新型接觸性病毒牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷與防控措施的詳細探討

牛結(jié)節(jié)性皮膚病又被稱為牛結(jié)節(jié)疹，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒引發(fā)的以全身體表皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鞯牟《拘詡魅拘约膊?。該種疾病通過牛和相關(guān)制品的運輸向著全國各地蔓延，在各個省份相繼報告了結(jié)節(jié)性皮膚病疫病。從致死率來看牛結(jié)節(jié)性皮膚病造成的整體死亡率相對較低，但是該類疾病發(fā)病周期較長，傳播速度相對較快，發(fā)病之后會導(dǎo)致繁殖母牛出現(xiàn)不孕流產(chǎn)，種公牛出現(xiàn)不育，同時還會降低奶牛的泌乳量和肉牛的生產(chǎn)性能，損壞牛皮，病情加重之后還很容易繼發(fā)感染細菌性疾病和其他病毒性疾病，使得疾病的診斷難度加大，養(yǎng)殖效率逐漸下降，給牛養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。作為飼養(yǎng)管理人員應(yīng)該對牛結(jié)節(jié)性皮膚病的危害有所認(rèn)知，要明確該類疾病的流行特點和診斷方法，提前采取措施進行有效地防控，降低發(fā)病率，確保養(yǎng)殖安全。本次研究就牛結(jié)節(jié)性皮膚病的診斷與防控措施進行詳細的探討與分析，希望對廣大同行有所借鑒與幫助。

一、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的流行病學(xué)

1、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的病原學(xué)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒屬于痘病毒科山羊豆痘病毒屬的成員，已知有Ⅰ型（廣泛分布）、Ⅱ型（非洲）、Ⅲ型（中亞）。該類病毒形態(tài)特征呈現(xiàn)磚形或卵形，長度230～270nm，寬度140～200nm，具有包膜和中心核心，表面有桿狀結(jié)構(gòu)。病毒對干燥和高溫相對穩(wěn)定，可以在痂皮和土壤中存活數(shù)月，對酸性條件敏感。氯仿等有機溶劑不滅活病毒，病毒對熱敏感，56℃加熱30min可滅活病毒，對紫外線和γ射線敏感，對某些消毒劑敏感，如次氯酸鈉和季銨化物。該類病毒宿主范圍窄，主要感染牛，通過接觸感染性物質(zhì)（例如痂皮或唾液）傳播，在牛群中引起嚴(yán)重的結(jié)節(jié)性皮膚病。

2、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的致病機理

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）的致病機制涉及病毒與宿主細胞的相互作用和病毒復(fù)制過程中的免疫逃避。LSDV通過皮膚傷口或黏膜進入宿主，病毒與靶細胞表面的受體結(jié)合，例如痘病毒受體A33R。病毒進入細胞后，其外膜融合，釋放核心到細胞質(zhì)中，核心釋放病毒DNA，并在細胞質(zhì)中復(fù)制。LSDV在動物細胞當(dāng)中能夠編碼多種免疫調(diào)節(jié)蛋白，可以抑制宿主的免疫反應(yīng)。常見的蛋白質(zhì)主要有E3L蛋白抑制宿主細胞的凋亡，為病毒復(fù)制提供有利環(huán)境。B22R蛋白抑制主要組織相容性復(fù)合物（MHC）I類分子的表達，從而逃避細胞毒性T細胞的識別，同時結(jié)節(jié)性皮膚病毒還能夠干擾牛體內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。LSDV復(fù)制導(dǎo)致靶細胞腫脹和破裂，釋放病毒顆粒和細胞碎片，細胞損傷和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)主要發(fā)生在皮膚、淋巴結(jié)和呼吸道等部位。LSDV持續(xù)復(fù)制和釋放新的病毒顆粒，逃避宿主的免疫反應(yīng)，病毒表面蛋白的抗原變異也可能有助于其逃避免疫識別。

