中藥對(duì)皮膚淺部真菌抑菌試驗(yàn)及活性檢測(cè)方法的應(yīng)用進(jìn)展

[摘 要] 中醫(yī)藥作為我國(guó)民族特色的瑰寶，在抑制真菌生長(zhǎng)、殺滅病菌方面發(fā)揮著重要作用。具有對(duì)抗皮膚淺部真菌作用的中藥有數(shù)百種，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取不同的中醫(yī)藥抑菌試驗(yàn)方法，以及對(duì)其真菌活性的檢測(cè)已經(jīng)成為臨床研究的高頻熱點(diǎn)。本文通過收集、整理、分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，系統(tǒng)歸納常用的中藥抑菌試驗(yàn)方法以及活性檢測(cè)方法，以期為中醫(yī)藥抑菌方法的選擇提供新思路。

[關(guān)鍵詞] 中藥；皮膚淺部真菌；抑菌試驗(yàn)；活性檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1004-4949（2024）11-0180-04

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（編號(hào)：QZYY-2023-036）

Application Progress of Bacteriostatic Test and Activity Detection Method of Traditional Chinese Medicine on Superficial Fungi in Skin

DENG Ji-qing1，2， WU Ran3， YUAN Fang-cao1， TANG Shan-shan1

（1.The First Clinical Medical College， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， Guizhou， China； 2.Bijie Medical College， Bijie 551700， Guizhou， China； 3.Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， Guizhou， China）

[Abstract] As a treasure of Chinese national characteristics， traditional Chinese medicine plays an important role in inhibiting the growth of fungi and killing bacteria. There are hundreds of traditional Chinese medicines that have the effect of anti-skin superficial fungi. According to different experimental purposes， different antibacterial test methods of traditional Chinese medicine are selected， and the detection of its fungal activity has become a high-frequency hot spot in clinical research. By collecting， sorting and analyzing relevant literatures at home and abroad， this paper systematically summarizes the commonly used antibacterial test methods and activity detection methods of traditional Chinese medicine， in order to provide new ideas for the selection of antibacterial methods of traditional Chinese medicine.

[Key words] Traditional Chinese medicine； Superficial fungi in skin； Bacteriostatic test； Activity detection

中醫(yī)藥是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶貴經(jīng)驗(yàn)傳承，究其藥用源流，至今已歷經(jīng)千載。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的今日，許多中草藥的抑菌抗炎效果經(jīng)過現(xiàn)代臨床藥理學(xué)都得到了驗(yàn)證，研究證實(shí)中草藥具有抑菌譜廣、毒副作用小、作用機(jī)制多、不易產(chǎn)生耐藥性等特性[1]。故研究中醫(yī)藥的抑菌性能，通過不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇合理的試驗(yàn)方法，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行科學(xué)的評(píng)判具有重要意義。

1 抑菌試驗(yàn)方法的應(yīng)用

1.1 體外抑菌敏感實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1紙片法 紙片法也被稱作紙片擴(kuò)散法、抑菌圈法，是將含有抑菌藥物的濾紙片粘貼在已吸收所測(cè)試菌種的瓊脂上，通過觀察紙片中藥物的擴(kuò)散范圍，測(cè)量抑菌圈的大小來確定藥物敏感性。紙片法目前被公認(rèn)為是一種權(quán)威的用藥指導(dǎo)依據(jù)，但由于該方法只能定性，因此紙片法通常被用來做藥物敏感性試驗(yàn)，且該方法的缺點(diǎn)是試驗(yàn)結(jié)果易受多因素影響，如培養(yǎng)基的質(zhì)量與厚度、藥物擴(kuò)散程度、接種菌量及菌活力、孵育培養(yǎng)條件等。Orbán-Gyapai O等[2]通過該法對(duì)分離蓼科植物的化合物進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明，當(dāng)中萘類化合物對(duì)葡球菌、毛癬菌等幾種菌群具有顯著的抑制作用。

