攜帶人表皮生長因子受體適配體的RNA納米顆粒對于結(jié)腸腫瘤細胞增殖及凋亡水平的影響

【摘要】目的 探究攜帶人表皮生長因子受體（EGFR）的RNA納米顆粒作為新型藥物遞送囊泡搭載紫杉醇，對于結(jié)腸腫瘤細胞的增殖及凋亡水平的影響，以為臨床治療結(jié)腸腫瘤提供參考。方法 將人結(jié)腸癌HCT116細胞系細胞按照處理的方式不同分為3個組別，分別為A組（單純紫杉醇干預(yù)，干預(yù)濃度60 ng/mL）、B組（包裹紫杉醇的RNA納米顆粒干預(yù)）及C組（包裹紫杉醇并搭載EGFR的RNA納米顆粒干預(yù)），每組約2×104個細胞，直接在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的干預(yù)藥物，3組的培養(yǎng)時間均為24 h。通過流式細胞儀及共聚焦顯微鏡檢測Alexa647偶聯(lián)的搭載EGFR適配體的三接頭RNA（EGFRapt-3WJ）納米顆粒在結(jié)腸細胞系HCT116中的EGFR靶向能力；采用CCK8法檢測RNA納米顆粒搭載紫杉醇治療后結(jié)腸腫瘤細胞的增殖水平；采用流式細胞儀檢測結(jié)腸癌細胞的凋亡水平；采用蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（BCL-2）及B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）表達水平。結(jié)果 共聚焦顯微鏡結(jié)果證實，攜帶了EGFR抗體的AF647標記三接頭RNA（3WJ-EGFRapt-AF647）納米顆粒對于結(jié)腸癌細胞系HCT116具有出色的特異性靶向能力；C組細胞吸光度值（OD）值低于A、B組，且A組低于B組；C組細胞的細胞凋亡率均高于A、B組，且A組高于B組；C組細胞BCL-2蛋白表達水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達水平高于A、B組，且A組高于B組（均Plt;0.05）。結(jié)論 攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒具備靶向遞送紫杉醇的特點，顯著抑制了結(jié)腸癌細胞的增殖能力，并能促進細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤 ; RNA納米顆粒 ; 紫杉醇 ; 表皮生長因子受體 ; B淋巴細胞瘤-2基因 ; B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白

【中圖分類號】R735.3+5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.24.0032.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.24.010

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)出排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體質(zhì)量減輕等全身癥狀，該病是全球第3大常見癌癥，是全球主要致死癌癥之一[1]。目前化療依舊是結(jié)腸癌治療術(shù)后最常用的治療方案之一。紫杉醇是結(jié)腸癌化療方案的核心用藥，可以有效提高患者的生存率并延長生存期，但其水溶性差，且有一定的肝腎損害、神經(jīng)毒性等，給其臨床應(yīng)用帶來了一定的阻礙[2]。RNA納米顆粒作為藥物遞送系統(tǒng)的一個新興領(lǐng)域，將紫杉醇搭載于RNA納米顆粒中，其價值在于能夠提高其水溶性和生物利用度，然而單純的納米顆粒載體因其缺乏靶向性在治療中依舊表現(xiàn)不佳[3]。表皮生長因子受體（EGFR）是普遍存在于結(jié)腸癌細胞表面的抗體，因此本研究在RNA納米顆粒載體表面添加EGFR的適配體，能夠顯著增加結(jié)腸癌細胞對搭載紫杉醇RNA納米顆粒的內(nèi)吞，有望增強其結(jié)腸癌細胞靶向性，起到很好抗結(jié)腸癌細胞分裂、增殖的作用，同時降低對正常組織的毒性，減少不良反應(yīng)[4]。因此，本研究旨在探索攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒作為新型藥物遞送囊泡搭載紫杉醇，驗證其對結(jié)腸癌細胞的靶向能力及增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 人結(jié)腸癌HCT116細胞系（廈門逸漠生物科技有限公司）。紫杉醇注射液（海南紫杉園制藥有限公司，國藥準字H20066558，規(guī)格：5 mL∶30 mg），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸平衡鹽溶液（Gibco），胰酶（Merck），凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），基質(zhì)膠（武漢賽維爾生物科技有限公司），聚乙二醇生物素（Alexa Fluor-647）（Thermo Fisher Scientific），B淋巴細胞瘤-2基因（BCL-2）、B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）及β-肌動蛋白（β-actin）（Abcam）等。流式細胞儀（Becton Dickinson And Company，型號：FACSCanto），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（（Thermo Fisher Scientific），型號：Heracell 150i），Multi-Chemiluminescence成像系統(tǒng)（天能科學(xué)有限公司，型號：Tanon 5200），共聚焦顯微鏡（Olympus，型號：fv 3000），倒置熒光顯微鏡（Olympus，型號：CKX53）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中充入5% CO2。細胞鋪滿細胞瓶以后胰酶消化后傳代，本實驗取2～3代的結(jié)腸癌細胞進行后續(xù)的實驗。

