海稻86轉(zhuǎn)錄因子HD-ZIP的克隆及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：海稻86；HD-ZIP Ⅰ；基因克?。簧镄畔W(xué)；亞細(xì)胞定位；表達(dá)分析

中圖分類號：S511：Q78 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0021-07

土壤鹽堿化是一個全球性問題，影響到約200/0的灌溉土地，并大大降低作物產(chǎn)量。受鹽影響的土壤通常分為鹽漬土、堿土和鹽堿土。鹽漬土中不含鈉，但含有大量的可溶性鹽，對大多數(shù)作物的生長有不利影響：堿土中鈉離子水平升高，由于某些物理過程（粘土的消化、膨脹和分散）和特定條件（表面結(jié)殼和硬化）而表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性問題，危害植物生長；鹽堿土中可溶性鹽和鈉離子含量高，在耕作時會形成大塊而阻礙水分流動，導(dǎo)致作物水分分布和生長不良。

HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子是同源異型盒蛋白家族成員，由同源異型結(jié)構(gòu)域（Homeodomain.HD）和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（Leucine zipper，LZ）兩個功能結(jié)構(gòu)域組成，根據(jù)序列保守性和功能性質(zhì)，分為HD-ZIP Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞家族。DNA通過結(jié)合HD-ZIP蛋白亮氨酸拉鏈基序LZ結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)與其互作，HD-ZIP Ⅰ蛋白可與含CAAT（A/T）ATTG雙重對稱基序的DNA結(jié)合，HD-ZIPⅡ蛋白優(yōu)先選擇結(jié)合CAAT（C/G） ATTG基序，HD-ZIPⅢ蛋白優(yōu)先識別GTAAT（G/C） ATTAC序列，而CATT（A/T）AATG基序是DNA與HD-ZIPⅣ蛋白結(jié)合所必需的核心元件。各亞家族由于結(jié)構(gòu)的差異，在植物中發(fā)揮的調(diào)控功能和表達(dá)模式也不同。其中，HD-ZIP Ⅰ亞家族蛋白結(jié)構(gòu)最簡單，不與其他家族成員含有共同的結(jié)構(gòu)域或基序。多項研究表明，HD-ZIP Ⅰ亞家族參與調(diào)節(jié)植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育以及對干旱、鹽堿、寒冷和重金屬脅迫的耐受性。關(guān)于HD-ZIP Ⅰ亞家族基因響應(yīng)植物鹽脅迫的研究已有報道。沉默鷹嘴豆CaHD212基因，植株對鹽脅迫的敏感性增加，基因在根和莖組織中表達(dá)量均明顯升高；在芥藍(lán)中過表達(dá)擬南芥AtHDG11基因，可誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，增強植株耐鹽能力201；Zhang等在純合水稻植株OsHOX22基因啟動子中插入T-DNA，發(fā)現(xiàn)突變體在苗期對鹽脅迫的耐受性明顯增強。表明HD-ZIP Ⅰ亞家族在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

鹽脅迫為典型的非生物脅迫之一，嚴(yán)重制約著作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。水稻對鹽敏感，挖掘耐鹽水稻種質(zhì)資源，解析水稻耐鹽遺傳機制和分子機制，可為培育耐鹽水稻新品種奠定良好理論基礎(chǔ)。同時，對最大化地利用鹽堿地土壤資源、提高土地利用效率、改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。海稻86是一種耐鹽性強的種質(zhì)資源，其生理機制和關(guān)鍵耐鹽基因尚未見報道。本研究通過對海稻86中OsHDZ1基因進行克隆及相關(guān)生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)培育抗鹽脅迫品種提供基因資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料為本氏煙草和海稻86種子，均為本實驗室留存。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Rapid Taq Master Mix酶、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101（PSoup+P19）購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；載體pNC-Green-SubC、Nimble Cloning試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2材料處理

2022年9月8日，將海稻86的種子平整、均勻地散布于濕潤濾紙上，28℃培養(yǎng)2～3d，待長出根后轉(zhuǎn)移至含有霍格蘭營養(yǎng)液的植物水培盒中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長7d，培養(yǎng)條件：濕度60%，溫度30℃，14 h光照/10 h黑暗。于2022年9月18日開始鹽脅迫處理，用200mmol/L的NaCl溶液進行培養(yǎng)，并分別于處理后0、6、15、24、60、72 h取植株地上部分，經(jīng)液氮速凍后保存至超低溫冰箱備用。

1.3RNA提取及cDNA合成

取-80℃保存的葉片經(jīng)液氮研磨成粉末狀，參照多糖多酚總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。將提取得到的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA的質(zhì)量和完整性，并利用NanoDrop分光光度計測定RNA濃度，隨后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNAwiper）說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的產(chǎn)物保存至-20℃冰箱。

