腫瘤微環(huán)境下腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1在食管鱗癌上皮細(xì)胞間質(zhì)化和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

【摘要】目的 探究腫瘤微環(huán)境（TME）下腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（MTA1）表達(dá)情況及其在食管鱗癌上皮細(xì)胞間質(zhì)化（EMT）和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為今后臨床治療食管鱗癌提供思路。方法 采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)測定并比較人正常食管上皮細(xì)胞及不同類型食管鱗癌細(xì)胞中MTA1 mRNA表達(dá)情況；選擇表達(dá)量最高的食管鱗癌細(xì)胞株用于構(gòu)建敲低MTA1表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410細(xì)胞（siMTA1組），同時構(gòu)建正常MTA1表達(dá)的KYSE410細(xì)胞（siNC組）；分析TME培養(yǎng)對siMTA1組與siNC組KYSE410細(xì)胞中MTA1 mRNA表達(dá)的影響；在TME培養(yǎng)下，采用超敏型細(xì)胞增殖檢測試劑（CCK-8）檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細(xì)胞增殖情況；Transwell小室試驗(yàn)檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移情況、RT-qPCR法檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細(xì)胞EMT上皮性鈣黏附蛋白（E-cad）、神經(jīng)型鈣黏附蛋白（N-cad）mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果 食管鱗癌細(xì)胞株（KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450）的MTA1 mRNA表達(dá)量均高于人正常食管上皮細(xì)胞HET-1A，且KYSE410細(xì)胞株表達(dá)量最高；常規(guī)培養(yǎng)、TME下siNC組MTA1 mRNA相對表達(dá)量均高于siMTA1組；與常規(guī)培養(yǎng)比，TME培養(yǎng)下siNC組、siMTA1組MTA1 mRNA相對表達(dá)量均較高；TME培養(yǎng)條件下，siNC組KYSE410細(xì)胞侵襲數(shù)量、轉(zhuǎn)移數(shù)量均高于siMTA1組；TME培養(yǎng)條件下，siNC組KYSE410細(xì)胞EMT相關(guān)分子

E-cad mRNA相對表達(dá)量低于siMTA1組，N-cad mRNA相對表達(dá)量高于siMTA1組（均Plt;0.05）。結(jié)論 食管鱗癌細(xì)胞中MTA1 mRNA表達(dá)量較人正常食管上皮細(xì)胞明顯增加，且相較于常規(guī)培養(yǎng)條件，TME培養(yǎng)條件下會顯著促進(jìn)MTA1的表達(dá)，MTA1的敲低明顯調(diào)節(jié)EMT相關(guān)分子的表達(dá)，抑制KYSE410細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】腫瘤微環(huán)境 ; 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1 ; 食管鱗癌 ; 上皮細(xì)胞間質(zhì)化

【中圖分類號】R735.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.24.0001.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.24.001

食管癌在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占有重要地位，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是國內(nèi)最常見的組織學(xué)類型[1]。對于早期ESCC患者，手術(shù)切除往往能帶來較好的治療效果，然而，晚期ESCC患者面臨的主要問題是術(shù)后復(fù)發(fā)和癌細(xì)胞的擴(kuò)散，這些因素是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[2]。惡性腫瘤的一個關(guān)鍵特性是其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（MTA1）作為一種與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，已經(jīng)在多種腫瘤中（包括ESCC）觀察到，其高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和血管生成密切相關(guān)。在缺氧、炎癥及腫瘤微環(huán)境（TME）等病理?xiàng)l件也能增強(qiáng)MTA1的表達(dá)[3]。此外，在TME中，多種因素，如細(xì)胞因子、生長因子、缺氧和免疫細(xì)胞等都可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生，而EMT這一過程可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。由此可見，在TME刺激下，MTA1可能通過對ESCC細(xì)胞的EMT與遷移過程而產(chǎn)生的影響，在ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?；诖?，本研究通過模擬體外TME，檢測食管鱗狀細(xì)胞MTA1 mRNA表達(dá)量，細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力及EMT相關(guān)分子的表達(dá)情況，探討MTA1對ESCC細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人正常食管上皮細(xì)胞HET-1A（上海博古生物技術(shù)有限公司）；ESCC細(xì)胞株KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450（中國科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。所有細(xì)胞分別培養(yǎng)在Dulbecco改良Eagle（DMEM）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件是37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱。

1.1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（TOYOBO）；Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑（美國英杰生命技術(shù)有限公司）；MTA1敲低質(zhì)粒（siMTA1）（用于抑制MTA1表達(dá)）和陰性對照質(zhì)粒（siNC）（上海吉瑪基因公司）；TRIzol試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；磷酸鹽（PBS）緩沖液、4%細(xì)胞固定液和1%結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司）；Matrigel膠[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]。

