B、T淋巴細胞弱化因子和T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3在肺腺癌中的表達與腫瘤免疫逃逸的臨床意義

【摘要】目的 探討B(tài)、T淋巴細胞弱化因子（BTLA）和T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）在肺腺癌中的表達情況，并分析其與腫瘤免疫逃逸的相關性，為今后臨床治療肺腺癌提供新思路。方法 回顧性分析2018年1月至2023年12月廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院（廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院）收治的58例肺腺癌患者的臨床資料，取術后腫瘤組織樣本，將其作為腫瘤組織組；另收集同期58例肺炎患者，取肺炎性組織樣本，將其作為肺炎性組織組。比較兩組組織中BTLA、TIM-3表達情況；分析BTLA、TIM-3表達與肺腺癌臨床病理特征的關系；比較手術前后肺腺癌患者外周血T淋巴細胞亞群水平，并分析BTLA、TIM-3表達與術后T淋巴細胞亞群水平的相關性。結果 與肺炎性組織相比，肺腺癌腫瘤組織中BTLA和TIM-3陽性表達率均更高；BTLA陽性表達患者中TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于BTLA陰性表達患者；TIM-3陽性表達患者中低分化及TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于TIM-3陰性表達患者；與術前比，術后7d患者外周血CD4+水平、CD4+/CD8+比值均升高，而CD8+水平降低（均Plt;0.05）。斯皮爾曼相關系數分析結果顯示，BTLA和TIM-3陽性表達率均與術后7 d外周血CD3+、CD4+水平呈負相關，而與外周血CD8+水平呈正相關（均Plt;0.05），BTLA和TIM-3陽性表達率與CD4+/CD8+比值的相關性無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05）。結論 BTLA和TIM-3在肺腺癌中高表達，且BTLA和TIM-3陽性表達率均與術后7 d外周血CD3+、CD4+水平呈負相關，與術后7 d外周血CD8+水平呈正相關，BTLA與TIM-3有望成為監(jiān)測肺腺癌腫瘤免疫逃逸的臨床指標。

【關鍵詞】肺腺癌 ; 腫瘤免疫逃逸 ; B、T淋巴細胞弱化因子 ; T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3 ; T淋巴細胞亞群

【中圖分類號】R734.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.24.0017.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.24.006

肺癌是全球范圍內發(fā)病率和死亡率均居于首位的惡性腫瘤，肺腺癌是肺癌最為常見的類型，約占肺癌總數的45%，肺腺癌發(fā)病隱匿，初期癥狀不明顯，約60%的患者在首次確診時已處于晚期，無法通過手術切除病灶[1]。盡管當前在腫瘤的靶向、免疫治療方面取得了諸多進展，但肺腺癌的預后效果仍欠佳，可能與復雜的免疫微環(huán)境有關。B、T淋巴弱化因子（BTLA）和T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（TIM-3）作為兩種新興的免疫檢查點分子，近年來在腫瘤免疫領域受到了廣泛關注。BTLA是CD28家族的成員，主要在B淋巴細胞和T淋巴細胞中表達，迄今為止，其唯一已知的配體是皰疹病毒入侵介質[2]。TIM-3屬于T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白（TIM）基因家族，主要表達于分化的輔助性T淋巴細胞1（Th1）和細胞毒性T細胞1（Tc1）細胞上，具有多種配體，如磷脂酰絲氨酸、半乳凝素-9、高遷移率族蛋白B-1等[3]。BTLA和TIM-3通過與配體結合，均可抑制T淋巴細胞的活化和增殖，進而減弱抗腫瘤免疫反應，形成了腫瘤免疫逃逸，腫瘤免疫逃逸是腫瘤生長、侵襲、轉移及復發(fā)的重要機制，會顯著縮短肺腺癌患者的生存期，降低生活質量[4]。鑒于此，本研究主要分析BTLA和TIM-3在肺腺癌中的表達情況及其與腫瘤免疫逃逸的關系，旨在為肺腺癌的免疫治療提供新的靶點和治療策略，以改善患者預后，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年1月至2023年12月

廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院（廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院）收治的58例肺腺癌患者的臨床資料，取術后腫瘤組織樣本，將其作為腫瘤組織組。另收集同期58例肺炎患者，取肺炎性組織樣本，將其作為肺炎性組織組。納入標準：⑴肺腺癌符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[5]中肺腺癌的診斷標準，肺炎符合《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》[6]中肺炎的診斷標準；⑵樣本質量良好；⑶臨床資料完整。排除標準：⑴合并其他類型的肺癌；⑵合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；⑶合并嚴重感染性疾病和免疫性疾病；⑷樣本采集前接受過免疫治療。本研究經廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院（廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院）醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 BTLA和TIM-3蛋白表達檢測 采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶法檢測肺臟組織BTLA和TIM-3蛋白表達情況。首先，使用組織切片機（德國徠卡儀器有限公司，型號：Leica RM2235）將包埋好的蠟塊切成4～6 mm厚的切片，常規(guī)方法將切片進行脫蠟水化、抗原修復及去除內源性過氧化物酶活性處理。隨后，分別滴加濃度為1∶100的BTLA兔抗人多克隆抗體和TIM-3兔抗人多克隆抗體（福州市邁新生物技術開發(fā)有限公司），置于濕盒中，室溫孵育120 min后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，3 min/次。繼續(xù)滴加二抗（福州市邁新生物技術開發(fā)有限公司），室溫孵化30 min后，用PBS沖洗3次，3 min/次；繼續(xù)滴加鏈霉菌抗生物素蛋白 - 過氧化物酶復合物，室溫孵化30 min后，用PBS沖洗3次，3 min/次；然后，滴加二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑，根據顯微鏡觀察控制顯色時間，大致在3～8 min，顯色結束后，用自來水沖洗切片以終止反應。最后，用蘇木精對切片復染，脫水、透明操作后，中性樹膠封片。

由兩名病理科醫(yī)生共同判定結果。于400倍顯微鏡下觀察切片染色結果，以腫瘤細胞細胞質和/或細胞膜出現定位明確的染色明顯的棕黃色或棕褐色顆粒狀沉積物為陽性。以染色強度和陽性細胞占比進行半定量分析，染色強度評分：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞數占比評分：隨機讀取10個高倍視野，lt;1%計0分，1%～30%計1分，31%～70%計2分，71%～100%計3分。將兩項評分相加，0分為陰性，1～2分為弱陽性；3～4分為中陽性；5～6分為強陽性，陽性率=弱陽性率+中陽性率+強陽性率[7]。

1.2.2 T淋巴細胞亞群檢測 在清晨空腹狀態(tài)下，常規(guī)采集患者術前、術后7 d肘靜脈血5 mL，置于含有肝素的一次性真空采血管中備用。使用紅細胞裂解液分離外周血單個核細胞（PBMC），PBS洗滌后重懸制成PBMC懸液。采用細胞免疫芯片技術（試劑盒購自上海匯中公司）檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+水平，并計算CD4+/CD8+比值。

1.3 觀察指標 ⑴比較腫瘤組織組與肺炎性組織組中BTLA、TIM-3的陽性表達率。⑵分析BTLA、TIM-3表達情況與肺腺癌患者臨床特征的關系。收集肺腺癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、T分期[8]（T1～T2、T3～T4）、淋巴結轉移情況、分化程度（高/中分化、低分化）、TNM分期[8]（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）。⑶比較術前和術后7 d肺腺癌患者外周血CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值。⑷相關性分析。采用斯皮爾曼相關系數分析肺腺癌患者BTLA、TIM-3的表達情況與術后7 d患者外周血CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件分析數據，計數資料以[例（%）]表示，組間比較行χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗；計量資料均使用S-W法檢驗證實服從正態(tài)分布，以（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t檢驗，手術前后比較采用配對t檢驗；采用斯皮爾曼相關系數法分析肺腺癌組織BTLA、TIM-3表達情況與術后7 d T淋巴細胞亞群水平的相關性。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織組與肺炎性組織組BTLA和TIM-3陽性表達情況 與肺炎性組織組比，腫瘤組織組中BTLA、TIM-3蛋白陽性表達率均更高，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2 BTLA和TIM-3表達情況與肺腺癌患者臨床病理特征的關系 BTLA陽性表達患者中TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于BTLA陰性表達患者；TIM-3陽性表達患者中低分化及TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于TIM-3陰性表達患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 肺腺癌患者手術前后T淋巴細胞亞群水平比較 與術前比，術后7 d患者外周血CD4+水平及CD4+/CD8+比值均升高，而外周血CD8+水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），術前、術后7 d患者外周血CD3+水平變化，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表3。

