基于表型性狀和SCoT分子標(biāo)記的白術(shù)種質(zhì)遺傳多樣性分析

摘要：為了評價筆者所在課題組自選126個白術(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性，利用表型性狀和SCoT標(biāo)記相結(jié)合的方法對126個白術(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，5個表型性狀變異系數(shù)范圍為17.23%～24.51%，其中變異系數(shù)最大的性狀為葉寬，變異系數(shù)最小的是葉長；5個性狀的多樣性指數(shù)范圍為1.71～2.53，葉長的多樣性指數(shù)最高；冠幅與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)。在歐氏距離為7.2處將126個白術(shù)單株聚為6類，其中第Ⅰ類表現(xiàn)出高株短窄葉型，第Ⅱ類表現(xiàn)出矮株短窄葉型，第Ⅲ類表現(xiàn)出高株長闊葉型。15條SCoT引物在126個白術(shù)種質(zhì)間共檢測出84個等位基因，平均每個引物可檢測5.60個，變化范圍為2～8個；PIC值變化范圍為0.63～0.86，平均為0.78。有效等位基因數(shù)范圍為1.31～2.01，平均值為1.31；Nei’s多樣性指數(shù)值為0.20～0.50，平均值為0.35，Shannon’s多樣性指數(shù)為0.36～0.81，平均值為0.57。Structure群體結(jié)構(gòu)分析表明，當(dāng)K=6時，ΔK最高，126個白術(shù)種質(zhì)中有87個材料的Q≥0.6，占所有供試材料的69.05%，說明各群體中大部分種質(zhì)親緣關(guān)系相對單一。本研究明確了126個白術(shù)種質(zhì)的表型特征和親緣關(guān)系，為指導(dǎo)親本選配和高效育種提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白術(shù)；表型性狀；SCoT；遺傳多樣性分析

中圖分類號：S567.23₊3.032" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0192-06

收稿日期：2024-04-03

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-21）；河南省重大科技專項（編號：221100310400）；河南省重點研發(fā)專項（編號：231111110800）；中央本級重大增減支項目（編號：2060302）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項基金（編號：2024ZC040）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興學(xué)科發(fā)展專項（編號：2024XK01）；河南省科技攻關(guān)項目（編號：242102110248、242102110260）。

作者簡介：董 薇（1985—），女，河北邢臺人，碩士，助理研究員，從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究，E-mail：dongwei720@qq.com。

通信作者：梁慧珍，博士，研究員，從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究，E-mail：lhzh66666@163.com；許蘭杰，副研究員，從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究，E-mail：xulanjie18@126.com。

中藥材白術(shù)來源于菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖，主要產(chǎn)于浙江、安徽、福建、四川、江西、湖南等，河南周口和商丘等地也有栽植^［1-2］。白術(shù)富含揮發(fā)油和多糖成分，其揮發(fā)油主要成分有蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、杜松酯和棕櫚酸等，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿等功能^［3-6］。白術(shù)作為我國一種常用大宗中藥材，具有2 000多年的栽培歷史。白術(shù)屬于異花授粉的多年生草本植物，生產(chǎn)上的白術(shù)品種多為農(nóng)家種，農(nóng)戶多自留、自繁、自用，長期以來忽視提純復(fù)壯和新品種選育，導(dǎo)致多代有性繁殖后代多混雜、品種質(zhì)量參差不齊^［6］。

