辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母單雜交pGADT7載體構(gòu)建

關(guān)鍵詞：辣椒；CaWRKY39；生物信息學(xué)分析；酵母單雜交pGADT7載體構(gòu)建

辣椒（Capsicum annuum L．）是茄科辣椒屬植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。根據(jù)FAO數(shù)據(jù)，2021年我國(guó)辣椒種植面積達(dá)82.7萬(wàn)公頃，約占全球辣椒種植面積的40%，年產(chǎn)值超過(guò)3500億元。但番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的入侵嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。TSWV是布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospo-vzrus）的一種，是世界十大農(nóng)業(yè)病害之一，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元。TSWV侵染辣椒后會(huì)使其株形矮化、株幅變小、果實(shí)嚴(yán)重畸形、單果重降低、結(jié)果數(shù)量及單果種子數(shù)減少。在我國(guó)，TSWV已快速?gòu)淖畛醢l(fā)現(xiàn)的四川和云南擴(kuò)散至遼寧、甘肅、山東等14個(gè)省份，可侵染多種蔬菜作物，已成為我國(guó)辣椒和番茄等主產(chǎn)區(qū)導(dǎo)致絕產(chǎn)的主要病毒，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何有效防控該病毒是保護(hù)辣椒產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的重要問(wèn)題。

已有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在作物抗病性中發(fā)揮重要作用。如：水稻W(wǎng)RKY13、WRKY42、WRKY45-2形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控級(jí)聯(lián)，其中WRKY42可能通過(guò)抑制茉莉酸（JA）信號(hào)相關(guān)基因負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的應(yīng)答，而WRKY45-2轉(zhuǎn)錄激活WRKY13，WRKY13的編碼蛋白則反過(guò)來(lái)轉(zhuǎn)錄抑制WRKY42，從而調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性：過(guò)表達(dá)蘋(píng)果MdWRKY100后，其抗炭疽病菌能力增強(qiáng)，而RNAi基因沉默植株對(duì)炭疽病菌更敏感，表明MdWRKY100在蘋(píng)果響應(yīng)炭疽病中發(fā)揮正調(diào)控作用：CmWRKY15-J對(duì)菊花白銹病原菌掘氏菊柄銹菌具有類似正調(diào)控功能；桃PpWRKY45可以通過(guò)結(jié)合激活抗性基因PpCHI、PpGLU、PpPR-like等啟動(dòng)子中的W-box元件并激活其表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)匍枝根霉菌的耐受性：OsWRKY114能直接結(jié)合幾丁質(zhì)酶的啟動(dòng)子激活其表達(dá)，從而降低水稻對(duì)水稻白葉枯病菌的敏感性。近年來(lái)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在辣椒中的研究也取得了一定的進(jìn)展。報(bào)道顯示，CaWRKY6、CaWRKY15、CaWRKY30等轉(zhuǎn)錄因子可能參與煙草花葉病毒、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉菌和根結(jié)線蟲(chóng)等多種病原體侵染后的植物防御機(jī)制。以上研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以廣泛參與植物的各種生物和非生物脅迫過(guò)程，并且功能具有多樣性，但目前關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子是否參與抗TSWV過(guò)程以及如何發(fā)揮作用尚無(wú)報(bào)道。

本課題組前期通過(guò)TSWV病毒侵染及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，侵染后的辣椒葉片中特異性高表達(dá)，推測(cè)其可能在抗TSWV中發(fā)揮重要作用，但具體功能和作用機(jī)制尚不清楚。本研究從辣椒葉片中克隆基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)CaWRKY39蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行綜合分析，并構(gòu)建的酵母單雜交pGADT7表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步解析CaWRKY39抗TSWV的分子機(jī)理提供技術(shù)支撐和參考。

1材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用辣椒品種是‘蕭新19’，種子購(gòu)于安徽蕭新種業(yè)有限公司。

載體、菌株及試劑：酵母單雜交表達(dá)載體pGADT7（Amp抗性）為云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自有；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司（NEB）；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于艾科瑞生物工程（湖南）有限公司（AG）；TRNzol Universal總RNA提取試劑購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司（ TIANGEN）；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DL2000 DNAMarker、DL10000 DNA Marker、In-Fusion Snap As-sembly cloning kits購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購(gòu)于全式金生物技術(shù)股份（北京）有限公司（Trans-Gen）;Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、2x Phanta Flash Master Mix購(gòu)于諾唯贊生物科技（南京）有限公司（Vazyme）；CaWRKY39基因克隆引物和載體構(gòu)建引物合成及陽(yáng)性菌落測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）完成。