2.4 BTLA和TIM-3陽性表達率與術后T淋巴細胞亞群表達相關性 斯皮爾曼相關系數分析結果顯示，BTLA和TIM-3陽性表達率均與術后7 d外周血CD3+、CD4+水平呈負相關，與術后7 d CD8+水平呈正相關，相關性均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）；BTLA和TIM-3陽性表達率與CD4+/CD8+比值無關，相關性無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05），見表4。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，涉及到多種生物學機制的相互作用。免疫檢查點是一類調節(jié)免疫細胞活性的蛋白質分子，如程序性死亡蛋白1（PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）等。正常情況下，免疫檢查點的存在有助于維持免疫系統(tǒng)的自身耐受性和防止過度反應。然而，腫瘤細胞通過上調免疫檢查點分子的表達，與免疫細胞表面的相應受體結合，從而抑制了免疫細胞的活性，實現免疫逃逸[9]?，F階段，通過干預免疫檢查點，從而恢復免疫細胞功能，提高機體對腫瘤的免疫應答，已成為臨床研究的熱點和難點。

BTLA是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其蛋白結構與PD-1和CTLA-4類似，BTLA細胞外結構域含有一個Ig樣Ⅴ型結構域，與之相連的是跨膜片段，以及含有免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸開關基序的細胞質尾部，這些結構參與介導抑制信號轉導[10]。TIM-3是由301個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白，存在于5q33.2染色體上，TIM-3胞外區(qū)包含IgⅤ結構域和黏蛋白樣結構域，胞內區(qū)包含5個酪氨酸的胞漿尾巴[11]。本研究分析了這兩種免疫檢查點分子在肺腺癌中的表達情況，結果顯示，與肺炎性組織比，肺腺癌腫瘤組織中BTLA和TIM-3蛋白陽性率更高，且BTLA陽性表達患者中TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于BTLA陰性表達患者；TIM-3陽性表達患者中低分化及TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者占比均高于TIM-3陰性表達患者，這表明BTLA、TIM-3的表達可能與腫瘤TNM分期、分化程度有關。分析其原因在于，TNM分期較高和分化程度較低的患者通常意味著腫瘤惡性程度較高，在此背景下，BTLA和TIM-3蛋白表達上調，以抑制機體的抗腫瘤免疫反應，從而幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，促進肺腺癌病情進展[12]。

本研究還發(fā)現，術后7 d患者外周血CD4+水平及CD4+/CD8+比值較術前均有所升高，而外周血CD8+水平降低。T淋巴細胞為抗腫瘤的主要免疫細胞，其中CD4+ T淋巴細胞屬于關鍵的輔助性細胞，能夠通過分泌各類細胞因子助推免疫應答；而CD8+T淋巴細胞則通過直接殺傷作用清除腫瘤細胞。本研究中，術后患者外周血T淋巴細胞水平因手術創(chuàng)傷、應激（如麻醉、術中出血）等因素的作用而降低，隨著術后免疫系統(tǒng)的逐漸恢復和重建，CD4+ T淋巴細胞的數量可能逐漸增加，以支持免疫系統(tǒng)的功能恢復；同時，由于術后體內的腫瘤細胞數量減少，對CD8+ T淋巴細胞的刺激作用減弱，導致其增殖和活化也會相應減少，進而維系免疫系統(tǒng)的平衡[13]。隨著CD4+ T淋巴細胞水平升高與CD8+ T淋巴細胞水平升高降低，CD4+/CD8+比值呈升高趨勢，表明術后患者免疫系統(tǒng)的平衡向更有利于抗腫瘤應答的方向移動，但CD3+、CD4+ T淋巴細胞水平低于正常范圍，這可能意味著術后患者還是存在腫瘤免疫逃逸機制。

