23-RNase， CdS30-RNase， CdS32-RNase）和“Y6-6”（CdS16-RNase， CdS17-RNase， CdS23-RNase， CdS28-RNase）；類型II，“10-7”（CdSm10-RNase， CdSm11-RNase， CdS20-RNase， CdS30-RNase）、“Z4-13”（CdSm15-RNase， CdSm18-RNase， CdS30-RNase， CdS31-RNase）、“Y2-11”（CdSm1-RNase， CdS18-RNase）、“Y7-1”（CdSm14-RNase， CdS16-RNase， CdS23-RNase， CdS28-RNase， CdS34-RNase）和“Y7-4”（CdSm4-RNase， CdSm7-RNase， CdSm10-RNase， CdS20-RNase）；類型III，“4-3”（CdSm7-RNase）、“5-16”（CdSm7-RNase， CdSm8-RNase）、“Z2-11”（CdSm2-RNase， CdSm20-RNase， CdSm23-RNase）、“Z3-2”（CdSm13-RNase）和“Y5-2”（CdSm9-RNase）（表1～2）。自交坐果率試驗(yàn)結(jié)果表明，類型I的越南油茶種質(zhì)資源自交坐果率最低（0.00%～8.67%，平均值3.87%）、同時類型II的越南油茶種質(zhì)資源自交坐果率較高（6.67%～10.00%，平均值8.27%），類型III的越南油茶種質(zhì)資源自交坐果率最高（8.00%～20.00%，平均值14.8%）（圖4）。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，三種類型的越南油茶種質(zhì)資源自交坐果率平均值之間差異顯著（P < 0.05）（圖4）。說明，突變CdSm-RNase蛋白一定程度上能夠顯著提高越南油茶自交坐果率。只檢測到CdSm7-RNase和CdSm8-RNase的“4-3”（16.00%）和“5-16”（18.67%）自交坐果率高于類型III越南油茶種質(zhì)自交坐果率的平均值，說明發(fā)生在RNase T2蛋白家族保守區(qū)域和活性位點(diǎn)的突變可能在一定程度上能夠提高越南油茶自交坐果率。

3 討 論

自交不親和對保持顯花植物物種多樣性和防止物種退化具有重要意義[18-19]，但是對于以果實(shí)和種子為收獲對象的作物，自交不親和會妨礙這些作物的高產(chǎn)。在研究自交不親和分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，充分利用自交不親和S位點(diǎn)多樣性，挖掘S位點(diǎn)突變體，突破自交不親和帶來的高產(chǎn)限制，對提高這些作物的產(chǎn)量具有積極作用。利用S位多樣性和挖掘S位點(diǎn)突變體，提高梨[20-21]和柑橘[22]的產(chǎn)量已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。這些成功的范例，對我們充分利用海南島本地越南油茶豐富的S位點(diǎn)多樣性和挖掘S位點(diǎn)突變體，用于提高越南油茶產(chǎn)量具有借鑒意義。此前研究表明，越南油茶中不同CdS-RNase蛋白類型種質(zhì)相互授粉坐果率較高，突變CdSm-RNase蛋白一定程度上能夠提高越南油茶自交坐果率[12]。這些結(jié)果，對利用CdS-RNase蛋白和CdSm-RNase蛋白提高越南油茶產(chǎn)量具有重要的參考意義。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，分析了78份海南島本地越南油茶種質(zhì)的CdS-RNase基因單體型及其編碼蛋白類型，新發(fā)現(xiàn)了117個CdS-RNase基因單體型、13種正常CdS-RNase蛋白類型（CdS23-RNase～CdS35-RNase）和16種突變CdSm-RNase蛋白類型（CdSm7-RNase～CdSm22- RNase），另外還發(fā)現(xiàn)CdSm22-RNase蛋白是目前唯一氨基酸數(shù)目大于238的CdSm-RNase蛋白類型，不僅證明了海南島本地越南油茶豐富的遺傳變異，也拓展了對越南油茶CdS-RNase基因及其編碼蛋白多樣性的認(rèn)知。

