丹參Remorin基因SｍREＭ1.2的克隆及生物信息學(xué)和表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：丹參；SmREM1.2基因：基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)大宗類(lèi)中藥材之一，臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病等的治療，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，市場(chǎng)需求大，在我國(guó)栽培廣泛。隨著全球變暖和環(huán)境污染等問(wèn)題的加重，丹參生長(zhǎng)發(fā)育受到多種逆境脅迫（干旱脅迫、鹽脅迫等）的影響，阻礙了丹參種植業(yè)的發(fā)展。因此，研究丹參應(yīng)對(duì)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制，開(kāi)發(fā)耐逆基因資源，對(duì)于培育丹參耐逆品種至關(guān)重要。

Remorin蛋白是一類(lèi)與質(zhì)膜脂筏相連的蛋白，介導(dǎo)脂筏微區(qū)的形成：它分布廣泛，在苔蘚植物、裸子植物及被子植物中都有存在。Remorin蛋白N末端結(jié)構(gòu)差異大，為可變結(jié)構(gòu)域，含有介導(dǎo)Remorin蛋白與多種蛋白互作的保守的脯氨酸富集區(qū)域，決定了Remorin蛋白的功能多樣性：C末端包含疏水的coiled - coil區(qū)域，結(jié)構(gòu)高度保守，被認(rèn)為是Remorin蛋白的標(biāo)志性區(qū)域。Re-morln蛋白可以聚合形成寡聚體，組裝成絲狀纖維結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能。Remorin蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在多樣的翻譯后修飾作用，其C末端可以發(fā)生棕櫚?；?、豆蔻酰基化等?；揎椬饔?，以調(diào)節(jié)其膜定位：還可以發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化位點(diǎn)分布在N端可變區(qū)，研究表明CDPK3磷酸化Re-morln可影響其促進(jìn)質(zhì)膜微區(qū)組裝的功能，調(diào)節(jié)病菌等在細(xì)胞間的傳遞與侵染。

越來(lái)越多的研究表明Remorin基因的表達(dá)受激素、逆境脅迫等多種信號(hào)刺激的誘導(dǎo)，參與植物免疫應(yīng)答、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及逆境響應(yīng)等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有廣泛的生物學(xué)功能。在生物脅迫方面，Remorin蛋白參與植物免疫應(yīng)答過(guò)程，響應(yīng)水楊酸的信號(hào)刺激，介導(dǎo)調(diào)節(jié)質(zhì)膜脂筏的組裝，調(diào)控胞間連絲的開(kāi)閉，通過(guò)降低胞間連絲通透性來(lái)阻止病毒在宿主植物細(xì)胞間的擴(kuò)散；也有研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到病毒入侵時(shí)，體內(nèi)的Re-morln蛋白可以加快細(xì)胞自噬的進(jìn)程，進(jìn)而提高生物體的抗病性：同時(shí)，Remorin蛋白可以通過(guò)組裝聚集影響微絲結(jié)合蛋白formin的聚合，從而改變微絲重排，調(diào)節(jié)植物的免疫應(yīng)答。在非生物脅迫方面．Badawi等發(fā)現(xiàn)小麥的耐寒性與Re-morln基因的高表達(dá)具有相關(guān)性，多個(gè)耐寒小麥品種中Remorin基因表達(dá)明顯升高；Zhang等發(fā)現(xiàn)Remorin蛋白可顯著提高胡楊質(zhì)膜囊泡的H+-ATP水解酶活性和H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，進(jìn)而顯著提高了植株的耐鹽性：Yue等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)谷子的SiREM6基因可以促進(jìn)鹽脅迫下種子萌發(fā)率的升高，增強(qiáng)植物的耐鹽能力。

目前關(guān)于丹參中Remorin蛋白功能的研究還較少。本研究基于丹參轉(zhuǎn)錄組及基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，克隆丹參SmREM1.2基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確SmREM1.2蛋白的理化特性，構(gòu)建GFP標(biāo)簽融合表達(dá)載體，分析其亞細(xì)胞定位，并檢測(cè)鹽脅迫處理下SmREM1.2的表達(dá)水平，以探討SmREM1.2的功能，為Remorin蛋白在植物中的應(yīng)用開(kāi)拓新的思路，并為丹參耐逆調(diào)控機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料培養(yǎng)及處理

