實驗生物種質資源的保護和應用研究

關鍵詞：松滋青皮豆；致突變性；種質資源保護

前言

蠶豆是經典的遺傳實驗生物，蠶豆根尖是理想的遺傳毒性測試材料，它首先應用于染色體畸變試驗，隨后擴展到微核試驗。1959年，放射生物學家就開始用蠶豆的根尖細胞來進行X-射線的遺傳損傷研究，Degrassi和Rizzoni研究X-射線、絲裂霉素C等多種誘變劑對蠶豆根尖（次生根）微核的效應。1983年陳光榮等在國內首先建立蠶豆根尖微核試驗法，并選3種農藥對14種蠶豆的敏感性進行篩選和統(tǒng)計學分析，松滋青皮豆是理想的高敏感性品種，并對青山湖的水質污染進行了檢測?！董h(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（生物監(jiān)測（水環(huán)境）部分）規(guī)范方法，《水生生物監(jiān)測手冊》，《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版）均有編人。

《水質致突變的鑒別蠶豆根尖微核試驗法》（HJ 1016-2019），適用于環(huán)境樣品地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的致突變性鑒別。標準采用的松滋青皮豆來源均有可靠證明，可溯源至華中師范大學原生物系，以初生根為受試器官，經長期純化保種，遺傳特性相對穩(wěn)定。葛成巖、張倩等對蠶豆根尖微核試驗的質量保證如受試物種、參比毒物等進行了研究。為更好地保護種質資源和維持試驗穩(wěn)定性，從松滋青皮豆的種植、豆種挑揀到微核試驗受試豆粒選擇等全流程做了質量控制研究。

1種質資源保種場的周邊環(huán)境調查

松滋青皮豆原產于湖北省松滋縣，是一種中粒（千粒重600g～1100g之間為中粒蠶豆）綠色蠶豆，對水胺硫磷40%乳劑1：800稀釋倍數微核率為89.33 +9.73，1：1600稀釋倍數微核率為59±7.37敏感性高，對藥劑耐受率較強，可在較廣泛的濃度范圍檢測誘變劑活力。2013年后，松滋青皮豆的保種傳代由江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心負責，隨后通過實地踏勘和篩選，在自然環(huán)境較好的溧陽大溪水庫邊建立了專門的保種場，灌溉水和土壤質量分別符合《農田灌溉水質標準》（GB/T 5084-2005）和《土壤環(huán)境質量標準》（GB/T 15618-1995）中的二級標準，每年種植一季。

2019年后種植面積擴大，種植中不得使用農藥、化肥及其他化學物質，手工除草、除蟲，周邊田地不得種植其他品種蠶豆。收獲后曬干，并挑選無蟲眼、種皮完整的松滋青皮豆，并對收獲的松滋青皮豆進一步進行精選，區(qū)分等級后，進行低溫保存。

周邊環(huán)境的變化有可能會影響種質資源的穩(wěn)定性，定期對溧陽保種場周邊進行實地踏勘，2023年踏勘了毛尖村、彭家村、彭東村、東山岕和小山岕等幾個村莊的種植田地狀況，并同時調查了農戶種植情況。具體踏勘情況見表1。

2種質資源的保護

2.1種質資源種植和保存

松滋青皮豆在中國大部分地區(qū)均可引種繁殖，可根據當地氣候條件合理安排種植時間。但實驗用豆種對種植土壤和周邊環(huán)境有較高要求：種植地應選擇生態(tài)條件較好，無工業(yè)“三廢”、農藥和放射性污染的場地；為保持品系純正，避免與其他品種雜交，種植地周邊1km2范圍內不得混種其他蠶豆品種，最好每年輪作種植，維持土壤肥力和生產力．減少土地疲勞，控制病蟲害；注意保持較寬行距，避免過密導致植株相互遮蔭，影響光照，導致植株生長過高、發(fā)生倒伏；為保持較低的本底微核率，種植期間不施用化肥農藥，手工除草除蟲，對種植人員要求較高。豆種的保存技術難點：當豆莢變黃、籽粒飽滿時，選擇在晴天進行收獲，及時晾曬、脫粒，剛收獲的豆種含有較多的水分，而潮濕的豆種的呼吸作用比較旺盛，消耗的有機物較多，同時還會釋放大量的熱，容易使豆種發(fā)熱發(fā)霉影響種子的壽命，曬干后可抑制呼吸作用，從而延長豆種的保存時間；曬干后需人工挑選，因豆種種植中未施藥，病蟲豆種較多，挑選中需要技術人員耐心細致，選擇大小均一、顆粒飽滿、無明顯缺損、無病蟲害、表皮青綠或青棕色的豆種；挑選好的豆種裝入透氣的牛皮紙袋或大信封內于專用冰箱4℃以下冷藏，不建議儲存在塑料袋或密閉容器內，存儲環(huán)境避免濕度過大，定期檢查豆種存儲狀態(tài)；豆種保存期不超過2年，如保存年限過長等原因導致豆種出根率偏低時，可挑選經催根后生長情況良好的豆種栽培復壯。

