基于混池高通量測序的花生含油量相關(guān)基因初定位

摘要：為開發(fā)花生高油相關(guān)分子標(biāo)記，促進(jìn)花生高油育種，并提高我國食用油自給率，以普通油酸含量高油花生品種HFLS與3個(gè)高油酸花生品種（系）花育665、花育668、FB4為親本搭配4個(gè)雜交組合，選擇含油量遺傳規(guī)律相對簡單且主基因遺傳率最高的HFLS×花育665組合，利用F₂群體構(gòu)建各包括30個(gè)個(gè)體的極端高油和極端低油混池，連同親本HFLS和花育665進(jìn)行高通量測序。將花生含油量基因初步定位在A02和A05染色體上，候選區(qū)間總長度分別為5.3、5.1 Mb。在候選區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)119對SNP和InDel引物，篩選出雙親間具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記和SNP標(biāo)記共14對；利用F₂群體驗(yàn)證這14對標(biāo)記，經(jīng)單標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，A02染色體上的4對標(biāo)記（Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65和Chr02-34）和A05染色體上的1對標(biāo)記（Chr05-80）與花生含油量顯著相關(guān)，表型變異解釋率分別為46.4%、33.2%、34.8%、31.0%和28.3%。其中，標(biāo)記Chr02-65、Chr02-7、Chr02-25和Chr02-34所對應(yīng)的物理位置為A02染色體87 578 082～88 550 841 bp之間，區(qū)間大小約為0.97 Mb，區(qū)間內(nèi)基因?yàn)?7個(gè)。本研究定位區(qū)間與前人報(bào)道的無重疊，為花生高油分子育種提供了新的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：花生；主基因＋多基因；含油量；BSA；基因定位

中圖分類號：S565.201；S565.203" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0051-06

收稿日期：2024-05-17

基金項(xiàng)目：國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-13）；山東省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（編號：SDNYXTTG-2024-01）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程人才類任務(wù)（引進(jìn)國內(nèi)高層次人才）（編號：CXGC2024F20）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（編號：CXGC2024D19）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2022TZXD0031）；新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（編號：2022A02008-3）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（編號：2020B020219003）。

作者簡介：樊美玉（1998—），女，吉林長春人，碩士研究生，主要從事花生品質(zhì)遺傳育種研究。E-mail：1026213557@qq.com。

通信作者：姜春姣，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事花生品質(zhì)改良研究。E-mail：qaujcj@163.com。

我國食用油短缺，食用油自給率不足40%?；ㄉ怯?、食、蔬兼用及比較優(yōu)勢的經(jīng)濟(jì)作物。在主要油料作物中，花生單位面積產(chǎn)油量最高，為油菜的2倍、大豆的4倍。在闡明花生高油性狀遺傳規(guī)律基礎(chǔ)上定位花生高油基因，將為培育高油花生品種提供技術(shù)支撐，對于保障我國食用油脂供應(yīng)安全、降低對外依存度具有重要意義。

關(guān)于花生含油量遺傳規(guī)律和相關(guān)數(shù)量性狀基因座（QTL）定位已有研究報(bào)道。不同研究者對花生含油量遺傳規(guī)律研究的結(jié)論有所不同。于海洋等以農(nóng)大D666為中心親本配置4個(gè)雜交組合及正反交構(gòu)建F₂群體，利用主基因加多基因遺傳模型分析花生含油量遺傳效應(yīng)，結(jié)果表明不同組合受3種遺傳模式控制，存在多個(gè)微效基因累加效應(yīng)^［1］。牟大林等構(gòu)建5個(gè)家系世代群體研究花生含油量的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)含油量的遺傳模型為加性-顯性多基因，主要受多基因遺傳控制^［2］。陶順玉等利用親本徐花13和中花6號2個(gè)含油量差異顯著的品種通過測序開發(fā)插入缺失（InDel）標(biāo)記并構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，將和含油量相關(guān)的QTL定位于A08染色體 1.2 Mb 區(qū)段內(nèi)，表型變異解釋率為11.21%^［3］。曲藝偉利用濰花8號×12L49的雜交組合構(gòu)成140個(gè)F₂分離群體，通過遺傳圖譜定位3個(gè)QTL，表型變異解釋率在5.50%～10.48%之間^［4］。張新友等以鄭8903×豫花4號的215個(gè)重組自交系群體構(gòu)建遺傳圖譜定位到2個(gè)QTL，表型變異解釋率分別為5.25%和8.24%^［5］。