本研究使用的丹參材料為紫花丹參，種子由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心贈(zèng)與，保存于山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙雙雙實(shí)驗(yàn)室。2021年1月將丹參種子經(jīng)由次氯酸鈉消毒液（NaClO濃度為20%，TritonX-100濃度為0.1%）滅菌后，置于濕潤(rùn)的濾紙上，待萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按體積比1：1配制）中，在人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)，正常生長(zhǎng)2個(gè)月后，選取長(zhǎng)勢(shì)相同的丹參幼苗，使用250mmol/L NaCl采用澆灌法進(jìn)行鹽脅迫處理，分別在處理0、3、6、12h取樣，液氮冷凍后于-80℃保存。

本研究所用煙草為本生煙（Nicotiana bentha-miana），種子由山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙雙雙實(shí)驗(yàn)室保存。2021年8月，將煙草種子經(jīng)由次氯酸鈉消毒液滅菌后，于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，生長(zhǎng)10天后，將煙草幼苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的體積比為1：1）中，于人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)4～6周。

1.2總RNA的提取及cDNA合成

使用RNA提取試劑盒（購(gòu)自諾唯贊公司）提取丹參樣品總RNA．用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer（Thermo Scientific）對(duì)所提取的總RNA進(jìn)行定量分析，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自全式金公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，存于-20℃。

1.3SmREM1.2基因克隆

利用擬南芥基因組網(wǎng)站（https：//www. arabi-dopsis.org/）下載擬南芥REM家族成員AtREM1.2的蛋白序列，以其為探針，在丹參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，鑒定得到SmREM1.2基因（SMil_00007417）的序列信息。用Clone Manager軟件設(shè)計(jì)該基因特異性引物，上游引物序列為5'-GCGTCGACATGGCGGAGGAGCAAGTGAAA-3'．下游引物序列為5'-GCGGTACCTCAGAAACAGC-CAAGTAGTTTCTTT-3'．并由生工生物工程（上海）有限公司合成。以丹參cDNA為模板運(yùn)用Toyobo公司KOD高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min;98℃變性30s，57℃退火30s，68℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；68℃終延伸5min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并切膠回收目的產(chǎn)物，使用諾唯贊DNA回收試劑盒對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行純化。用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Sal I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并連接至克隆載體pCAMBIA1300-GFP，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ca感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送至北京擎科生物科技有限公司青島分公司測(cè)序分析。

1.4生物信息學(xué)分析

運(yùn)用在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)ExPASy（https：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預(yù)測(cè)SmREM1.2蛋白的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等理化特性；運(yùn)用ProtScale（http：//web. expasy. org/protscale/）進(jìn)行蛋白親疏水性預(yù)測(cè)；運(yùn)用TMHMM Server 2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/servlces/TMHMM/）對(duì)SmREM1.2蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；運(yùn)用SignalP 6.0 Server（ht-tps： //services.healthtech.dtu.dk/servlces/SignalP-6.0/）對(duì)SmREM1.2蛋白進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)：運(yùn)用SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？ page=npsa_sopma.html）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；運(yùn)用CDD（http：//www.ncbi．nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）對(duì)SmREM1.2蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

運(yùn)用TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. Arabidopsis.org）檢索擬南芥Remorin家族蛋白氨基酸序列信息，使用Clone Manager軟件將SmREM1.2與4個(gè)擬南芥REM成員進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析。

運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)SmREM1.2蛋白的氨基酸序列，通過(guò)Blast分析（http：//blast. ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi）篩選其他植物中SmREM1.2的同源序列，運(yùn)用MEGA11.0軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）將SmREM1.2與擬南芥、玉米、水稻等的REM家族成員構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，將booststrap設(shè)置為1000。

1.5亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)液氮一熱激法分別將1.3中獲得的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質(zhì)膜標(biāo)記pCAMBIA1300-AtCBLl-mCherry轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，PCR篩選鑒定陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體，于滲透液[10mmol/L MES（pH 5.7），10mmol/L MgCl2，100umol/L乙酰丁香酮]中共孵育2h；運(yùn)用針管將農(nóng)桿菌注射進(jìn)煙草葉片細(xì)胞中，于人工氣候室培養(yǎng)72h，取共表達(dá)pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質(zhì)膜標(biāo)記pCAMBIA1300-AtCB//-mCherry的煙草葉片，在Leica Sp8共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，用波長(zhǎng)488nm和561nm的激發(fā)光檢測(cè)GFP和mCherry通道熒光信號(hào)。