蛋白的理化性質(zhì)和蛋白的二級結(jié)構(gòu)對蛋白功能的發(fā)揮具有重要的調(diào)節(jié)作用，其中蛋白二級結(jié)構(gòu)是蛋白三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，蛋白二級結(jié)構(gòu)的改變會引起蛋白三級結(jié)構(gòu)和蛋白四級結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致蛋白空間構(gòu)象的改變[23-24]。然而，正確的蛋白三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)和蛋白空間構(gòu)象，是蛋白正常發(fā)揮功能所必需的[25]。本研究發(fā)現(xiàn)22種CdSm-RNase蛋白比35種CdS-RNase蛋白的β-轉(zhuǎn)角和β-折疊比例更高，而無規(guī)則卷曲比例更低，說明該蛋白氨基酸數(shù)目的變化可能主要通過增加蛋白二級結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角和β-折疊比例，減少無規(guī)則卷曲比例影響其蛋白生理功能的正常發(fā)揮。當(dāng)CdSm-RNase蛋白不能正常發(fā)揮CdS-RNase蛋白的生理功能時，就會導(dǎo)致越南油茶自交不親和信號傳導(dǎo)途徑出現(xiàn)障礙，從而一定程度上提高越南油茶的自交坐果率。本研究中3種類型越南油茶種質(zhì)自交坐果率試驗(yàn)結(jié)果，證明了CdSm-RNase蛋白能提高自交坐果率的推論，同時也與Ma等[12]的研究結(jié)論相符。本研究中只檢測到CdSm-RNase蛋白的5份越南油茶種質(zhì)（類型III）自交坐果率平均值顯著高于其他兩類越南油茶種質(zhì)（類型I和類型II）自交坐果率的平均值（圖4），但是類型III越南油茶種質(zhì)的自交坐果率并未達(dá)到完全自交親和的程度。這可能與越南油茶自交不親和控制機(jī)制復(fù)雜，除主要受S位點(diǎn)控制外，還受到其他分子機(jī)制的調(diào)控相關(guān)[11]，也可能是受越南油茶種質(zhì)較高的倍性影響，挑選20個單克隆并未完全鑒定這些越南油茶種質(zhì)的所有CdS-RNase蛋白類型。另外，4種CdSm-RNase突變（CdSm7-RNase～CdSm10-RNase）中存在RNase T2蛋白家族兩個保守區(qū)域和活性位點(diǎn)的缺失的情況，且只檢測到CdSm7-RNase和CdSm8-RNase蛋白類型的兩份越南油茶種質(zhì)（“4-3”和“5-16”）自交坐果率高于類型III中越南油茶自交坐果率的平均值，說明RNase T2蛋白家族保守區(qū)域和活性位點(diǎn)可能在越南油茶自交不親和調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究首次報道了只檢測到CdSm-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)（類別III），其自交坐果率達(dá)到了14.85%，約是只檢測到CdS-RNase蛋白越南油茶種質(zhì)（類型I）的3.87倍，是同時檢測到CdS-RNase和CdSm-RNase蛋白越南油茶種質(zhì)（類別II）自交坐果率的1.79倍，說明通過篩選CdSmRNase蛋白可以找到自交坐果率較高的越南油茶種質(zhì)。這些自交親和率較高的CdSm-RNase越南油茶種質(zhì)是研究越南油茶自交不親和分子機(jī)制的寶貴材料，也可用于高自交親和率越南油茶品種培育

鑒于當(dāng)前越南油茶的自交不親和性，選擇不同CdS-RNase蛋白的越南油茶種質(zhì)相互授粉，可以顯著提高越南油茶的坐果率，從而促進(jìn)越南油茶產(chǎn)量的增加[12]。本研究對越南油茶種質(zhì)資源自交不親和雌蕊決定因子CdS-RNase基因及其編碼蛋白多樣性的分析，可為將來越南油茶田間選擇含有不同CdS-RNase蛋白類型的越南油茶種質(zhì)相互搭配提供科學(xué)參考，通過提高越南油茶的田間坐果率，促進(jìn)越南油茶的增產(chǎn)增收。雖然受越南油茶基因組復(fù)雜、缺乏越南油茶遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、越南油茶童期漫長等客觀因素的限制，越南油茶自交親和率高或自交親和新種質(zhì)篩選與創(chuàng)制也是道阻且長，但是隨著越南油茶研究的不斷深入、生物技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速進(jìn)步以及越南油茶育種工作者持續(xù)的努力，筆者相信在充分挖掘CdSm-RNase突變體的基礎(chǔ)上，揭示越南油茶自交不親和分子機(jī)制、篩選或創(chuàng)制自交親和率高或完全自交親和的越南油茶新種質(zhì)終將成為現(xiàn)實(shí)。

4 結(jié) 論

海南島本地越南油茶種質(zhì)CdS-RNase基因及其編碼蛋白的多樣性十分豐富，CdS-RNase蛋白可分為正常CdS-RNase蛋白和突變CdSm-RNase蛋白兩大類。突變CdSm-RNase蛋白可能通過增加二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的比例減少無規(guī)則卷曲的比例影響蛋白功能的正常發(fā)揮。突變CdSmRNase蛋白能夠一定程度上提高越南油茶自交坐果率。CdS-RNase蛋白類型的劃分有助于指導(dǎo)合理搭配越南油茶田間組合提高雜交坐果率。突變CdSm-RNase蛋白突變體是創(chuàng)制高自交坐果率越南油茶種質(zhì)的寶貴資源，也是將來系統(tǒng)解析越南油茶自交不親和分子機(jī)制的寶貴科研材料。

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[本文編校：吳 毅]