相較于傳統(tǒng)QTL定位方法，集群分離分析（bulked segregant analysis，BSA）法定位更加快速、準(zhǔn)確。BSA法是可以快速確定候選區(qū)間、識別影響目的性狀的基因或遺傳位點(diǎn)的定位方法，利用具有極端表型的少量個(gè)體構(gòu)建混池，減少大量人力、試劑等耗費(fèi)成本，增加標(biāo)記篩選效率，非常實(shí)用，應(yīng)用廣泛，但在花生含油量基因定位上鮮有報(bào)道。

本研究以高油花生和普通含油量花生為親本雜交，構(gòu)建F₂分離群體，通過BSA法對控制花生含油量的基因進(jìn)行初定位研究，開發(fā)相關(guān)標(biāo)記，以促進(jìn)花生高油育種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以高油普通油酸花生品種HFLS為中心親本，與高油酸品種（系）花育665（HY665）、花育668（HY668）、FB4搭配4個(gè)雜交組合。父母本于2021年5月種植于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站雜交圃（120.51°E，36.81°N），9月收獲F₁代種子。通過花生轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記（ahTE）鑒定的真雜種，于2022年5月種植于萊西試驗(yàn)站田間，2022年9月收獲F₂代種子。各組合F₂代種子粒數(shù)如下：C2105（FB4×HFLS）475粒，C2106（HFLS×FB4）662粒，C2107（HFLS×HY668）619粒，C2108（HFLS×HY665）584粒。

1.2 花生含油量測定與分析

利用 MPA型傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克光學(xué)有限公司） 采集花生籽仁光譜。單粒花生重復(fù)掃描3次，每次掃描前將樣品翻轉(zhuǎn)。采用近紅外光譜儀自帶的OPUS 7.5軟件配合團(tuán)隊(duì)自建近紅外模型由光譜儀導(dǎo)出樣品含油量數(shù)據(jù)，取3次重復(fù)的平均值。

對這4個(gè)組合的F₂代個(gè)體進(jìn)行近紅外分析測定，采用數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳分析R軟件包SEA v2.0^［6］研究花生含油量遺傳規(guī)律，選擇遺傳規(guī)律相對簡單且主基因遺傳率高的雜交組合用于BSA。

1.3 基因組DNA提取、極端混池的構(gòu)建和測序分析

從選中的組合F₂群體中挑選30個(gè)極端高油和30個(gè)極端低油個(gè)體，連同2個(gè)親本HFLS和HY665，取其子葉用十二烷基硫酸鈉（SDS）法進(jìn)行DNA提取，將30個(gè)極端高油和30個(gè)極端低油的子葉DNA分別等量混合，構(gòu)建高油和低油混池。對父母本及2個(gè)極端池共4個(gè)DNA樣品進(jìn)行測序分析。DNA檢測合格后，通過Covaris儀器隨機(jī)打斷成長度為 350 bp 的片段，完成文庫制備，文庫質(zhì)檢合格后，根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求在 Illumina 平臺進(jìn)行測序。BSA全流程包括質(zhì)控（對下機(jī)得到的Raw data進(jìn)行質(zhì)控得到Clean data）、參考基因組比對（Clean data與選定的參考基因組進(jìn)行比對）、變異檢測［根據(jù)比對結(jié)果進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）和InDel位點(diǎn)檢測］、標(biāo)記篩選（根據(jù)變異位點(diǎn)質(zhì)量、測序深度、親本基因型差異情況等條件對標(biāo)記進(jìn)行過濾）、性狀定位（針對經(jīng)上述處理后獲得的位點(diǎn)，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行混池間等位頻率的差異分析，并定義顯著區(qū)間及區(qū)間內(nèi)的候選基因）。過濾不合格read，對得到的clean read，使用Sentieon軟件進(jìn)行參考基因組比對分析，進(jìn)行SNP和InDel位點(diǎn)檢測和基因注釋，確定變異位點(diǎn)在基因組上的區(qū)域及突變類型。