1.2方法

1.2.1植物材料的培育與處理

于2023年3月將辣椒種子播于穴盤(pán)中，待出苗后移栽到裝有土壤和腐殖質(zhì)混合物的塑料盆（10cm×10cm×10cm）中，置于光照培養(yǎng)箱，在（25+2）℃、相對(duì)濕度恒定為（65±5）%、光照周期為光照16h：黑暗8h條件下培養(yǎng)，每2d澆水一次，保證植株正常生長(zhǎng)；待植株生長(zhǎng)至四葉期，采集葉片，立即在液氮中冷凍后保存在-80℃冰箱中。

1.2.2CaWRKY39基因克隆

利用TRNzol Uni-versal總RNA提取試劑于2023年6月提取辣椒葉片的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組分析得到的CaWRKY39編碼序列利用PrimerPremier 6.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物（表1）。PCR反應(yīng)體系：終延伸1min，4℃保存。利用膠回收試劑盒回收純化CaWRKY39全長(zhǎng)CDS序列片段，將純化產(chǎn)物連接至克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl-T1，鑒定的含有CaWRKY39片段的陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3CaWRKY39蛋白的生物信息學(xué)分析基于測(cè)序獲得CaWRKY39基因的堿基序列，利用DNAMAN6.0推導(dǎo)CaWRKY39蛋白序列，利用ExPASy-ProtParam（https：//web. expasy. org/prot-param/）分析CaWRKY39蛋白的理化性質(zhì)，通過(guò)SOPMA軟件（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma. html）預(yù)測(cè)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)．通過(guò)SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用在線預(yù)測(cè)工具NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.11）、TMHMM Server 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.01）、SignalP-4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/），Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）等在線工具分析CaWRKY39蛋白的磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽以及蛋白的亞細(xì)胞定位。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載其他物種的WRKY39蛋白序列，用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（Neighbor-join-ing法，Bootstrap重復(fù)數(shù)為1000，線程數(shù)量為3）。

1.2.4 CaWRKY39基因表達(dá)載體構(gòu)建和酶切鑒定

通過(guò)SnapGene軟件設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)NdeI、EcoRI插入片段的同源重組引物（表1），以pEASY-CaWRKY39質(zhì)粒DNA為模板。PCR反應(yīng)體系：質(zhì)粒DNA1.0uL，上、下游引物各1.5uL，2xPhanta Flash Master Mix 25.0uL， ddH20 21.0uL，共50.0uL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s;98℃變性10s，54℃退火5s，72℃延伸5s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸1min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并利用DNA膠回收試劑盒（TaKaRa，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）回收目的基因片段。用限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI酶切載體pGADT7質(zhì)粒5h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并將酶切產(chǎn)物回收，按照無(wú)縫克隆試劑盒（TaKaRa，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）說(shuō)明書(shū)將酶切純化后的pGADT7載體與回收的帶同源臂CaWRKY39片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，利用含氨芐抗性的LB平板培養(yǎng)基過(guò)夜篩選，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。構(gòu)建的表達(dá)載體命名為pGADT7-CaWRKY39。挑選測(cè)序正確的菌落采用質(zhì)粒提取試劑盒提取pGADT7-CaWRKY39質(zhì)粒DNA，以該質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1CaWRKY39基因克隆

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的CaWRKY39基因CDS序列，利用DNAMAN6.0對(duì)其蛋白序列進(jìn)行推測(cè)分析，結(jié)果（圖1）顯示，CaWRKY39的CDS序列全長(zhǎng)為1035bp，共編碼344個(gè)氨基酸，含有一個(gè)由WRKYGQK7個(gè)氨基酸組成的保守WRKY結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明CaWRKY39蛋白屬于WRKY成員。本實(shí)驗(yàn)以辣椒‘蕭新19’葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致（圖2），通過(guò)回收目的片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、單克隆PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明成功克隆到CaWRKY39基因全長(zhǎng)CDS序列。

2.2CaWRKY39蛋白基本理化性質(zhì)分析

ExPASy-ProtParam在線分析結(jié)果顯示，CaWRKY39蛋白的分子式為C1642 H2653 Nsis 0518 S21，總原子數(shù)為5349個(gè)，分子量為38570.53Da．等電點(diǎn)為9.59，帶正電荷殘基為30個(gè)，帶負(fù)電荷殘基為49個(gè)，總平均親水性為-0.805，不穩(wěn)定系數(shù)為59.71，脂肪族指數(shù)為63.17。表明CaWRKY39蛋白屬于不穩(wěn)定的堿性親水蛋白。

2.3CaWRKY39蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA分析結(jié)果顯示，CaWRKY39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占60.76%，a-螺旋占25.58%，延伸鏈占9.59%，轉(zhuǎn)角占4.07%（圖3A）。進(jìn)一步通過(guò)SWISS-MODEL網(wǎng)站預(yù)測(cè)CaWRKY39蛋白的三維結(jié)構(gòu)，同樣發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)規(guī)則卷曲占比最大，同時(shí)還存在a-螺旋、延伸鏈和轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)（圖3B）。表明CaWRKY39蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲組成，其次為儀-螺旋，延伸鏈、轉(zhuǎn)角占比較小，這可能與CaWRKY39蛋白的功能相關(guān)。