種質(zhì)資源遺傳多樣性越高越有利于篩選優(yōu)異性狀，在資源應(yīng)用和開發(fā)方面具有的優(yōu)勢越強，因此開展中藥材種質(zhì)資源評價工作非常重要^［7-11］。中藥材種質(zhì)資源評價的方法較多，主要包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記技術(shù)^［12］。由于形態(tài)學(xué)標(biāo)記具有直觀、簡便的特征，DNA分子標(biāo)記具有精準(zhǔn)的特征，這2種技術(shù)相對應(yīng)用較多，劉逸慧等用12個ISSR標(biāo)記對浙江磐安86個白術(shù)個體和5個蒼術(shù)個體^［13］，孫靚等采用13條ISSR對356個樣品^［14］，王宗寬等采用20個RAPD技術(shù)對45個於術(shù)76、白術(shù)天臺和於術(shù)86個體進(jìn)行遺傳多樣性分析，均表明白術(shù)具有較高的遺傳多樣性^［15］。中藥材良種選育是保證藥材質(zhì)量的重要措施，而豐富的種質(zhì)資源將為新品種選育提供親本材料支撐。蔣小剛等采用14對SRAP引物對8個白術(shù)主產(chǎn)區(qū)的52個資源進(jìn)行分析，表明該批材料具有豐富的遺傳多樣性。為了評價筆者所在課題組自選的126個白術(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性，本研究分別從表型性狀和SCoT標(biāo)記對其進(jìn)行遺傳多樣性分析，為白術(shù)新品種選育及品質(zhì)改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

126個白術(shù)種質(zhì)均為自選材料，來自于河南、浙江等地方品種變異株，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所梁慧珍研究員鑒定為白術(shù)。資源收集后于2021年9月6日將種子播種于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)基地試驗田，3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，每份材料種植6行，行長2 m，行寬0.6 m，株距0.4 m。

1.1.2 試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Extraction Kit 36302-01，上海吐露港生物科技公司）、2×Tag Master Mix（深圳輝諾生物科技有限公司）、SCoT引物（河南尚亞生物有限公司合成）、瓊脂糖（Monad Biotech）^［16］。

1.1.3 儀器

電泳儀（北京六一DYY-3C型電泳儀）；高通量組織研磨儀（Heros-Mole TL2010S，鼎昊源科技）；凝膠成像儀（天能Tanon-2500）；超微量分光光度計（K5500 Plus）；PCR儀（Eppendorf AG型）；電子天平AL204（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

2022年8月11日，每份材料取5株中部新鮮葉片，用DNA提取試劑盒提取白術(shù)基因組DNA。DNA質(zhì)量用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，帶型模糊者重新提取基因組DNA，DNA原液在-20 ℃下保存?zhèn)溆茫褂们跋♂屩?0 ng/μL。

1.2.2 SCoT引物來源及PCR擴增

80條SCoT引物由河南尚亞公司合成。利用BZ24、BZ47、BZ73表型差異較大的種質(zhì)作為DNA模板對80對SCoT引物進(jìn)行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出15條SCoT條帶清晰、多態(tài)性較高、擴增穩(wěn)定的引物，用于126個白術(shù)種質(zhì)PCR擴增（表1）。

1.2.3 PCR擴增體系

SCoT-PCR體系中的擴增條件參考許蘭杰等的方法^［17］并略作修改，反應(yīng)體系總體積為10 μL，包括引物1.0 μL、5.5 μL 2×Tag Master Mix、1 μL DNA模板，2.5 μL ddH₂O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 表型性狀調(diào)查

2022年9月10—20日選取白術(shù)地上部分5個主要表型性狀進(jìn)行調(diào)查，包括株高（cm）、葉長（cm）、葉寬（cm）、莖粗（cm）、冠幅（cm）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進(jìn)行各個性狀的平均值、變異系數(shù)等計算；采用SPSS 25.0中 “ward法”進(jìn)行系統(tǒng)聚類；利用Popegen 1.32軟件計算多態(tài)性條帶百分比、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)等指標(biāo)；利用Structure 2.3.4進(jìn)行126個白術(shù)種質(zhì)居群分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

2.1.1 表型性狀變異系數(shù)和多樣性指數(shù)分析

本研究對126個白術(shù)栽培群體的株高、葉長、葉寬、莖粗和冠幅等5個表型性狀進(jìn)行觀察和分析（表2）。5個表型性狀平均值為0.64、0.71、0.50、0.53、0.69 cm，其變異系數(shù)范圍為18.04%～24.64%，平均為20.58%。其中變異系數(shù)最大的性狀為葉寬，變異系數(shù)最小的是葉長，變異系數(shù)全部大于15.00%。說明這5個表型性狀間存在較大變異，多樣性豐富，有利于后續(xù)的品種篩選。