1.2.2 細胞處理 細胞按照處理的方式不同分為3個組別：A組（單純紫杉醇干預(yù)，紫杉醇濃度為60 ng/mL）、B組（包裹紫杉醇的RNA顆粒干預(yù)）及C組（包裹紫杉醇并搭載EGFR的RNA顆粒干預(yù)），每組約2×104個細胞，直接在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的干預(yù)藥物，3組的培養(yǎng)時間均為24 h。具體的包裝搭載方法可見1.2.3及1.2.4。

1.2.3 納米顆粒的設(shè)計與制備 委托微納生物醫(yī)藥（廣州）有限公司成功構(gòu)建并合成了2'F-修飾的3WJ納米顆粒及其相匹配的2'F-修飾RNA寡核苷酸鏈。具體而言，搭載EGFR適配體的三接頭RNA（3WJ-EGFRapt）納米顆粒集成了兩大功能模塊，即Alexa Fluor-647熒光標記與針對EGFR的特異性RNA適配體（EGFRapt）。對照組則采用不含EGFRapt靶向模塊的3WJ納米顆粒，其中小寫字母標識的核苷酸均經(jīng)過2'F-修飾。為確保RNA寡核苷酸在納米顆粒組裝前的純度超過95%，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對其進行純化。

RNA納米顆粒的組裝過程如下：首先，在1x三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）緩沖溶液[包含50 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），pH值7.5；50 mM氯化鈉（NaCl）；1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）]中，將等摩爾比的單個RNA寡核苷酸混合均勻；然后，將溶液加熱至90 ℃并保持5 min，隨后逐步冷卻至4 ℃并維持90 min。最后，利用含有89 mM Tris-硼酸和2 mM EDTA的TBE緩沖溶液的8%原生PAGE凝膠，對RNA納米顆粒進行分離。

1.2.4 含PTX的RNA納米顆粒的設(shè)計與構(gòu)建 如前1.2.3中所述，在紫杉醇分子中引入一個炔基，同時在RNA寡核苷酸鏈的特定位置引入一個疊氮基，以此形成一個穩(wěn)定的三唑環(huán)結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)紫杉醇分子與RNA納米顆粒的寡核苷酸鏈的牢固連接。

1.2.5 共聚焦顯微鏡觀察細胞顆粒結(jié)合情況 結(jié)腸癌細胞（約2×104個）在24孔板玻璃載玻片上生長，并置于培養(yǎng)基中。16 h后，向培養(yǎng)基中加入3WJ-EGFRapt-AF647或3WJ-AF647納米顆粒，37 ℃孵育4 h。再用Alexa Fluor 488凝集素和DAPI染色細胞骨架和細胞核。至少3次獨立實驗，并用共聚焦顯微鏡觀察評估細胞結(jié)合情況。

1.2.6 CCK8檢測 采用CCK8試劑盒檢測藥物細胞毒性。干預(yù)后的3組結(jié)腸癌細胞以40%濃度接種到96孔板，在含5% CO2、濕度50%的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，處理培養(yǎng)48 h。加入CCK8染料溶液，37 ℃孵育2 h，用Synergy 4讀數(shù)器記錄450 nm吸光度值（OD），計算細胞活力。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平 干預(yù)后的3組結(jié)腸癌細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min后，以磷酸鹽緩沖液重懸清洗細胞，再度1 000 r/min、5 min離心后，棄上清，加入膜外磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白V（Annexin V）和丙碘胺（PI）染色15 min避光染色。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)兩次獨立操作。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測基因表達水平 結(jié)腸癌細胞在3個不同的方式干預(yù)后分別于RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑中4 ℃裂解30 min。裂解液在高速離心機10 000 r/min，4 ℃下離心5 min。蛋白上清液在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上印跡，AzureSpot PRO成像軟件進行密度分析。以β-actin為對照組，計算凋亡相關(guān)蛋白BCL-2及Bax蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7數(shù)據(jù)分析繪圖軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組樣本之間比較采用單因素?方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗?。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別的細胞靶向和內(nèi)化 共聚焦顯微鏡觀察納米顆粒進入細胞內(nèi)部過程，見圖1。A和E為DAPI標記細胞核、B和F為Phil-488標記細胞骨架、C和G為納米顆粒標記，D和H為混合圖，EGFRapt-偶聯(lián)的RNA納米顆粒被內(nèi)吞，見圖H；隨后以EGFRapt為靶點將PTX運送至癌細胞中，見圖H。這表明EGFRapt-3WJ納米顆粒能有效地靶向HCT116細胞進行結(jié)合。