2.4CaWRKY39蛋白磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位分析

磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。經(jīng)NetPhos 3.1分析發(fā)現(xiàn)，CaWRKY39蛋白由38個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)構(gòu)成，包含30個(gè)絲氨酸（Serine）、5個(gè)蘇氨酸（Threonine）和3個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)（圖4A）。根據(jù)CaWRKY39蛋白相應(yīng)的磷酸化潛能，推測(cè)其可能被絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化激活，從而調(diào)控基因的表達(dá)。

亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示CaWRKY39蛋白定位于細(xì)胞核（圖4B），說(shuō)明其為典型的核轉(zhuǎn)錄因子。但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其既沒(méi)有跨膜區(qū)域，也不存在信號(hào)肽，說(shuō)明CaWRKY39蛋白不是定位于生物膜上的膜蛋白，無(wú)跨膜運(yùn)輸，不屬于分泌蛋白。

2.5CaWRKY39蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)CaWRKY39蛋白的序列信息，在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)下載AtWRKY39蛋白序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載其他11個(gè)物種的WRKY39蛋白序列，利用MEGA11軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，辣椒CaWRKY39與棉花GhWRKY39的親緣關(guān)系最近，與小麥TaWRKY39的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，預(yù)示著CaWRKY39蛋白與Gh-WRKY39具有相似功能。

2.6表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證CaWRKY39對(duì)相關(guān)抗性基因的靶向調(diào)控作用，進(jìn)行pGADT7-CaWRKY39酵母單雜交表達(dá)載體構(gòu)建。以pEASY-Ca WRKY39質(zhì)粒DNA為模板，用CaWRKY39-Nde I-F、CaWRKY39-EcoR I-R引物進(jìn)行CaWRKY39基因帶同源臂片段擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和NdeI、EcoRI雙酶切后的線性pGADT7載體進(jìn)行純化回收，隨后利用無(wú)縫克隆試劑盒將目的基因片段導(dǎo)人線性pGADT7載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，目的片段大小為1312bp（圖6），與預(yù)期相符，表明pGADT7-CaWRKY39酵母單雜交表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3討論

目前關(guān)于辣椒WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆及相關(guān)功能研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本研究成功克隆了辣椒CaWRKY39全長(zhǎng)CDS序列，全長(zhǎng)1035bp，共編碼344個(gè)氨基酸；CaWRKY39蛋白總平均親水性為-0.805，不穩(wěn)定系數(shù)為59.71，等電點(diǎn)為9.59．屬于不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白，這與已報(bào)道的CaWRKY30蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果類似。CaWRKY39蛋白結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占比60.76%，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。蛋白磷酸化會(huì)降低該蛋白的穩(wěn)定性，CaWRKY39蛋白的磷酸化位點(diǎn)有38個(gè)，再次驗(yàn)證了該蛋白的不穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮調(diào)控功能。本研究結(jié)果顯示CaWRKY39蛋白定位于細(xì)胞核，表明其可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能。但該蛋白無(wú)跨膜區(qū)域和信號(hào)肽，是非分泌蛋白，形成后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用并根據(jù)植物體需求調(diào)整數(shù)量和狀態(tài)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最顯著的功能是參與植物抗病調(diào)節(jié)過(guò)程。棉花GhWRKY39在本氏煙中過(guò)表達(dá)后，PR抗性基因的表達(dá)顯著上調(diào)，青枯菌的侵染病癥明顯減弱，表明GhWRKY39具有抗青枯病的作用。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，CaWRKY39與GhWRKY39親緣關(guān)系最近，并且CaWRKY39在TSWV侵染下表達(dá)量顯著提高，推測(cè)CaWRKY39具有抗TSWV功能。

本研究利用無(wú)縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建了酵母單雜交表達(dá)載體pGADT7-CaWRKY39，下一步將結(jié)合酵母單雜交誘餌載體構(gòu)建和相關(guān)互作實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證CaWRKY39對(duì)CaPR1等抗性基因的靶向調(diào)控作用，以闡明CaWRKY39轉(zhuǎn)錄因子參與辣椒抗TSWV病毒的分子機(jī)理，進(jìn)而為抗TSWV病毒植物培育和綠色防控提供參考。

4結(jié)論

本研究對(duì)CaWRKY39全長(zhǎng)CDS及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并采用RT-PCR技術(shù)克隆得到CaWRKY39基因全長(zhǎng)CDS序列，進(jìn)一步通過(guò)無(wú)縫克隆的方法成功構(gòu)建了其酵母單雜交pGADT7表達(dá)載體，可為全面深入研究CaWRKY39轉(zhuǎn)錄因子參與辣椒抗TSWV病毒分子機(jī)理提供技術(shù)支持，并為抗TSWV病毒植物培育和綠色長(zhǎng)效防控提供理論依據(jù)。