1.4 花生含油量相關(guān)基因定位

篩選親本間純合且有差異的位點(diǎn)，基于篩選出來的多態(tài)性標(biāo)記，計(jì)算2個(gè)子代在這些標(biāo)記位點(diǎn)的SNP/InDel-index，并過濾掉子代存在缺失的位點(diǎn)，選取子代indexgt;0.3的位點(diǎn)，按照滑窗的方法對計(jì)算獲得的SNP/InDel-index、ΔSNP/InDel-index及相關(guān)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行擬合，取窗口內(nèi)的平均值作為擬合后的值，其中窗口大小和使用步長根據(jù)基因組大小確定，滑窗時(shí)使用的窗口大小為1 Mb，使用的步長大小為100 kb。選擇99%或者95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區(qū)間。利用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對候選基因進(jìn)行篩選和功能預(yù)測。

1.5 分子標(biāo)記的開發(fā)

篩選SNP/InDel差異位點(diǎn)，進(jìn)一步在BSA初定位區(qū)間內(nèi)提取該變異位點(diǎn)前后150～500 bp的序列，在候選區(qū)間內(nèi)變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)均勻分布的引物。引物長度20～25 bp，T_m為55～65 ℃，GC含量 40%～60%，交由青島蔚來生物科技有限公司和通用生物（安徽）股份有限公司合成。用合成的引物對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（20 μL）為TaqMix 10 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各 1 μL、ddH₂O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)或送青島蔚來生物科技有限公司測序。瓊脂糖凝膠電泳采用3%濃度，電壓90 V，電泳時(shí)間30～120 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 用于花生含油量相關(guān)基因初定位的雜交組合選擇

對選中的4個(gè)組合的含油量遺傳分析，結(jié)果（表1）表明，C2105和C2106最適遺傳模型均為 2MG-EA（2對主基因等加性效應(yīng)），C2107和C2108最適遺傳模型均為2MG-A（2對主基因加性效應(yīng)），主基因遺傳率分別為77.52%、41.41%、80.18%和97.42%。在4個(gè)組合中，組合C2108含油量遺傳規(guī)律較簡單，主基因遺傳率最高，因此用于下一步的基因定位。

2.2 C2108組合雙親及含油量高低池基因組重測序和變異位點(diǎn)檢測

對C2108組合2個(gè)F₂群體極端池（極端高油池、極端低油池）和雙親（HFLS、HY665）進(jìn)行全基因組測序（表2），得到read總條數(shù)分別為238 468 318、249 325 338、670 132 052、612 796 102 bp，與比對read數(shù)基本一致，與參考基因組的比對率（mapping rate）均在99%以上，4個(gè)樣品的GC含量在 36.76%～38.32%之間，覆蓋率1X和4X均在96%以上。

檢測到親本HFLS和HY665之間多態(tài)性位點(diǎn)SNP和InDel分別共獲得911 743、307 264個(gè)，SNP位點(diǎn)的數(shù)量顯著多于InDel位點(diǎn)的數(shù)量，其中SNP和InDel分別共258 456、827 702個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分布在基因間區(qū)，分別共11 488、16 297個(gè)位點(diǎn)位于基因上游。非同義變異位點(diǎn)SNP為10 282個(gè)，同義突變位點(diǎn)數(shù)量為 5 907 個(gè)。