2.1.2 表型性狀相關(guān)性分析

莖粗與葉寬呈極顯著負(fù)相關(guān)，冠幅與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)（表3）。

2.1.3 表型性狀的聚類分析

在歐氏距離為7.2處將126個白術(shù)單株聚為6類，第Ⅰ類包含24個單株，第Ⅱ類包含22個單株，第Ⅲ類包含6個單株，第Ⅳ類包含37個單株，第Ⅴ類包含15個單株，第Ⅵ類包含22個單株。對6個居群的株高、葉長、葉寬、莖粗和冠幅等性狀進(jìn)行分析，結(jié)果表明，第Ⅰ類24個單株的5個表型性狀的平均值為65.60、10.31、2.55、0.42、11.50 cm，變幅為52.20～76.40、6.90～14.60、1.40～3.62、0.28～0.55、8.75～15.60 cm，表現(xiàn)出高株短窄葉型，其中BZ110的株高為 76.40 cm，BZ47的株高為52.20 cm。第Ⅱ類22個單株的5個表型性狀的平均值為50.13、10.16、3.19、0.39、11.66 cm，變幅為40.10～60.10、7.20～12.20、2.30～4.10、0.26～0.52、8.65～12.25 cm，表現(xiàn)出矮株短窄葉型，其中BZ24的株高為40.10 cm，BZ49的株高為60.10 cm；BZ118葉長為7.20 cm，BZ91葉長為12.20 cm。第Ⅲ類6個單株的5個表型性狀的平均值為64.83、11.85、5.14、0.27、9.77 cm，變幅為50.60～90.80、10.80～15.80、4.02～6.20、0.18～0.40、7.40～13.60 cm，表現(xiàn)出高株長闊葉型，其中BZ123的株高為90.80 cm，BZ73的株高為50.60 cm、BZ125的冠幅為7.40 cm，BZ73的冠幅為13.60 cm，BZ73的葉寬為6.20、BZ125的葉寬為4.02。第Ⅳ類37個單株的5個表型性狀的平均值為61.61、11.86、2.91、0.55、13.64 cm，變幅為45.30～81.70、8.60～15.00、2.00～4.20、0.39～0.84、10.00～15.95 cm，表現(xiàn)出莖粗最大，其中BZ29的莖粗為0.84 cm。第Ⅴ類15個單株的5個表型性狀的平均值為51.00、13.98、2.92、0.38、13.44 cm，變幅為31.55～66.00、12.40～16.50、2.00～3.70、0.30～0.44、8.90～16.00 cm。第Ⅵ類14個單株的22個表型性狀的平均值為53.19、12.46、3.30、0.46、16.44 cm，變幅為40.10～65.20、10.00～16.50、2.30～4.40、0.39～0.60、14.35～19.05 cm（表4）。

2.2 分子遺傳多樣性分析

2.2.1 SCoT標(biāo)記分析

以120個白術(shù)種質(zhì)為材料，采用15個SCoT標(biāo)記進(jìn)行分析。結(jié)果（表5）表明 15個SCoT標(biāo)記在126個白術(shù)種質(zhì)間可獲得清晰可辨條帶84條，其中多態(tài)性條帶79條，多態(tài)性條帶比率占94.05%；多態(tài)性條帶數(shù)范圍在2～8個，平均為5.27個。各引物多態(tài)性指數(shù)變化范圍在0.63～0.86之間，平均為0.78，其中SCoT16、SCoT54、SCoT23、SCoT03、SCoT20、SCoT37、SCoT53等的多態(tài)性指數(shù)大于0.80。15個標(biāo)記的有效等位基因數(shù)變化范圍為1.31～2.01，平均為1.31；Nei’s基因多樣性指數(shù)變化范圍在0.20～0.50之間，平均為0.35；Shannon信息指數(shù)變幅為0.36～0.81，平均為0.57。表明126份白術(shù)單株間存在較高的遺傳多態(tài)性。