2.2 3組細胞OD值比較 C組細胞OD值均低于A、B組，且A組低于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表1、圖2。

2.3 3組腫瘤細胞凋亡水平比較 C組細胞的細胞凋亡率均高于A組和B組，且A組高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2、圖3。

2.4 3組細胞BCL-2、Bax蛋白相對表達水平比較 Bax蛋白的上調(diào)和Bcl-2蛋白的下調(diào)共同促進細胞凋亡的進程，蛋白免疫印跡法的實驗結(jié)果表明，C組細胞BCL-2蛋白表達水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達水平均高于A、B組，且A組高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表3、圖4。

3 討論

紫杉醇作為抗腫瘤藥物，通過穩(wěn)定微管抑制細胞分裂，從而阻止癌細胞的增殖，常用于結(jié)腸癌的治療中，尤其是與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可提高療效，延長生存期并提高生活質(zhì)量[5]。紫杉醇作為一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物，屬于細胞微管抑制劑，通過促進微管蛋白二聚體的組合并阻止其解聚，達到穩(wěn)定微管的作用，從而抑制了對于分裂間期和有絲分裂期細胞功能至關(guān)重要的微管的正常動態(tài)重組，將細胞周期阻斷于G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲Ｖ梗璧K腫瘤細胞復(fù)制，使癌細胞無法繼續(xù)分裂而死亡。紫杉醇在臨床治療結(jié)腸癌上效果顯著，但存在顯著缺點，紫杉醇溶解度低，是技術(shù)難題，影響其體內(nèi)吸收、分布及代謝[6]。因此，需搭載特殊的溶劑或載體給藥，增加治療的靶向性和有效性。因此，本研究團隊經(jīng)過精心設(shè)計并成功構(gòu)建了一種獨特的3WJ納米顆粒，這種納米顆粒巧妙地融合了Alexa Fluor-647熒光成像技術(shù)模塊。納米顆粒作為藥物載體本身往往缺乏足夠的靶向性，因此需要針對特定的靶細胞進行修飾，通過添加特定的靶向配體來提高其靶向能力[7]。EGFR是一種與結(jié)腸癌密切相關(guān)的受體，它廣泛表達于細胞表面，在結(jié)腸癌細胞中常常出現(xiàn)過度表達或擴增現(xiàn)象，這與疾病的產(chǎn)生、發(fā)展及預(yù)后不良有著緊密的關(guān)聯(lián)[8]。本研究通過共聚焦顯微鏡的觀測發(fā)現(xiàn)搭載了EGFR的RNA納米粒子對HCT116細胞系顯示出比單純的RNA粒子更強的靶向性。這表明搭載了EGFR適配體的RNA粒子確實具備了卓越的結(jié)腸癌細胞靶向能力，這一發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的相關(guān)研究結(jié)果相一致[9]。這為未來的靶向治療提供了新的可能性和研究方向。

OD值可用來衡量細胞凋亡情況。本研究中，C組細胞OD值低于A、B組，且A組低于B組，這表明RNA納米顆粒載體并沒有增強紫杉醇的治療效果，而搭載EGFR的納米顆粒更能促進細胞凋亡。搭載EGFR的納米顆粒增強了紫杉醇對結(jié)腸癌細胞增殖水平的抑制作用，并且促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。然而未搭載EGFR的納米顆粒表現(xiàn)卻更差，這表明相較于游離紫杉醇，單純納米顆粒的搭載因其缺乏靶向性，無法有效地轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞中，導(dǎo)致紫杉醇在細胞內(nèi)的積累減少[10]。因此，盡管紫杉醇本身具有較強的抗腫瘤活性，但在本研究中，其單獨使用納米顆粒時對結(jié)腸癌細胞的抑制作用并不理想，這進一步強調(diào)了靶向藥物載體在提高治療效果方面的重要性。