1.1.2牛津杯法 牛津杯法又稱管碟法，是指向已滅菌的牛津杯中注入特定劑量的檢測(cè)品，通過培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌圈大小的一種檢測(cè)手段。在目前中醫(yī)藥抑菌研究方面，該法可作為篩選抑菌中草藥的常用試驗(yàn)方法。該法的缺點(diǎn)在于由于待測(cè)樣的抑菌效果不同，因此抑菌圈的大小也會(huì)不同，如檢測(cè)目標(biāo)為濃度過高的中藥，擴(kuò)散時(shí)容易產(chǎn)生不均勻播散，故顯示的抑菌圈則出現(xiàn)不規(guī)則表現(xiàn)。彭璐等[3]通過牛津杯法，觀察到百藥煎比生五倍子抑菌圈更大，結(jié)果具有顯著性差異，表明百藥煎的抗菌效果比生五倍子更強(qiáng)。

1.1.3微量二倍稀釋法 在抑菌實(shí)驗(yàn)中，為了評(píng)判某種藥物的抗菌功效，最低抑菌濃度（MIC）是非常重要的指標(biāo)，利用二倍稀釋法可以得到MIC值。該法相比以往的其它稀釋法，其優(yōu)點(diǎn)在于不僅所需的培養(yǎng)量及菌量都較少，而且可以在同一觀測(cè)平板上同時(shí)觀測(cè)多種藥物濃度對(duì)所選真菌的抑制情況。如于芯宜等[4]采用二倍稀釋法研究丁香、薰衣草、桉葉、香茅、肉豆蔻5種精油的體外抑菌活性，結(jié)果顯示該5種精油抑菌MIC活性從大到小依次為桉葉=香茅>薰衣草=肉豆蔻>丁香。目前，微量二倍稀釋法是篩選中草藥抑菌最常用的方法。

1.1.4 Etest法 Etest法是一種基于紙片擴(kuò)散法與MIC檢測(cè)相結(jié)合的方法，該方法結(jié)合了紙片擴(kuò)散法操作方便、結(jié)果易讀取及可直接獲得MIC值的優(yōu)勢(shì)。相比常規(guī)的藥敏試驗(yàn)，Etest法的結(jié)果更加準(zhǔn)確，因?yàn)樵摲梢蕴峁┻B續(xù)的抗生素濃度梯度，且Etest法的操作更加簡(jiǎn)單。張麗等[5]通過Etest方法與微量肉湯稀釋法進(jìn)行對(duì)比，通過試驗(yàn)得出Etest法在中藥抑菌藥物敏感性評(píng)價(jià)中優(yōu)于傳統(tǒng)微量肉湯稀釋法。

1.1.5自動(dòng)化藥敏檢測(cè)系統(tǒng) 自動(dòng)化藥敏檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以迅速、精準(zhǔn)地確定微生物對(duì)抗生素的敏感性，該系統(tǒng)可以自動(dòng)化執(zhí)行測(cè)試，從而減少了人工操作的錯(cuò)誤和變異性。然而，該系統(tǒng)價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作和維護(hù)，因此該方法在常規(guī)體外抑菌試驗(yàn)中選用較少。

1.1.6平皿法 平皿法主要有打孔、挖溝法。打孔法是指用已滅菌的打孔工具在試驗(yàn)平板上打孔、培養(yǎng)，觀察測(cè)定抑菌圈大小的一種方法。與其他抑菌試驗(yàn)方法相比，打孔法操作簡(jiǎn)單、快捷，得出的抑菌圈質(zhì)量高，可多次復(fù)制。缺點(diǎn)是在打孔時(shí)，如果用力不當(dāng)，會(huì)破壞孔的規(guī)則感，導(dǎo)致抑菌圈形狀不一。挖溝法是在瓊脂平皿中間挖1條溝，加入待測(cè)藥液后再劃一條垂直藥溝的接種線，每個(gè)平皿可同時(shí)檢測(cè)同一菌種，該法可同時(shí)試驗(yàn)多種菌種，且操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果可能受到人為因素的影響。例如，挖溝的深度和寬度可能會(huì)影響結(jié)果。該法可篩選不同中藥成分的抑菌活性，而在具體抑菌實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于難溶于液體中的中草藥一般選用該方法。