2.2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

參考余永亮等方法，采用STRUCTURE軟件對126個白術(shù)種質(zhì)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)K=6時，峰值最高，表明分為6個類群更為合理（圖1）。第Ⅰ類為紅色部分，包含32個材料^［18］。第Ⅱ類為綠色部分，包含24個材料；第Ⅲ類為深藍(lán)色部分，包含16個材料。第Ⅳ類為黃色部分，包含18個材料。第Ⅴ類為紫色部分，包含20個材料。第Ⅵ類為淺藍(lán)部分，包含16個材料。

126個白術(shù)單株在各個群體中的Q值分布見表6。126個白術(shù)單株中有87份材料Q≥0.6，占所有供試材料的69.05%；Q≥0.6、≥0.8、≥0.9的個體分別有35、31、21個，分別占27.78%、24.60%、16.67%，說明各群體中大部分單株親緣關(guān)系相對單一。

3 討論與結(jié)論

表型性狀具有直觀、便于觀察的特征，是種質(zhì)資源重要的評價指標(biāo)。本研究對自選的126個白術(shù)種質(zhì)進(jìn)行變異系數(shù)和多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，5個表型性狀的變異系數(shù)范圍為18.04%～24.64%，平均為20.58%；葉寬和莖粗變異系數(shù)最大，變異系數(shù)為24.64%和23.37%，與楊成前等得出的結(jié)論有一定的差異，株高、葉長、葉寬、莖粗、冠幅的變異系數(shù)為22.43%、10.47%、26.36%、20.69%、10.61%^［18］。5個表型性狀的多樣性指數(shù)范圍為1.71～2.53 可以利用性狀的變異幅度和多樣性指數(shù)來選育新品種。莖粗與葉寬呈極顯著負(fù)相關(guān)，冠幅與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)。通過系統(tǒng)聚類聚為6類，第Ⅰ類為高株短狹葉型，其中BZ110的株高為 76.40 cm。第Ⅱ類為矮柱短狹葉型，其中BZ24的株高為40.10 cm BZ91葉長為12.20 cm。 第Ⅲ類為高株長闊葉型，其中BZ123的株高為90.80 cm、BZ73的葉寬為6.20 cm。第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類群為中間型。

由于表型性狀易受土壤、水分、溫度、肥料等因子的影響^［19-23］，采用DNA分子鑒定將更加精準(zhǔn)，本研究進(jìn)一步采用SCoT分子鑒定技術(shù)對126個白術(shù)種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。此外，本研究還采用15個SCoT引物對126個白術(shù)種質(zhì)進(jìn)行PCR擴增，多態(tài)性條帶比率占94.05%，每條引物擴增條帶變化范圍在3～8個之間，平均為5.60個；多態(tài)性條帶數(shù)范圍在2～8個之間，平均為5.27個；各引物多態(tài)性指數(shù)變化范圍在0.63～0.86之間，平均為0.78；有效等位基因數(shù)變化范圍為1.31～2.01，平均為1.31；Nei’s基因多樣性指數(shù)變化范圍在0.20～0.50之間，平均為0.35；Shannon信息指數(shù)變幅為0.36～0.81，平均為0.57。表明126份白術(shù)個體間存在較高的遺傳多態(tài)性，采用SCoT標(biāo)記在白術(shù)中具有多態(tài)性，可以用于白術(shù)基因型鑒定。

STRUCTURE軟件作為劃分種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)的主要方法，已在菊花、枸杞等中藥材中被廣泛應(yīng)用。本研究進(jìn)一步將126個白術(shù)種質(zhì)進(jìn)行STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)分析，在K=6時，ΔK最大，可將126個白術(shù)種質(zhì)劃分味6個類群，分別包含32、24、17、18、20、29個材料^［24-25］。研究表明，STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)中的Q值可以用來判斷供體材料的血緣關(guān)系的純度。在本研究中，126個白術(shù)單株中Q≥0.6、0.8、0.9的個體分別有35、31、21個，分別占27.78%、24.60%、16.67%，共有87份材料Q≥0.6，占所有供試材料的69.05%，說明各群體中大部分單株親緣關(guān)系相對單一。

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