熒光定量PCR儀（美國伯樂公司，型號：CFX96 Touch）；凝膠成像系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，型號：VersaDoc2000）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本株式會社尼康，型號：Eclipse E600）；酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：Epoch2）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞RNA提取及RT-qPCR檢測MTA1 mRNA表達(dá)量 從中通過Trizol方法提取細(xì)胞總RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，這一過程遵循PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒。PCR反應(yīng)體系根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM配制，具體步驟包括：⑴預(yù)變性步驟在75 ℃下進(jìn)行，持續(xù)120 s；⑵變性步驟在90 ℃下進(jìn)行，持續(xù)5 min；⑶退火步驟在60 ℃下進(jìn)行，持續(xù)60 s；⑷延伸步驟在72 ℃下進(jìn)行，持續(xù)30 s；⑷通過熒光定量PCR儀在40個循環(huán)中收集熒光信號。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）用作內(nèi)參照基因，而MTA1 mRNA的相對表達(dá)量通過2-??CT方法計(jì)算，其引物序列為上游5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'和下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。每個樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。以相對表達(dá)量最高的細(xì)胞株（KYSE410）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 敲低MTA1表達(dá)的KYSE410細(xì)胞系構(gòu)建及培養(yǎng) 采用siRNA干擾技術(shù)，根據(jù)說明書分別將siNC、siMTA1與LipofectamineTM 2 000轉(zhuǎn)染試劑混合，然后分別將siNC轉(zhuǎn)染混懸液及siMTA1轉(zhuǎn)染混懸液轉(zhuǎn)染至KYSE410細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后使用RT-qPCR檢測MTA1 mRNA的表達(dá)量，驗(yàn)證敲低MTA1表達(dá)的KYSE410細(xì)胞是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的siNC、siMTA1 KYSE410細(xì)胞分別作為siNC組、siMTA1組，將對應(yīng)細(xì)胞分別置于常規(guī)培養(yǎng)條件（DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、20%氧氣、5%二氧化碳的濕化培養(yǎng)箱，pH=7.4）和TME培養(yǎng)條件（DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、1%氧氣、5%二氧化碳、94%氮?dú)猓∟2）的濕化培養(yǎng)箱，3%氯化氫，pH值=6.5）下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞增殖能力 將1.2.2中培養(yǎng)的siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞稀釋，細(xì)胞密度為每100 μL含有5×103個，接種到96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，并在周圍留有空白孔以防止液體蒸發(fā)，同時加入PBS緩沖液以保持濕潤。分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h時進(jìn)行檢測。在進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)之前，向每個孔中加入110 μL的CCK-8工作液（由100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8原液混合而成）。細(xì)胞孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度值（OD 450 nm）。

1.2.4 Transwell小室檢測siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞侵襲及遷移能力 通過Transwell實(shí)驗(yàn)來評估細(xì)胞的侵襲能力，siNC、siMTA1組細(xì)胞在不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行24 h的饑餓處理。接著，使用Matrigel膠（濃度為50 mg/L）涂覆Transwell小室的底部，然后在Transwell小室的下層加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將經(jīng)過饑餓處理的細(xì)胞（每100 μL含有1×105個細(xì)胞）分別加入到Transwell小室中。培養(yǎng)24 h后，移除Transwell小室，用棉簽擦拭去除上層的細(xì)胞。隨后，用PBS緩沖液清洗小室外層的細(xì)胞，接著用4%的細(xì)胞固定液固定，再用1%結(jié)晶紫染液染色。對小室外層的細(xì)胞進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)，選擇10個不同的視野，利用Image J軟件來計(jì)算穿透膜的細(xì)胞數(shù)量，以此作為細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值。在進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)時，不添加基質(zhì)膠，以檢測KYSE410細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5 EMT相關(guān)分子表達(dá)量檢測 以GAPDH為內(nèi)參檢測EMT相關(guān)分子上皮性鈣黏附蛋白（E-cad）、神經(jīng)型鈣黏附蛋白（N-cad）的mRNA表達(dá)水平，檢測方法參照1.2.1中RT-qPCR檢測法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料經(jīng)S-W法檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同食管鱗癌細(xì)胞系中MAT1 mRNA相對表達(dá)量 MTA1在4種食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于人正常食管上皮細(xì)胞HET-1A，其中在KYSE410細(xì)胞中表達(dá)量最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2 TME培養(yǎng)對KYSE410細(xì)胞MTA1 mRNA表達(dá)的影響 常規(guī)培養(yǎng)、TME培養(yǎng)下siNC組MTA1 mRNA相對表達(dá)量均高于siMTA1組；與常規(guī)培養(yǎng)比，TME培養(yǎng)siNC組、siMTA1組MTA1 mRNA相對表達(dá)量均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 TME培養(yǎng)對siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞增殖能力的影響 siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h的OD 450 nm值逐漸增大，且各個時間點(diǎn)siMTA1組均低于siNC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表3；siMTA1組KYSE410細(xì)胞增殖曲線較siNC組更為平緩，見圖1。