1.1.7菌落計(jì)數(shù)法 菌落計(jì)數(shù)法是一種統(tǒng)計(jì)菌含量的有效方法，常用于如抑菌制劑、生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。其原理是適當(dāng)稀釋待測(cè)菌液，使菌液中菌落充分散成單個(gè)細(xì)胞形態(tài)，隨后取一定含量的菌樣液均勻涂布在培養(yǎng)基上，可觀察到菌液中每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)活菌。這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。缺點(diǎn)是過程較繁，而且常受多種因素的影響。田瑩等[6]通過菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡觀察計(jì)數(shù)兩種傳統(tǒng)方法與實(shí)時(shí)生物氣溶膠監(jiān)測(cè)技術(shù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上方法均具有較好的一致性。

1.1.8比濁法 比濁法主要通過藥液濁度來觀察藥物對(duì)所測(cè)菌群的抑菌敏感性，鄧書武等[7]通過研究金花茶葉水提物不同極性部位對(duì)白色念珠菌等的體外抑菌效果，經(jīng)過多次的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)測(cè)定的濃度太濃，透光率低，不好肉眼觀察，而如果測(cè)定的濃度太稀又檢測(cè)不出抑菌效果，故測(cè)試濃度的高低會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn) 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)最主要的試驗(yàn)方法，是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，和體外抑菌試驗(yàn)相比更接近生理情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能更直接表示出抑菌程度及對(duì)機(jī)體的實(shí)際影響，結(jié)果更具有說服力。但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要事先制備，術(shù)后還需護(hù)理，待動(dòng)物恢復(fù)健康后才能開展，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，工作量較大，因而在選用上受到一定限制。該方法的缺點(diǎn)是難以建立完全統(tǒng)一的動(dòng)物模型，由于不同機(jī)體免疫情況不同，可能導(dǎo)致同一染菌量呈現(xiàn)出不同的致病效果[8]。朱怡萱等[9]通過正交試驗(yàn)篩選出組方最佳配比，通過馬腺疫小鼠模型體內(nèi)抑菌試驗(yàn)篩選加味組方，成功優(yōu)選出1種對(duì)馬鏈球菌馬亞種具有良好抑菌、組織保護(hù)作用的中藥組方。體內(nèi)抑菌試驗(yàn)除了動(dòng)物體內(nèi)抑菌試驗(yàn)以外，其替代方法有很多，例如體外細(xì)胞培養(yǎng)[10]、計(jì)算機(jī)模擬[11]等。這些方法雖然不能完全取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但可以在一定程度上減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)量，降低動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的傷害。

2 真菌活性檢測(cè)方法

2.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 真菌在抑菌試驗(yàn)后的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法通常選用直接鏡檢，而鏡檢又包含光學(xué)顯微鏡檢測(cè)、掃描電鏡檢測(cè)與投射電鏡下檢測(cè)等，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能獲得大視野的全貌信息，掃描電鏡則能獲取較高分辨率的真菌表面結(jié)構(gòu)信息，而透射電鏡則可以分析生物微結(jié)構(gòu)以獲取高分辨率的真菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。林琳等[12]利用掃描電子顯微鏡可觀察到白色念珠菌的表面結(jié)構(gòu)，如經(jīng)過鵝掌瘋醋劑處理的菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)粗糙、皺縮、萎陷、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏，而光學(xué)顯微鏡組只能觀測(cè)用藥前后菌絲密度有無變化。因此，掃描、透射電鏡的作用是可以對(duì)中藥抗真菌的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

2.2 分子實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA的方法，它可以將極微量的目標(biāo)DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)。其應(yīng)用于真菌活性檢測(cè)方面是通過分子層面，分析中藥活性成分最主要是通過某些關(guān)鍵的基因表達(dá)來達(dá)到抑制真菌的作用機(jī)制[13]。

2.2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） PCR技術(shù)除了應(yīng)用于真菌等病原體的鑒定中，還適用于基因靶點(diǎn)測(cè)定與分析。該法簡(jiǎn)便、快捷、成本低、穩(wěn)定性好、結(jié)果可靠，適合在今后的檢測(cè)中常規(guī)使用，所用試劑和儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)低廉，特異性敏感性高。該法的主要缺點(diǎn)是需要大量的DNA樣本。于冰[14]等研究中藥活性成分丁香酚在真菌性角膜炎治療中的作用和機(jī)制，并采用PCR測(cè)定小鼠角膜中IL-1β、TNF-α的逆轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）RT-PCR是第二代PCR方法，該法能夠定量樣本中的DNA分子數(shù)量，從而定量病原體[15]。梁妍[16]通過RT-PCR測(cè)定吳茱萸堿抑菌活性以及該中藥成分抗麥角甾醇生物合成途徑機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了吳茱萸堿在影響麥角甾醇合成途徑通路上的一些重要基因表達(dá)。