3、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的流行特點

牛結(jié)節(jié)性皮膚病是一種由疙瘩皮膚病病毒引起的牛的傳染病，傳染源是感染牛以及病牛的結(jié)節(jié)液、唾液、血液和糞便。病毒主要通過吸血昆蟲（如蚊、蠅、蠓、虻、蜱等）的叮咬傳播，也可通過相互舔舐或舔舐發(fā)病牛的結(jié)痂進行傳播，食入被感染動物唾液污染的飼料和飲水也是傳播途徑之一。該種疾病目前沒有特定的易感群體，所有牛都應(yīng)該被認(rèn)為是潛在的易感者，尤其是幼牛和未經(jīng)免疫的成年牛。從流行季節(jié)來看結(jié)節(jié)性皮膚病在溫暖濕潤的季節(jié)更為流行，特別是在雨后，昆蟲活動頻繁時，夏季和秋季是疾病的高發(fā)期。在很多養(yǎng)殖場中牛結(jié)節(jié)性皮膚病是由疙瘩皮膚病病毒引起的慢性、亞急性或急性傳染病，病毒可能通過感染牛的唾液進入體內(nèi)，引起病毒復(fù)制和感染，再加上養(yǎng)殖管理不當(dāng)患病牛群和健康牛群頻繁接觸，從而造成疫病擴散蔓延。

二、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的臨床癥狀

牛結(jié)節(jié)性皮膚病潛伏期因不同病毒株和牛只的免疫狀態(tài)而異，通常為7～21d，但也有報告指出部分病例的潛伏期可長達28d。初期階段患病牛出現(xiàn)輕微的體溫上升，但尚無明顯的皮膚病變。隨后牛只體溫急劇上升，可達41℃以上，出現(xiàn)抑郁、厭食、消瘦等癥狀。眼結(jié)膜和鼻黏膜可能出現(xiàn)炎癥，牛只會有大量唾液分泌，在體溫升高后的48h內(nèi)，皮膚開始出現(xiàn)病變。病情加重之后再患病，牛的病變皮膚出現(xiàn)直徑2～4cm的堅實、圓形結(jié)節(jié)，開始時可能局限于頭頸、四肢、乳房、生殖器和會陰部，隨后可能擴散至全身，結(jié)節(jié)可能破潰、壞死，并最終纖維化，這個過程可能持續(xù)數(shù)月，部分小結(jié)節(jié)可能自行消退。發(fā)病后期結(jié)節(jié)干癟、脫落，留下疤痕，脫落后的皮膚上可能存活有病毒，導(dǎo)致持續(xù)的感染狀態(tài)。病情嚴(yán)重之后，由于出現(xiàn)繼發(fā)性感染，如肺炎和乳腺炎，導(dǎo)致牛只消瘦、生產(chǎn)性能下降，恢復(fù)緩慢。懷孕母?？赡艹霈F(xiàn)流產(chǎn)或長時間不發(fā)情，犢?？沙霈F(xiàn)全身性結(jié)節(jié)，且癥狀可能更為嚴(yán)重。

三、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的病理學(xué)變化

病死牛解剖之后皮膚病變是牛結(jié)節(jié)性皮膚病的主要特征，病變初期，皮膚出現(xiàn)紅斑、瘙癢，隨后出現(xiàn)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈圓形或橢圓形，直徑約1～2cm，表面光滑，質(zhì)地堅硬。隨著病情發(fā)展，結(jié)節(jié)逐漸增大，數(shù)量增多，相鄰結(jié)節(jié)融合，形成大的結(jié)節(jié)，嚴(yán)重時，皮膚表面出現(xiàn)潰瘍、壞死，甚至脫落。腫大部位短淋巴結(jié)腫大、充血，隨后出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，隨著病情發(fā)展淋巴結(jié)發(fā)生壞死、液化，形成膿腫，膿腫破裂后，形成瘺管，排出膿液。另外，病毒還可以侵犯內(nèi)臟器官，如肺、脾、腎等，導(dǎo)致內(nèi)臟器官充血、水腫，隨后出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。隨著病毒的入侵內(nèi)臟器官發(fā)生壞死、纖維化，導(dǎo)致功能減退或喪失。