2.3 對C2108組合含油量區(qū)域關(guān)聯(lián)和候選基因篩選

ΔSNP/InDel-index曼哈頓圖如圖1所示，選擇99%或者95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區(qū)間，最終得到2號染色體區(qū)域83 350 000～88 650 000 bp 和5號染色體區(qū)域23 800 000～28 900 000 bp，區(qū)域總長度分別為5.3、5.1 Mb，分別包含148、251個(gè)基因。

2.4 候選區(qū)間內(nèi)分子標(biāo)記分析

根據(jù)BSA結(jié)果，在2號和5號染色體定位區(qū)間共設(shè)計(jì)119對PCR引物，利用親本HFLS和HY665的DNA篩選出雙親間有多態(tài)性的InDel標(biāo)記和SNP標(biāo)記共14對（表3）。

其中，從初期設(shè)計(jì)的20對InDel引物中篩選出3對（引物Chr02-55、Chr02-65和Chr05-80），其PCR產(chǎn)物條帶清晰且目標(biāo)片段大小差異顯著。進(jìn)一步利用這3對引物對F₂代高油和低油花生各10個(gè)樣品進(jìn)行基因型分析。圖2為其中2對InDel引物擴(kuò)增產(chǎn)物的膠圖。

根據(jù)染色體定位區(qū)間內(nèi)特異位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的SNP引物，用雙親DNA擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上呈清晰可辨的單一條帶，則直接進(jìn)行Sanger測序，利用DNAstar比對序列，最終發(fā)現(xiàn)2號染色體上雙親PCR產(chǎn)物目標(biāo)位點(diǎn)存在差異的SNP引物有11對，有堿基差異的進(jìn)一步用子代驗(yàn)證（圖3、圖4）。

根據(jù)F₂代個(gè)體基因型與表型數(shù)據(jù)，分別對14個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，最終得到5個(gè)位點(diǎn)不同基因型間含油量存在顯著或極顯著差異（表4）。

分析結(jié)果（表4）表明，有5個(gè)標(biāo)記（Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65、Chr02-34和Chr05-80）經(jīng)t檢驗(yàn)可知P值均小于0.05。其中1個(gè)標(biāo)記（Chr02-7）的P值小于0.01。相關(guān)系數(shù)的平方值即為表型解釋變異率，經(jīng)相關(guān)性分析可知，標(biāo)記Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65、Chr02-34和Chr05-80的表型解釋變異率分別為46.4%、33.2%、34.8%、31.0%和28.3%。

其中標(biāo)記Chr02-65、Chr02-7、Chr02-25、Chr02-34對應(yīng)的物理位置為2號染色體 87 578 082～88 550 841 bp之間，該區(qū)間內(nèi)基因共37個(gè)。對這4個(gè)標(biāo)記物理位置所對應(yīng)的區(qū)間內(nèi)基因通過BLAST軟件多個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果推測蛋白質(zhì)編碼基因，對該區(qū)域內(nèi)的基因在GO數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）中查找基因注釋。其中3個(gè)基因在基因注釋文庫中功能未知，GO富集到的基因分細(xì)胞定位、分子功能、生物學(xué)過程3類，發(fā)現(xiàn)參與蛋白質(zhì)的合成代謝類基因最多，其余富集到的基因與氧化還原過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和木質(zhì)素分解代謝過程等相關(guān)。經(jīng)BLAST軟件分析基因注釋結(jié)果顯示，基因W9RD48可能參與脂質(zhì)代謝過程，其他基因可能存在幾種功能或者參與多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)合成過程，更多的功能還需進(jìn)一步探索。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于花生含油量相關(guān)QTL鑒定已有多個(gè)研究報(bào)道。張勝忠等利用花育36號和高油品系6-13為親本，構(gòu)建了181個(gè)重組自交系，通過SNP及SSR標(biāo)記的連鎖圖上定位到5個(gè)QTL，表型變異解釋率（PVE）為16.53%～17.39%^［7］；Jadhav等利用雜交組合TMV2×TMV2-NLM構(gòu)建出含432個(gè)RIL家系，采用700個(gè)標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜定位到11個(gè)QTL，其中含2個(gè)主效QTL^［8］；Pandey等利用2個(gè)RIL群體研究花生含油量QTL定位分別檢測到10、8個(gè)QTL，PVE分別為3.03%～25.52%和3.93%～14.07%^［9］。李玉穎等利用BSA法定位到花生籽仁含油量相關(guān)區(qū)間位于A01的 15.17～18.38 Mb區(qū)間內(nèi)^［10］，Gomez等利用BSA-seq法定位到花生含油量1個(gè)QTL，PVE達(dá)到11.03%^［11］。Sun等利用豫花15×W1202構(gòu)建出含329個(gè)家系的RIL群體對花生品質(zhì)性狀進(jìn)行全基因組測序，檢測到和含油量相關(guān)的主效QTL位于Arahy.05的6.34～7.83 Mb^［12］，同樣的，Wilson等研究定位到Arahy.05的21.79 Mb位置上^［13］，但均與本研究所定位到A05染色體候選區(qū)間并無重疊，說明本研究候選區(qū)域內(nèi)存在新的QTL位點(diǎn)，可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究利用HFLS×HY665為雜交組合構(gòu)建F₂分離群體，針對該組合進(jìn)行BSA定位，通過分子標(biāo)記縮小區(qū)間，為進(jìn)一步研究花生含油量相關(guān)基因和實(shí)施標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］于海洋，李玉穎，呂玉英，等. 多群體解析高油花生籽仁含油量的遺傳效應(yīng)［J］. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2021，43（3）：487-494.