2.2.3數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（dPCR） 數(shù)字PCR（dPCR）被稱作第三代PCR技術(shù)，是因其對(duì)比常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)PCR而言，具有定量、樣品量低、高敏等優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是通量不高、操作復(fù)雜，同時(shí)成本大大增加。Alikian M等[17]研究表明，在慢性粒細(xì)胞白血病患者的檢測(cè)中，定量分析結(jié)果可靠性高、重復(fù)性好。

相對(duì)于RT-PCR需要加入特異性的熒光分子探針，PCR-RFLP需要特異酶切處理，常規(guī)PCR所用試劑和儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)低廉，特異性敏感性高，是一種較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的檢測(cè)方法。

3 基因組學(xué)檢測(cè)（高通量測(cè)序）

高通量測(cè)序技術(shù)又稱為深度測(cè)序技術(shù)，具有通量高、讀長(zhǎng)相對(duì)較短、單位數(shù)據(jù)成本極低等優(yōu)點(diǎn)。該項(xiàng)技術(shù)在真菌作用機(jī)制、耐藥基因演化分析、高頻變異基因檢測(cè)方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。黃彬彬等[18]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析25例特應(yīng)性皮炎患者皮膚菌群樣本，證實(shí)特應(yīng)性皮炎患者皮損處真菌多樣性高于非皮損處以及正常人，進(jìn)一步佐證由馬拉色菌屬誘導(dǎo)的AD會(huì)產(chǎn)生多種免疫原性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會(huì)引發(fā)特異性IgE抗體的產(chǎn)生，并可能誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致AD形成的可能機(jī)制。段妍等[19]通過高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)中藥合劑可以下調(diào)Pdrlp和Pdr3q這兩種基因的表達(dá)，該兩種轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)耐藥性的作用，通過上調(diào)破壞真菌細(xì)胞膜和細(xì)胞核的相關(guān)基因的表達(dá)[20]。

4 總結(jié)

在選用不同的抑菌試驗(yàn)及真菌活性檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)通過自身的試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。進(jìn)行中藥藥敏測(cè)試，可以選擇紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、微量二倍稀釋法、Etest法及自動(dòng)藥敏檢測(cè)系統(tǒng)等方法。因紙片擴(kuò)散法易受多因素影響，選用含揮發(fā)油成分的中藥檢測(cè)，就不宜選用紙片擴(kuò)散法，應(yīng)選用平皿法及菌落計(jì)數(shù)法等，以免有效成分丟失。試驗(yàn)對(duì)象為較高濃度中藥時(shí)則不宜采取牛津杯法，但可以選用比濁法。Etest法則兼?zhèn)湟志亩ㄐ耘c定量分析，故此在中藥抑菌測(cè)定中，可優(yōu)先考慮該法。如要篩選具有抑菌功效的試驗(yàn)方法，微量二倍稀釋法仍是首選。若需觀察中藥的抑菌效果，則可以選用平皿法、菌落計(jì)數(shù)法、比濁法等，但比濁法主要用于中藥水、醇提取物等液體濃度來進(jìn)行觀測(cè)。如觀測(cè)中藥對(duì)機(jī)體抑菌程度的實(shí)際影響則可選用動(dòng)物造模試驗(yàn)。此外，想更進(jìn)一步檢測(cè)真菌在中藥處理后的微生物狀態(tài)、分子形態(tài)、表面及內(nèi)部構(gòu)造以及中藥對(duì)真菌的作用機(jī)制、基因靶點(diǎn)等分析，可以選用形態(tài)學(xué)檢測(cè)、分子實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、基因組學(xué)檢測(cè)（高通量測(cè)序）等手段，從而實(shí)現(xiàn)一個(gè)較為完整的研究過程。

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收稿日期：2024-4-9 編輯：吳含