四、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的實驗室診斷

1、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的病毒中和試驗

在病毒綜合實驗過程中，需要提前準(zhǔn)備好牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒分離株、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒陽性免疫血清、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒陰性血清、細胞培養(yǎng)體系（Vero細胞或MDBK細胞）、細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)板、移液器、混勻器、孵箱。實驗操作期間首先將病毒分離株稀釋至合適的滴度，通常為100TCID50/0.1mL，然后將陽性和陰性血清分別稀釋預(yù)處理為1∶10，將病毒稀釋液與血清稀釋液等體積混合，并混勻，病毒與血清混合液在37℃下孵育1h，將孵育后的混合液接種到細胞培養(yǎng)板中，細胞培養(yǎng)板在37℃下培養(yǎng)5～7d。實驗結(jié)束之后觀察細胞培養(yǎng)板中是否存在細胞病變效應(yīng)（CPE），如細胞融合、變圓、脫落等，緊接著計算病毒在細胞培養(yǎng)中的TCID50，即引起50%細胞病變的病毒稀釋倍數(shù)，然后計算中和滴度，即病毒稀釋液中能被血清中和90%CPE的血清稀釋倍數(shù)。中和滴度=病毒稀釋倍數(shù)×（1+血清稀釋倍數(shù)），陽性免疫血清的中和滴度較高，表明血清中含有針對病毒的中和抗體顯示為陽性。陰性血清的中和滴度較低或不存在，表明血清中不含有針對病毒的中和抗體顯示為陰性。如果中和滴度介于陽性和陰性結(jié)果之間，表示為可疑，需要進一步檢測或重復(fù)試驗以確認(rèn)結(jié)果。

2、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的酶聯(lián)免疫吸附試驗

正式實驗操作之前需要準(zhǔn)備好牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒抗原、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒陽性血清、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒陰性血清、96孔ELISA板、阻斷液、洗滌液、二抗酶標(biāo)試劑、底物溶液、終止液、酶標(biāo)儀。實驗操作步驟是，將病毒抗原稀釋至1∶20濃度，加入ELISA板孔中，4℃過夜，用洗滌液洗滌ELISA板，去除未結(jié)合的抗原，加入阻斷液孵育，以阻斷非特異性結(jié)合位點，緊接著加入樣品（血清稀釋液）并孵育，使抗體與抗原結(jié)合，然后再次洗滌ELISA板，去除未結(jié)合的抗體，緊接著加入二抗酶標(biāo)試劑，其與樣品中的抗體結(jié)合，再次洗滌ELISA板，去除未結(jié)合的二抗酶標(biāo)，向其中加入底物溶液，使二抗酶標(biāo)顯色，最終加入終止液，停止酶促反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在特定波長（通常為450nm）下讀板。計算方法是樣品/陽性對照（S/P）比值=樣品吸光度值/陽性對照吸光度值，當(dāng)S/P比值≥0.5陽性結(jié)果，表明樣品中存在針對牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒的抗體，S/P比值lt;0.5陰性結(jié)果，S/P比值介于0.2和0.5之間疑似結(jié)果，需要進一步檢測或重復(fù)試驗以確認(rèn)結(jié)果。