2.4 TME下siNC組、siMTA1組KYSE410細(xì)胞侵襲、遷移能力及EMT相關(guān)分子表達(dá)量變化 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siNC組比，siMTA1組KYSE410細(xì)胞通過matrigel 基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲數(shù)量、轉(zhuǎn)移數(shù)量均減少；

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siNC組比，siMTA1組KYSE410細(xì)胞E-cad mRNA相對表達(dá)量升高，N-cad mRNA相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表4。

3 討論

MTA1與細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，多種上皮源性惡性腫瘤中常出現(xiàn)過量表達(dá)的現(xiàn)象。SU等[5]在大腸癌組織研究中發(fā)現(xiàn)，MTA1在癌組織中呈高表達(dá)，并且其高水平的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性。LIU等[6]的研究證實(shí)，當(dāng)MTA1在食管上皮細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平上升時，通常意味著癌變的發(fā)生。本研究通過對比人正常食管上皮細(xì)胞HET-1A、不同ESCC細(xì)胞株KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450中MTA1 mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)MTA1在人正常食管上皮細(xì)胞中低表達(dá)，而在ESCC細(xì)胞株中的表達(dá)量顯著提高，與SU等、LIU等的研究結(jié)果相似，這意味著MTA1表達(dá)量的上升，可能對癌細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等有促進(jìn)作用。

MTA1作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，其表達(dá)受到多種環(huán)境因素的影響，缺氧、炎癥及TME等損傷性條件均能促進(jìn)MTA1的表達(dá)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，TME培養(yǎng)條件下MTA1的相對mRNA表達(dá)量高于常規(guī)培養(yǎng)。其原因可能與TME中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種因素密切相關(guān)，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），可通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中MTA1的表達(dá)[8]；可見食管鱗癌的腫瘤微環(huán)境可促進(jìn)MTA1表達(dá)。為了探究抑制MTA1表達(dá)對ESCC細(xì)胞增殖的影響，本研究在TME培養(yǎng)條件下敲低siMTA1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC細(xì)胞增殖能力顯著下降。研究表明，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MTA1 siRNA轉(zhuǎn)染至人食管癌Eca109細(xì)胞，可以抑制MTA1基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其過程可能與下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白的表達(dá)、促進(jìn)caspase-3蛋白的活化有關(guān)[9]。

此外，腫瘤細(xì)胞及其周圍的間質(zhì)細(xì)胞分泌的信號分子能夠吸引并積累具有免疫抑制特性的細(xì)胞，從而構(gòu)建出一個促進(jìn)炎癥的微環(huán)境。這種持續(xù)的炎癥狀態(tài)通過多樣的生物學(xué)途徑刺激腫瘤干細(xì)胞樣特征的細(xì)胞的增長，并激活上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT的過程[10]。EMT是一個多步驟的生物學(xué)過程，通常會導(dǎo)致上皮細(xì)胞間的聯(lián)系和黏附性降低，細(xì)胞失去頂端 - 基底極性，并獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特征，這使得癌細(xì)胞更有可能進(jìn)行遷移和侵襲鄰近組織[11]。在這一過程中，與EMT相關(guān)的標(biāo)志性分子會出現(xiàn)明顯的變化，如E-cad表達(dá)水平的下調(diào)，會導(dǎo)致細(xì)胞極性喪失，促使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)狀態(tài)，利于細(xì)胞增強(qiáng)運(yùn)動能力，從而增加細(xì)胞的收縮能力，提高腫瘤細(xì)胞侵襲力；N-cad的水平升高，促使細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，由皮質(zhì)肌動蛋白向細(xì)胞質(zhì)和基底的中間絲網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變，這一變化進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移能力[12]。ZHOU等[13]的研究證實(shí)，TME更有益于MTA1的表達(dá)，而MTA1表達(dá)量的提高，會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，也會下調(diào)E-cad、上調(diào)N-cad。本研究發(fā)現(xiàn)，與siNC組比，siMTA1組敲低MTA1的KYSE410細(xì)胞株中E-cad相對表達(dá)量升高，N-cad相對表達(dá)量降低，這表明MTA1能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的EMT過程，這是癌細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要機(jī)制。

綜上， 食管鱗癌細(xì)胞中MTA1 mRNA表達(dá)量較人正常食管上皮細(xì)胞明顯增加，且相較于常規(guī)培養(yǎng)條件，TME培養(yǎng)條件下會顯著促進(jìn)MTA1的表達(dá)，MTA1的敲低明顯調(diào)節(jié)EMT相關(guān)分子的表達(dá)，抑制KYSE410細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機(jī)制，還需深入探究，為今后臨床治療相關(guān)疾病提供更全面依據(jù)。

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