增殖和凋亡是調(diào)控結(jié)腸癌進展的關(guān)鍵細胞功能，也是紫杉醇治療癌細胞效果相關(guān)的重要評估指標之一。BCL-2和Bax分別為抑制凋亡和促進凋亡的蛋白，在多數(shù)腫瘤中，BCL-2表達水平升高，而Bax表達下降，下調(diào)BCL-2和上調(diào)Bax則能在促進結(jié)腸癌腫瘤的凋亡[11]。本研究結(jié)果表明，C組細胞BCL-2蛋白表達水平均低于A、B組，且A組低于B組，Bax蛋白表達水平高于A、B組，且A組高于B組，這表明RNA納米顆粒載體并沒有增強紫杉醇的治療效果，而搭載EGFR的納米顆粒更能促進細胞凋亡。分析其原因為，RNA納米顆粒的作用主要是增強紫杉醇的水溶性；也存在單純的RNA顆粒并不能有效增強紫杉醇效應(yīng)的結(jié)果，研究者們推斷這是由于其較差的靶向作用及較強的水溶性[12]。EGFR在多種腫瘤細胞表面過度表達，因此可以作為藥物遞送的靶點，本研究利用RNA納米顆粒作為載體，將EGFR作為分子靶向劑標記于納米粒子表面，從而達到結(jié)腸癌細胞靶向識別治療的目的，將紫杉醇直接運送到表達EGFR的結(jié)腸癌細胞。通過這種方式，紫杉醇能夠更集中地作用于癌細胞，提高治療效率并減少對正常細胞的毒性[13]。本研究表明，攜帶EGFR的RNA納米顆粒搭載紫杉醇治療結(jié)腸癌是一種靶向治療策略，這種治療策略旨在提高藥物的靶向性，減輕不良反應(yīng)，從而改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

綜上，攜帶EGFR適配體的RNA納米顆粒具備靶向遞送紫杉醇的特點，顯著抑制了紫杉醇對于結(jié)腸癌細胞的增殖能力，促進其凋亡能促進細胞凋亡，有望為未來的腫瘤治療提供一種新的策略。作為一種針對結(jié)腸腫瘤細胞的靶向藥物遞送系統(tǒng)，未來還需進一步將其應(yīng)用于體內(nèi)，以探究其在靶向治療方面的實際應(yīng)用能力。

參考文獻

徐夢圓， 單天昊， 曾紅梅. 2020年全球結(jié)腸癌和直腸癌發(fā)病死亡分析[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2023， 34（1）： 12-16.

賈俊婷， 柴麗敏， 郝志英. 重組高密度脂蛋白 - 紫杉醇對結(jié)腸癌的靶向性研究[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2019， 39（2）： 161-164.

韋晶， 韓希思， 張承武， 等. 微小RNA納米遞送體系的構(gòu)建及其研究進展[J]. 材料導(dǎo)報， 2019， 33（1）： 16-26.

褚冰， 丁敏， 易瓊. 抗EGFR單克隆抗體偶聯(lián)載紫杉醇納米粒對胃癌腫瘤靶向性能力研究[J]. 貴州醫(yī)藥， 2016， 40（6）： 563-566.

王康康， 汪秀梅， 張茂華， 等. miR-203過表達對結(jié)腸癌HT-29細胞紫杉醇化療敏感性的影響及可能機制[J]. 中華實用診斷與治療雜志， 2021， 35（3）： 220-225.

陳炳辰. 紫杉醇棕櫚酸酯納米給藥系統(tǒng)的構(gòu)建及抗結(jié)直腸癌作用研究[D]. 上海： 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)， 2021.

尹菊萍. 共載紫杉醇和伊立替康前藥的靶向納米粒用于聯(lián)合治療結(jié)腸癌的研究[D]. 南昌： 南昌大學(xué)， 2022.

李美玲， 張光英. miR-133和EGFR在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究， 2020， 37（8）： 1213-1215， 1219.

臧子葉， 張瑤芝， 趙一航， 等. 中藥抗腫瘤明星分子無載體和有載體超分子納米體系研究進展[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 2024， 59（4）： 908-917.

趙航， 趙啟明， 王蒙. 以葉酸為靶向分子擔(dān)載紫杉醇納米顆粒對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中國實驗診斷學(xué)， 2020， 24（6）： 1002-1005.

朱濤， 馬艷竹， 程艷婷， 等. 麥粒灸對荷瘤小鼠腫瘤組織中Bax和Bcl-2表達的影響[J]. 針灸臨床雜志， 2022， 38（11）： 62-67.

段振東， 張欣欣， 陳紅宇， 等. 靶向表皮生長因子受體的百秋李醇納米顆粒抑制非小細胞肺癌裸鼠皮下移植瘤生長的作用及機制[J]. 上海中醫(yī)藥雜志， 2024， 58（6）： 65-72.

張小雨，吳送姑，徐暉，等.多配基組合修飾提升抗腫瘤納米藥物功效的研究進展[J].藥學(xué)學(xué)報， 2024， 59（07）： 1942-1951.