2.2種質資源篩選和預處理

松滋青皮豆收獲后，對有蟲洞、霉變的及時挑揀，并剔除過大過小的豆粒。通過隨機抽取1000粒松滋青皮豆進行18組稱重測定，每千粒重一般為706g～787g，檢測結果見表2。

經浸種、催根后，統(tǒng)計總豆種數，及霉變、不出根、根尖枯死的豆種數，出根率=（總豆種數一霉變、不出根、根尖枯死的豆種數）／總豆種數×100%，一般應≥90%（《糧食作物種子第2部分：豆類》（GB/T4404.2-2010）中要求蠶豆種子發(fā)芽率≥90%），試驗前將松滋青皮豆自然晾曬2～3天有利于出根。

2.3種質資源試驗要求

試驗用松滋青皮豆，須挑選顆粒飽滿、豆皮青綠或青棕色、大小一致、無病蟲害、表面無明顯缺損的豆種。同時，受試生物質量應滿足試驗的要求，主要指標見表3。

3種質資源的應用

以松滋青皮豆為實驗材料的方法標準已頒布，用于對水質致突變效應進行鑒別，可作為有關水環(huán)境、垃圾填埋場風險評估指南、規(guī)范等管理標準的檢測技術方法支撐。作為表征環(huán)境綜合遺傳毒性效應的技術方法可應用于農灌水、淡水湖泊及農藥、金屬冶煉、印染、化工等污染風險較高的行業(yè)污水等環(huán)境污染監(jiān)測，對地表水可能存在的風險和污水排放的綜合毒性及致突變性進行監(jiān)管。張茂榮等應用根尖細胞微核實驗分析了武漢市城區(qū)9個自然水體的致突變性。許霞等對常州市某廢棄農藥廠污染場地6個不同區(qū)域的土壤樣品進行了蠶豆根尖微核遺傳毒性試驗，其中2個點位土壤浸出液毒性最高，該研究為污染場地進行綜合評價與風險評估提供依據。各地環(huán)境監(jiān)測中心、澳門自來水等均有購置或申請松滋青皮豆進行水質致突變試驗。因此，以松滋青皮豆為實驗材料的蠶豆微核試驗法對水環(huán)境風險評估、污水排放等管理過程的環(huán)境介質致突變性監(jiān)管具有較大的應用價值。

該方法標準適用范圍較廣，測試材料易獲得，成本低，方法簡易、快速，對監(jiān)測硬件條件的要求不高，基層環(huán)境監(jiān)測站均可開展此項工作，各級監(jiān)測站在該項目能力的形成上應更注重人員和管理，積累監(jiān)測人員的實際操作經驗，不斷提高分析測試水平，控制受試生物的質量，強調陽性、陰性等對照試驗的過程控制，確保監(jiān)測質量，有效服務環(huán)境管理。

4結論

蠶豆根尖是較理想的遺傳毒性測試材料，松滋青皮豆是國內廣泛接受用于致突變性測試的敏感受試生物。為確保實驗性狀的穩(wěn)定性，對種植環(huán)境、過程及豆種收獲均需進行質量控制：定期檢測保種場地的周邊環(huán)境變化及污染狀況，避免增高微核本底值；栽種期間應避免其他蠶豆品種花粉污染，為避免不施用化肥農藥連作種植帶來的蟲害，最好輪作種植；種質收獲后應及時曬干，并挑揀出合適大小，無病斑蟲害的完整健康豆種；實驗前進行浸種、催根，出根率一般應≥90%，偏低時，挑選催更后生長良好的豆種栽培復壯；實驗用豆種有絲分裂指數應gt;20%，空白微核率≤10.0%，參比微核率（參比試樣陽性對照，p=20.0mg/L環(huán)磷酰胺溶液）微核率15.8%～30.8%，2個平行測試相對偏差≤36%。對實驗生物的質量控制，可有效保障監(jiān)測結果的準確性，為環(huán)境管理提供可靠數據。