3、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

實驗操作過程中涉及的試劑和設(shè)備主要有牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒特異性引物、qPCR試劑盒、樣品DNA、陽性對照DNA、陰性對照DNA、qPCR儀。根據(jù)qPCR試劑盒說明配制反應(yīng)混合物，包括引物、探針、DNA聚合酶和其他試劑。其中引物用于擴增LSD病毒基因組特定區(qū)域的DNA序列，設(shè)計應(yīng)基于已知的LSD病毒基因序列，以確保特異性。引物的序列和濃度應(yīng)根據(jù)實驗需求確定。探針通常標(biāo)記有熒光染料如FAM、ROX等，以便在PCR儀器上進行實時監(jiān)測，探針的序列應(yīng)與擴增產(chǎn)物中的特定序列互補。DNA聚合酶是PCR反應(yīng)的核心酶類，用于在PCR過程中合成新的DNA鏈，通常使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，如Taq聚合酶。緩沖液用于提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，維持酶的活性和穩(wěn)定性，根據(jù)所使用的PCR反應(yīng)體系和DNA聚合酶的要求確定。dNTPs即脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽，是PCR反應(yīng)的原料，用于合成新的DNA鏈。MgCl2鎂離子是DNA聚合酶的輔助因子，對PCR反應(yīng)的擴增效率有重要影響，MgCl2的濃度通常在0.5～2.0mM之間優(yōu)化。將樣品DNA、陽性對照DNA和陰性對照DNA加到反應(yīng)混合物中，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到qPCR儀中，根據(jù)試劑盒說明進行擴增，利用qPCR儀記錄每個擴增周期的熒光信號。樣品擴增曲線呈指數(shù)增長，且擴增閾值（Ct）值低于陽性對照的Ct值表示為陽性，樣品沒有明顯的擴增曲線，或擴增曲線呈線性增長，且Ct值高于陽性對照的Ct值表示為陰性，樣品的Ct值介于陽性和陰性結(jié)果之間，或擴增曲線呈弱陽性表示可疑需要進一步檢測或重復(fù)試驗以確認(rèn)結(jié)果。

五、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的疫病處置

我國針對牛結(jié)節(jié)性皮膚病這類動物疫病的處置主要依據(jù)相關(guān)法規(guī)、規(guī)章和標(biāo)準(zhǔn)進行。同時還需要詳細執(zhí)行《動物疫病報告制度》《動物防疫技術(shù)規(guī)范》《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》《動物及其產(chǎn)品檢疫規(guī)程》《病害動物及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》《動物防疫設(shè)施建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)》。發(fā)現(xiàn)牛結(jié)節(jié)性皮膚病的疫病后，應(yīng)立即向當(dāng)?shù)貏游镄l(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)報告，包括疫病發(fā)生的時間、地點、規(guī)模、癥狀、疑似病因等。當(dāng)?shù)貏游镄l(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)接到疫病報告后，應(yīng)立即組織專業(yè)人員進行診斷確認(rèn)，通過臨床癥狀觀察、病理組織學(xué)檢查、病毒分離鑒定來判定病情。對確診的牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫病，應(yīng)立即采取隔離和封鎖措施，將病牛及其接觸過的牛只進行隔離，限制牛只流動，防止疫病擴散，對病牛及其接觸過的牛只進行采樣檢測，采集血液、皮膚病變組織等樣本，進行病毒檢測和血清學(xué)檢測。檢測陽性的病牛，應(yīng)立即進行撲殺，采用掩埋或者焚燒處理方法進行無害化處置，防止疫病擴散。對疫病發(fā)生場所及其周邊環(huán)境進行消毒，堅持每天上午下午各消毒一次，推薦使用2%的過氧化氫、2%～5%的氫氧化鈉溶液、0.1%的過氧乙酸溶液，生石灰5%～10%的漂白粉溶液，加強動物防疫設(shè)施建設(shè)，提高防疫能力。疫病處置之后，應(yīng)該對所在地區(qū)的牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫病進行持續(xù)監(jiān)測和評估，掌握疫病動態(tài)，及時調(diào)整防疫措施。撲殺完成30d內(nèi)禁止疫病所在縣域的牛調(diào)出，各地在檢疫監(jiān)督過程中，應(yīng)該加強對牛結(jié)節(jié)性皮膚病的臨床癥狀檢查和血型檢測。同時要進一步加強疫病溯源，對疫病發(fā)生前30d內(nèi)引入本地區(qū)的牛和相關(guān)品種進行嚴(yán)格的溯源調(diào)查，分析疫病的主要來源，當(dāng)有明確證據(jù)表明是輸入牛引發(fā)的疫病之后應(yīng)該對輸出地牛群進行針對性的隔離觀察和樣品采集，開展流行病學(xué)調(diào)查，并嚴(yán)格落實疫病處置方案和衛(wèi)生消毒方案。