1.4基因克隆及載體構(gòu)建

將前期保存的cDNA取出作為模板，根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫http：//rice.uga.edu/中LOC_Os04g45810的序列，設(shè)計特異性引物Os HDZl-F/R進行PCR擴增，引物具體序列見表1。反應(yīng)體系：模板cDNA1.0μL，正向引物1.0μL，反向引物1.0μL，2x Taq Master Mix 12.5μL，ddH20 9.5μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃15s，60℃15s，72℃30 s，72℃5 min，共33個循環(huán)。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增產(chǎn)物，并按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書對目的條帶進行純化回收。利用Nimble Cloning試劑盒將回收得到的DNA產(chǎn)物連接到亞細(xì)胞定位載體pNC-Green-SubC上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，涂布至抗性平板后于37℃下培養(yǎng)過夜，通過菌液PCR鑒定陽性克隆，測序驗證正確后，提取質(zhì)粒并保存至-20℃冰箱。

1.5生物信息學(xué)分析方法

利用NCBI BLAST中的CD-search功能查找OsHDZ1的保守結(jié)構(gòu)域，并獲取其他物種中HD-ZIP蛋白的同源序列信息，使用DNAMAN軟件進行多序列比對分析：通過TBtools分析并可視化Os HDZ1基因結(jié)構(gòu)；通過在線網(wǎng)站SOMPA、TM-HMM分析目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)：利用SWISS-MODEL在線工具進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析；利用Netphos進行磷酸化位點預(yù)測；使用Ex-PASy-ProtParam獲得其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)信息。

1.6亞細(xì)胞定位

將保存的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101（PSoup+P19），通過瞬時表達(dá)法將農(nóng)桿菌菌液注射至煙草表皮細(xì)胞，隨后將煙草置于26℃、14h光照/10 h黑暗的條件下培養(yǎng)48～72 h，利用FluoViewTM FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光在煙草細(xì)胞中的分布情況。

1.7基因表達(dá)分析

提取鹽脅迫下不同時間點海稻86樣品的RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，水稻Actin基因為內(nèi)參，設(shè)計引物qRT-OsHDZ1-F/R、OsActin-F/R（表1）檢驗OsHDZ1在鹽脅迫下的表達(dá)譜。熒光定量PCR的反應(yīng)體系20.0μL：2× ChamQ Univer-sal SYBR qPCR Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2.0μL，ddH20 7.2μL。使用儀器：Mx3005P熒光定量PCR儀（上海吉泰生物科技有限公司）。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，采用2^-△△Ct計算基因的相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1OsHDZ1的克隆及編碼蛋白特征分析

以海稻86葉片cDNA為模板，通過引物Os-HDZl-F、Os HDZl-R進行PCR擴增，獲得約800bp的條帶（圖1）。測序結(jié)果顯示，目的基因編碼區(qū)（CDS）長度為831bp，編碼276個氨基酸，命名為OsHDZ1基因。蛋白分子量為30.65 kDa，理論等電點為5. 19，為酸性蛋白；平均親水性為-0.714，為親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為66.6，為不穩(wěn)定蛋白。

2.2 OsHDZl生物信息學(xué)分析

通過PlantCARE網(wǎng)站對OsHDZ1基因啟動子分析發(fā)現(xiàn)，除了TATA-box和CAAT-box等真核基因啟動子的特征序列元件，還存在較多與激素、環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，包括特異性厭氧誘導(dǎo)元件（GC-motif，CCCCCG），分生組織表達(dá)順式調(diào)控元件（CAT-box，GCCACT）以及脫落酸（ABRE，ACGTG、CACGTG、CGCACGTGTC）、茉莉酸（CGT-CA-motif，CGTCA；TGACG-motif，TGACG）調(diào)控響應(yīng)元件等（圖2），說明Os HDZ1基因可能參與多種脅迫過程的調(diào)控。

對OsHDZl蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果（圖3A）顯示，OsHDZl在第73～127位和第129～164位氨基酸處分別含有HD結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域，證明克隆得到的轉(zhuǎn)錄因子屬于HD-ZIP家族成員。此外，基因結(jié)構(gòu)組成信息（圖3B）顯示，OsHDZ1有2個外顯子，說明可能存在可變剪接。

對OsHDZ1蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果（圖4A）顯示，OsHDZ1蛋白中包括42.03%的α-螺旋、7.97%的B-轉(zhuǎn)角、10.14%延伸鏈以及39.86%無規(guī)則卷曲。通過在線軟件SWISS-MODE預(yù)測OsHDZ1蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖4B），結(jié)果與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果保持一致。