［2］牟大林，韓 笑，李雪瑩，等. 花生主要品質(zhì)性狀的主基因+多基因遺傳分析［J］. 花生學(xué)報(bào)，2021，50（1）：41-44，49.

［3］陶順玉，吳 貝，劉 念，等. 花生InDel標(biāo)記開發(fā)及其在含油量QTL定位中的應(yīng)用［J］. 作物學(xué)報(bào)，2023，49（5）：1222-1230.

［4］曲藝偉. 花生脂肪酸QTL初步定位［D］. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：1-50.

［5］張新友，韓鎖義，徐 靜，等. 花生主要品質(zhì)性狀的QTLs定位分析［J］. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2012，34（3）：311-315.

［6］王靖天，張亞雯，杜應(yīng)雯，等. 數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳分析R軟件包SEA v2.0［J］. 作物學(xué)報(bào)，2022，48（6）：1416-1424.

［7］張勝忠，胡曉輝，苗華榮，等. 栽培種花生含油量QTL定位與上位性互作分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2021，36（1）：27-35.

［8］Jadhav M P，Gangurde S S，Hake A A，et al. Genotyping-by-sequencing based genetic mapping identified major and consistent genomic regions for productivity and quality traits in peanut［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12：668020.

［9］Pandey M K，Wang M L，Qiao L X，et al. Identification of QTLs associated with oil content and mapping FAD2 genes and their relative contribution to oil quality in peanut （Arachis hypogaea L.）［J］. BMC Genetics，2014，15：133.

［10］李玉穎，于海洋，呂玉英，等. 基于BSA重測序定位花生含油量相關(guān)基因位點(diǎn)［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，53（1）：1-6.

［11］Gomez Selvaraj M，Narayana M，Schubert A M，et al. Identification of QTLs for pod and kernel traits in cultivated peanut by bulked segregant analysis［J］. Electronic Journal of Biotechnology，2009，12（2）：3-4.

［12］Sun Z Q，Qi F Y，Liu H，et al. QTL mapping of quality traits in peanut using whole-genome resequencing［J］. The Crop Journal，2022，10（1）：177-184.

［13］Wilson J N，Chopra R，Baring M R，et al. Advanced backcross quantitative trait loci （QTL） analysis of oil concentration and oil quality traits in peanut （Arachis hypogaea L.）［J］. Tropical Plant Biology，2017，10（1）：1-17.