1.6基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行測(cè)定。使用Primer Premier 5.0軟件對(duì)克隆的SmREMl.2基因CDS序列設(shè)計(jì)特異引物（SmREMl.2 F：5'-AG-CAAGTGAAAACGGTCGAG-3';SmREMl.2 R：5'-GGAGGGCTCCGTAAACAGAG-3'）。選用TaKa-Ra生物技術(shù)有限公司的熒光定量試劑盒（SYBRGreen）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：2xSYBR Green ProTaq Premix 5.0uL，cDNA 2.0uL，上、下游引物各0.2uL，用ddH20補(bǔ)足至10.0uL。運(yùn)行程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性Ss，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)測(cè)定程序設(shè)置為95℃變性5s．60℃退火1min．95℃持續(xù)5s，50℃保溫30s。實(shí)驗(yàn)收集的數(shù)據(jù)以丹參Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行均一化處理（引物為SmActinF：5'-GCCCTCGACTATGAACAAGAGC-3'：SmAc-tin R：5'-GATGGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG-3'）。每個(gè)基因3次重復(fù)，依據(jù)2-△△法計(jì)算SmREM1.2的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1SmREM1.2基因的克隆與鑒定

擬南芥包含16個(gè)Remorin蛋白家族成員，分為6個(gè)亞家族（REMl-REM6），其中REMI在植物體內(nèi)表達(dá)豐度高，分布廣泛，功能多樣，調(diào)節(jié)下胚軸及根的伸長(zhǎng)，調(diào)控植物對(duì)病原菌的抵御能力。本研究以擬南芥AtREMl.2蛋白序列為探針，依據(jù)丹參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定獲得與AtREM1.2同源性較高的SmREM1.2序列，以丹參cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆到目的條帶（圖1），測(cè)序得知SmREM1.2基因CDS序列全長(zhǎng)為585 bp，編碼194個(gè)氨基酸。

2.2SmREM1.2的生物信息學(xué)分析

2.2.1SmREM1.2蛋白理化性質(zhì)及親疏水性分析

ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SmREM1.2蛋白的分子式為C944 H1563 N255 0295 S5，分子量為21365.63Da，脂肪系數(shù)為75.57，理論等電點(diǎn)為6.69，不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)59.75，為不穩(wěn)定的弱酸性蛋白。SmREM1.2蛋白的194個(gè)氨基酸中包含酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）及堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）各37個(gè)。利用ProtScale預(yù)測(cè)SmREM1.2蛋白的親／疏水性，結(jié)果（圖2）顯示，蛋白序列中第38位脯氨酸（Pro）處具有親水性最大值，達(dá)1.553，第103位賴(lài)氨酸（Lys）處具有親水性最小值（-1.254），親水性平均值為-0.818，表明該蛋白主要表現(xiàn)親水性。

2.2.2SmREM1.2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用TMHMM對(duì)SmREM1.2的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)分析SmREM1.2蛋白的氨基酸序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

運(yùn)用SignalP 6.0對(duì)SmREM1.2蛋白進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)，未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽裂解位點(diǎn)，表明SmREMl.2蛋白不具有信號(hào)肽，該蛋白屬于非分泌型蛋白。

2.2.3SmREM1.2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用NCBI的CDD（Conserved

Domain

Database）數(shù)據(jù)庫(kù)分析SmREM1.2蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖3）顯示，該蛋白中存在Remorin家族保守的Remorin_N和Remorin_C結(jié)構(gòu)域，表明其屬于Re-monn基因家族。

2.2.4SmREM1.2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)SOPMA預(yù)測(cè)分析結(jié)果（圖4）顯示，SmREM1.2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在由116個(gè)氨基酸組成的a螺旋、由59個(gè)氨基酸組成的無(wú)規(guī)則卷曲、由14個(gè)氨基酸組成的延伸鏈、由5個(gè)氨基酸組成的I3轉(zhuǎn)角，分別占比59.79%、30.41%、7.22%、2.58%。