六、牛結(jié)節(jié)性皮膚病的預(yù)防措施

1、疫病所在區(qū)和相鄰區(qū)域的緊急免疫接種

疫病所在地區(qū)和相鄰的縣域所有牛養(yǎng)殖場應(yīng)該選擇國家批準(zhǔn)的山羊痘疫苗進行緊急免疫接種，接種劑量為山羊接種量的5倍，并在免疫接種7～14d之后，對牛群進行抗體水平監(jiān)測，保證抗體水平達標(biāo)。

2、預(yù)防期間對外引種規(guī)范化

在預(yù)防期間，對外引種需要嚴(yán)格執(zhí)行國家標(biāo)準(zhǔn)和引種檢疫規(guī)程，以防止疫病傳入。在引進牛只前，選擇有良好信譽、具備合法資質(zhì)的引種單位或個人進行引種，對引進地進行全面了解，掌握當(dāng)?shù)氐膭游镆卟　F醫(yī)防疫措施等信息，與引進地的獸醫(yī)部門溝通，了解當(dāng)?shù)氐臋z疫規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)，確保引進的牛只來源可靠，遵循相關(guān)法律法規(guī)。同時，及時向當(dāng)?shù)貏游镄l(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)申報，并提供牛只的來源、數(shù)量、品種、年齡、性別等信息。引進的牛只應(yīng)在指定的隔離場所進行隔離觀察，觀察期一般為45d，在隔離期間，對牛只進行健康檢查，采集血液、唾液、鼻咽拭子等樣本，進行病毒檢測、血清學(xué)檢測等，根據(jù)檢疫結(jié)果，對牛只進行相應(yīng)的防疫措施。如接種疫苗、進行疫病治療等。經(jīng)過隔離觀察、疫病檢測和防疫措施后，對符合要求的牛只進行審批，辦理相關(guān)手續(xù)，予以放行。

3、加強環(huán)境清理衛(wèi)生消毒

在疫病防控期間，養(yǎng)殖場環(huán)境清理消毒至關(guān)重要，消毒期間應(yīng)該詳細地評估疫病嚴(yán)重程度、受感染動物數(shù)量、潛在的傳播途徑，確定需要隔離和處理的區(qū)域，并要加強人員培訓(xùn)確保他們了解疾病、消毒程序和自身安全防護。選擇使用高效的消毒劑如10%的氫氧化鈉溶液、5%～10%的漂白粉，并準(zhǔn)備足夠的消毒劑，以滿足全場消毒的需要。確定清理時間表，確保所有受感染動物被移除，先使用高壓水槍清洗牛舍、設(shè)備、圍欄等，清理牛舍內(nèi)的糞便、墊料等有機物，緊接著使用高壓水槍噴灑消毒劑，確保所有表面都被覆蓋，對于難以清潔的表面和設(shè)備，使用消毒劑進行浸泡或噴灑，在消毒后，再次使用清水清潔所有表面，確保所有區(qū)域完全干燥，以防止消毒劑殘留造成傷害。消毒期間還是要詳細地記錄所有消毒過程，明確消毒劑種類、濃度、時間，監(jiān)控消毒效果，確保消毒徹底，消毒后，實施有效的生物安全措施，防止疾病再次傳入。

綜上所述，牛結(jié)節(jié)性皮膚病是近年來傳入我國的一種新型的接觸性病毒性傳染性疾病，目前已知該種病毒只能感染牛，包括了多種類的牛，發(fā)病率在30%～60%之間，死亡率在1%～10%。一旦受到疾病感染，養(yǎng)殖戶會面臨較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，所以需要飼養(yǎng)管理人員提高重視程度，要注重加強流行病學(xué)調(diào)查，明確該種疾病簡單有效的診斷方法，并加強生物安全防范，對于患病牛應(yīng)該立即進行撲殺處理，未發(fā)病牛群應(yīng)該持續(xù)進行血清檢測，并進行緊急免疫接種，保證抗體水平達標(biāo)，有效切斷病原傳播渠道，確保養(yǎng)殖安全。

（作者單位：814000青海省果洛州動物疫病預(yù)防控制中心）