水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法結(jié)果影響因素分析

摘 要：根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗（GB 4789.10—2016）》第二法開展水產(chǎn)品（凍魷魚）檢驗時，發(fā)現(xiàn)在Baird-Parker平板上選取的4個可疑菌落以革蘭氏陽性桿菌菌落居多，此情況容易造成在后續(xù)鑒定過程中挑取的非金葡菌落概率增加，從而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。故挑取血平板上由Baird-Parker平板典型菌落劃線接種培養(yǎng)得到的典型及可疑金葡菌落再次進(jìn)行確認(rèn)及鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果分析探討影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，以提高實驗室對金葡的檢測能力。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法；水產(chǎn)品；鑒定結(jié)果；影響因素

中圖分類號：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1674-7909（2024）9-155-3

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.09.036

0 引言

金黃色葡萄球菌是生活中最常見的病原菌之一，為革蘭氏陽性球菌，無芽孢，無莢膜，能產(chǎn)生血漿凝固酶［1-3］。人若食用了感染金黃色葡萄球菌的水產(chǎn)品，會出現(xiàn)起頭暈、惡心、腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀［4］。為確保水產(chǎn)品食用安全性，在根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗（GB 4789.10—2016）》［5］第二法開展水產(chǎn)品（凍魷魚）檢驗時，檢測人員需對檢測結(jié)果做出正確判斷，對檢測過程中出現(xiàn)的可能影響鑒定結(jié)果的因素進(jìn)行分析和討論，并采取可行性對策，提升相應(yīng)檢測水平。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

生理鹽水，批號：20230811（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Baird-Parker瓊脂，批號：20230927（青島海博生物技術(shù)有限公司）；血瓊脂平板：豆粉瓊脂，批號：20230912（青島海博生物技術(shù)有限公司）；脫纖維羊血，批號：20240221（青島海博生物技術(shù)有限公司）；營養(yǎng)瓊脂，批號：20230819（青島海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色試劑盒，批號：20230701（青島海博生物技術(shù)有限公司）；凍干兔血漿，批號：20240117（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2 菌株信息

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、表皮葡萄球菌［CMC（B）26069］，均采購于上海魯徽科技有限公司。

1.3 試驗材料

水產(chǎn)品為凍魷魚，其來源為檢樣。

1.4 儀器設(shè)備

電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］，高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），生物安全柜（LIFESCIENCES GROUP），生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.5 檢驗方法

1.5.1 樣品稀釋

稱取25 g魷魚加入含225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打均質(zhì)90 s，制成1∶10（體積比）的樣品勻液。再用1 mL無菌吸管吸取1∶10樣品勻液沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，振搖試管，混勻，制成1∶100（體積比）樣品勻液，按上述操作，依法制備10倍系列稀釋比樣品勻液。

1.5.2 樣品接種

選擇1∶100、1∶1 000、1∶10 000（體積比）的樣品勻液，每組試驗分別吸取1 mL樣液，按0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量接種于3塊B-P平板上（用L形無菌涂布棒涂布平板，涂布時避免觸及平板邊緣）。涂布后的平板靜置于36 ℃培養(yǎng)箱40 min，待樣品勻液被吸收后，倒置平板，培養(yǎng)48 h。

金黃色葡萄球菌在B-P平板上呈圓形濕潤凸起，顏色為灰黑色或黑色且有光澤，菌落直徑為2～3 mm，常有淺色或非白色邊緣，周圍繞以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰帶，用接種針接觸菌落時會有黃油樣黏稠感。

1.5.3 菌落計數(shù)與確認(rèn)

選擇呈現(xiàn)典型金黃色葡萄球菌特征且同一稀釋度菌落數(shù)合計在20～200 CFU的平板，從中選取12個可疑或典型菌落，分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗及血平板劃線，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2 鑒定結(jié)果

如表1所示，經(jīng)菌落計數(shù)器觀察，在3個稀釋度中，符合菌落計數(shù)要求的為10-2稀釋度。

2.1 革蘭氏染色

從Baird-Parker平板上挑取4個可疑菌落經(jīng)革蘭氏染色鑒定，僅可疑菌落1為典型金黃色葡萄球菌菌落，如表2所示。

2.2 血漿凝固酶試驗

選取6個典型金黃色葡萄球菌菌落（與可疑菌落1類似的菌落），將其中5個菌落分別接種至5 mL BHI中，1個菌落劃線接種至營養(yǎng)瓊脂小斜面，同時挑取表皮葡萄球菌［CMCC（B）26069］與金黃色葡萄球菌（ATCC25923）菌落接種至5 mL BHI中作為陰性對照和陽性對照，在36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約20 h，吸取BHI培養(yǎng)物0.8 mL加入凍干兔血漿中，輕微搖晃至完全溶解，放置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，其間每隔0.5 h觀察一次，試驗結(jié)果如表3所示。