利用NetPhos在線網(wǎng)站預(yù)測OsHDZ1蛋白有25個磷酸化位點（17個絲氨酸、5個蘇氨酸和3個酪氨酸），并存在多個蛋白激酶結(jié)合位點（圖SA）；對OsHDZ1蛋白進行跨膜預(yù)測，結(jié)果（圖5B）顯示OsHDZ1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為非分泌蛋白。

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載其他已知物種的HD-ZIP蛋白序列，與OsHDZ1蛋白序列進行同源性分析（圖6），發(fā)現(xiàn)OsHDZ1與禾本科植物彎葉畫眉草（Er-agrostis curvula）的HD-ZIP蛋白（TVU15031.1）氨基酸序列同源性最高，為61.13%。此外，與小麥（Tritic-um aestivum，XP_044320230.1）和野生二粒小麥（Triti-cum dicoccoides，XP_037486551.1）同源性也較高，均為59.87%。表明海稻86 OsHDZ1蛋白與小麥HD-ZIP蛋白親緣關(guān)系近，基因功能可能更相似。

2.3 OsHDZl蛋白亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建好的pNC-Green-SubC-OsHDZ1載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染本氏煙草葉片進行瞬時表達(dá)，使用共聚焦顯微鏡進行觀察GFP熒光信號，發(fā)現(xiàn)pNC-Green-SubC-OsHDZl在細(xì)胞核上發(fā)出特異綠色熒光信號（圖7），表明OsHDZl蛋白定位于細(xì)胞核。

2.4 OsHDZ1基因表達(dá)量分析

為了解析OsHDZ1在海稻應(yīng)答鹽脅迫過程中的功能，利用熒光定量PCR分析OsHDZ1在鹽脅迫下不同時間點的相對表達(dá)水平。結(jié)果（圖8）表明，隨著鹽脅迫時間的延長，Os HDZ1表達(dá)量逐漸上升，在60 h達(dá)到最高，約是Oh表達(dá)水平的10.07倍。72 h時表達(dá)量下降，但仍顯著高于Oh。推測OsHDZ1的表達(dá)受鹽脅迫的持續(xù)誘導(dǎo)，在響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

3討論與結(jié)論

鹽堿化是影響土地質(zhì)量的重要因素之一，為困擾全世界的生態(tài)問題，對生態(tài)結(jié)構(gòu)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等造成極大的破壞。我國鹽堿化土地占全國可耕地面積的五分之一，主要分布于北方地區(qū)，土地鹽堿化導(dǎo)致植物營養(yǎng)吸收差，生長發(fā)育停滯而產(chǎn)量大幅下降。培育耐鹽堿作物對于有效利用鹽堿地土壤資源，改善生態(tài)環(huán)境具有重要戰(zhàn)略意義。

作為高等植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，HD-ZIP家族根據(jù)其序列保守性和功能特性，進一步分為HD-ZIP Ⅰ～Ⅳ4個亞家族，大量研究表明HD-ZIP Ⅰ主要參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)，如鹽脅迫。近年來關(guān)于HD-ZIP家族參與鹽脅迫響應(yīng)的研究也逐漸深入。沉默SlHB2的番茄，在鹽脅迫條件下，葉片中葉綠素和水含量較高，失水率和丙二醛含量較低，從而提高了植株對鹽脅迫的耐受性；Wang等對玉米進行不同時長的鹽處理，qRT-PCR結(jié)果顯示，ZmHDZ1表達(dá)量呈下降趨勢，進一步在水稻中過表達(dá)ZmHDZ1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性不如野生型植株，表明Zm-HDZ1參與鹽脅迫調(diào)控：陸地棉Gh HB1基因在1% NaCl脅迫下的表達(dá)活性顯著提高，同樣表明GhHB1基因參與鹽脅迫反應(yīng)。這些結(jié)果表明HD-ZIP Ⅰ亞家族在植物抗鹽脅迫中具有重要調(diào)控作用。海稻86是一種重要的耐鹽堿水稻種質(zhì)資源，探究其耐鹽機制對于耐鹽作物的培育具有重要的意義。

本研究克隆了HD-ZIP Ⅰ亞家族基因Os-HDZ1，并對其進行了初步分析。結(jié)果表明，Os-HDZ1基因CDS全長為831 bp，編碼276個氨基酸，且含有HD結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析顯示OsHDZ1蛋白定位于細(xì)胞核，屬于核蛋白，符合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控功能的特點。利用熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，隨著鹽脅迫時間的延長，OsHDZ1在海稻86植株中的表達(dá)量逐漸上升，在60 h達(dá)到最高點，之后逐漸下降，但整體呈上調(diào)趨勢，說明Os HDZ1基因在海稻響應(yīng)鹽脅迫過程中起重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果可為后續(xù)深入解析HD-ZIP應(yīng)答鹽脅迫的分子機制奠定良好的理論基礎(chǔ)，具有潛在的應(yīng)用價值。