BTLA與其配體結合，可導致免疫受體酪氨酸抑制基序的磷酸化，進而招募磷酸酶，如蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）或蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），這些磷酸酶能夠去磷酸化下游的信號分子，從而抑制T淋巴細胞的活化和增殖[14]。另有研究顯示，BTLA高表達不僅能促進非小細胞肺癌的浸潤和淋巴轉移，還能上調PD-1表達[15]。PD-1會使受到T淋巴細胞攻擊的腫瘤細胞高表達程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡配體2（PD-L2），并與T淋巴細胞上的PD-1受體結合，抑制T淋巴細胞的活化，阻礙T淋巴細胞對腫瘤的抑制效應，誘導免疫逃逸。TIM-3與配體結合后，會抑制T淋巴細胞的活化、增殖及效應功能，使T淋巴細胞進入耗竭狀態(tài)。且有研究顯示，肺腺癌癌組織TIM-3 mRNA與蛋白表達量均高于癌旁組織和正常組織，且TIM-3可能通過下調干擾素g而促進腫瘤的生長和轉移[16]。干擾素g是免疫應答中的重要因子，主要由活化的T淋巴細胞產生，其能增強T淋巴細胞的增殖分化能力，因此TIM-3下調干擾素g表達可能間接影響T淋巴細胞激活，削弱T淋巴細胞對腫瘤細胞的識別和清除能力[17]。另有研究表明，TIM-3可能通過激活

TIM-3/半乳糖凝集素9（Gal-9）信號通路，發(fā)揮免疫逃逸與免疫耐受的生物學功能，參與腫瘤發(fā)展過程[18]。因此，當BTLA和TIM-3表達為陽性時，會通過傳遞抑制信號來降低CD3+、CD4+水平，從而削弱抗腫瘤應答，可能促進腫瘤細胞的生長和擴散，同時又刺激了機體CD8+水平的代償性升高。本研究對術后BTLA和TIM-3蛋白表達水平與患者術后7 d T淋巴細胞亞群水平進行相關性分析，結果顯示，BTLA和TIM-3陽性表達率均與術后7 d外周血CD3+、CD4+水平呈負相關，與術后7 d外周血CD8+水平呈正相關，這提示盡管術后早期免疫系統(tǒng)得到了初步恢復和激活，但BTLA、TIM-3可能通過降低外周血CD3+、CD4+水平和外周血增加CD8+水平來干擾這一過程，從而可能推動免疫逃逸，為腫瘤細胞的生長和擴散創(chuàng)造有利條件。然而，本研究未發(fā)現BTLA和TIM-3陽性表達率與術后7 d外周血CD4+/CD8+比值存在直接的關聯性，這可能是由于BTLA和TIM-3主要作用于CD4+、CD8+T淋巴細胞水平，而非直接調控CD4+、CD8+T淋巴細胞之間的相對數量比例，且BTLA和TIM-3對CD4+、CD8+水平的影響程度和方向并不一致，故而這種不等量的影響可能并未能顯著改變CD4+/CD8+比值。

綜上，BTLA和TIM-3在肺腺癌中高表達，且BTLA和TIM-3陽性表達率均與術后7 d外周血CD3+、CD4+水平呈負相關，與術后7 d外周血CD8+水平呈正相關，BTLA和TIM-3有望成為監(jiān)測肺腺癌腫瘤免疫逃逸的臨床指標。但本研究存在一定局限性，如樣本量小、僅探討了BTLA和TIM-3的表達情況及其與術后免疫細胞的相關性，未深入研究其具體的分子機制和信號通路，未來還需擴大樣本量，進一步驗證BTLA和TIM-3在肺腺癌中的表達及其與腫瘤免疫逃逸的相關性，并進一步探討B(tài)TLA和TIM-3的分子機制。

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