2.3 血平板劃線試驗

選取2個與可疑菌落1類似的菌落，劃線接種于血平板，于36 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如表4所示。菌落呈黃色濕潤圓形，光滑凸起，周圍有透明溶血圈。

3 分析與討論

3.1 菌落的選取及標(biāo)記

因從Baird-Parker平板上選取的4個可疑菌落為1個革蘭氏陽性球菌菌落，2個革蘭氏陽性桿菌菌落，1個革蘭氏陽性桿菌加陽性球菌菌落。故在經(jīng)驗不足或難以肉眼確認(rèn)典型金黃色葡萄球菌菌落時，建議在觀察Baird-Parker平板的同時，將同一類型菌落做好編號（條件允許情況下，至少確認(rèn)4個同一類型菌落），方便在革蘭氏染色鑒定后，選取標(biāo)記的菌落進(jìn)行血平板及營養(yǎng)瓊脂小斜面劃線和血漿凝固酶試驗。

3.2 血漿凝固酶試驗注意事項

血漿凝固酶試驗判定標(biāo)準(zhǔn)：在陰性和陽性對照結(jié)果均成立的情況下，樣品倒置后出現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半時，即判為陽性。若結(jié)果可疑，則從NA斜面上挑取菌落至5 mL BHI中，于36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，重復(fù)試驗。根據(jù)表3，可確認(rèn)此樣品血漿凝固試驗酶結(jié)果為陰性。

金黃色葡萄球菌凝集后會發(fā)生自溶現(xiàn)象，故每0.5 h觀察一次，且觀察過程中需要注意不能劇烈搖晃瓶身（因此操作會導(dǎo)致凝塊被振碎，影響結(jié)果的判斷）；致病性金黃色葡萄球菌絕大多數(shù)為血漿凝固酶陽性，故我國食品微生物檢測以血漿凝固酶陽性作為金黃色葡萄球菌的主要判定標(biāo)準(zhǔn)，以革蘭氏染色和溶血試驗結(jié)果作為輔助判定標(biāo)準(zhǔn)［6-7］。

3.3 血平板結(jié)果確認(rèn)

從表4可知，樣品在血平板上呈現(xiàn)明顯金黃色葡萄球菌菌落特征，因Baird-Parker平板上挑取的可疑菌落的革蘭氏陽性桿菌檢出率較高，為進(jìn)一步確認(rèn)檢驗結(jié)果，從血平板上挑取10個典型菌落再次分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗。試驗結(jié)果顯示，革蘭氏染色鏡檢的5個菌落均為革蘭氏陽性球菌，血漿凝固酶試驗的5個菌落均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，且陰、陽性對照成立。

3.4 總結(jié)

從此次試驗來看，樣品中的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的分離效果欠佳，在排除培養(yǎng)基配制不當(dāng)?shù)纫蛩氐那闆r下，考慮可能是Baird-Parker培養(yǎng)基開封時間較長，導(dǎo)致其金黃色葡萄球菌菌落促生長能力降低或抑制非葡萄球菌的能力降低，繼而影響了分離效果。為避免此類情況的發(fā)生，建議實驗室往后在開展金黃色葡萄球菌第二法檢驗劃線Baird-Parker培養(yǎng)基試驗的同時，增設(shè)陽性對照組，以確認(rèn)培養(yǎng)基的有效性。若陽性對照的金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基上生長良好，分離度高，則可排除培養(yǎng)基的問題，考慮為樣品的偶然性事件。

參考文獻(xiàn)：

［1］李留洋.金黃色葡萄球菌檢驗技術(shù)介紹及分析［J］.食品安全導(dǎo)刊，2020（16）：28-31.

［2］鄧錦秀.2022年食品中金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的檢測能力驗證結(jié)果分析［J］.食品安全導(dǎo)刊，2023（27）：67-70.

［3］劉真真，林濤，李光偉，等.金黃色葡萄球菌不同培養(yǎng)與反應(yīng)條件對其血漿凝固酶的影響［J］.檢驗檢疫科學(xué)，2005（5）.

［4］后來旺，李達(dá)容，鄧波，等.金黃色葡萄球菌RAA-LFD快速檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2022，43（4）：331-339.

［5］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.國家食品藥品監(jiān)督管理總局食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

［6］時威，盧勉飛，蔡芷荷，等.凍干兔血漿在金黃色葡萄球菌檢驗中的應(yīng)用研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2012，48（6）：44-47.

［7］王麗哲，晉懷峰，宮樹權(quán)，等.金黃色葡萄球菌污染水產(chǎn)食品的研究［J］.食品科學(xué)，2001（5）：78-80.

（欄目編輯：李 菡）

作者簡介：許志瑛（1991—），女，本科，助理工程師，研究方向：食品檢驗檢測。