2.2.5SmREM1.2蛋白的同源性分析

將SmREM1.2蛋白序列與AtREM1亞家族的4條蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與擬南芥AtREM1亞家族蛋白的同源性均達(dá)到90%，且C端都具有高度保守的coiled-coil模體，屬于典型的REM蛋白。

2.2.6SmREM1.2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以SmREM1.2蛋白序列為目的序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定出9個(gè)不同物種的同源序列，進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與同屬物種芡歐鼠尾草的REM蛋白同源性較高，聚類(lèi)關(guān)系最近。

2.3SmREM1.2的亞細(xì)胞定位分析

蛋白亞細(xì)胞定位分析可以反映目的基因編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及空間分布，而由基因的空間分布可知基因發(fā)揮功能的場(chǎng)所，從而為基因功能的研究提供線(xiàn)索。為了進(jìn)一步分析SmREM1.2在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了pCAMBIA1300-SmREM1.2-GFP重組載體（以下簡(jiǎn)稱(chēng)SmREM1.2-CFP），并以AtCBL1-mCherry作細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌中，用農(nóng)桿菌注射煙草葉片，使其在煙草葉片細(xì)胞中表達(dá)，取SmREM1.2-GFP和AtCBL1-mCherry共表達(dá)的煙草葉片，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，對(duì)SmREM1.2進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果（圖7）顯不SmREM1.2-GFP與質(zhì)膜定位的AtCBL1蛋白具有明顯共定位，表明SmREM1.2定位于細(xì)胞膜上，是質(zhì)膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白。

2.4SmREM1.2基因在鹽脅迫下的表達(dá)分析

已有報(bào)道表明REM蛋白是植物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)蛋白，參與植物耐鹽脅迫調(diào)控過(guò)程。為了探索SmREM1.2對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)情況，本研究對(duì)丹參幼苗進(jìn)行鹽脅迫（250 mmol/L NaCl）處理，測(cè)定處理0、3、6、12h的SmREM1.2相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖8）顯示，鹽脅迫使SmREM1.2基因顯著上調(diào)表達(dá)，處理6h的相對(duì)表達(dá)量最高，約為0h的5.1倍，之后該基因的表達(dá)量又顯著下降。

3討論與結(jié)論

Remorin蛋白是陸生植物特有的蛋白之一，可與細(xì)胞質(zhì)膜上的脂筏相連，調(diào)控脂筏微區(qū)的形成，改變膜的流動(dòng)性，影響胼胝體的積累，控制胞間連絲的關(guān)閉，調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌侵染的抵御能力及對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程。Remorin蛋白通常以聚集形式發(fā)揮功能，可以組裝成纖維狀聚合體，但這種聚集會(huì)影響Remorin蛋白被招募上膜的過(guò)程。Remorin蛋白包含N端可變區(qū)、中央盤(pán)繞（coiled-coil，CC）結(jié)構(gòu)域及C端的膜錨定區(qū)（C-terminal anchor，CA）。其中，CC結(jié)構(gòu)域參與Remorin蛋白多聚體的組裝．CA影響其錨定上膜的過(guò)程。本研究通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析，確定SmREMI.2包含Remorin蛋白家族特征性CC結(jié)構(gòu)域，初步證明了SmREM1.2屬于Remorin蛋白家族成員，推測(cè)其也具備形成多聚體的理化特性。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2蛋白與多種植物Remorin蛋白的同源性都較高，說(shuō)明Remorin蛋白進(jìn)化較穩(wěn)定，在多物種間具有普遍功能，對(duì)于植物細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)具有重要意義。進(jìn)一步的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SmREM1.2蛋白是親水性蛋白，無(wú)明顯的信號(hào)肽切割點(diǎn)，不是分泌蛋白，這與已報(bào)道的Remorin蛋白的性質(zhì)相似。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明SmREM1.2蛋白存在大量的a螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，僅含有極少量的延伸鏈及轉(zhuǎn)角，這間接證實(shí)了SmREM1.2蛋白包含CC結(jié)構(gòu)域，是Remorin蛋白家族的成員?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明Remorin蛋白不包含明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，不是典型的跨膜蛋白。本研究將SmREM1.2克隆到GFP融合表達(dá)載體上，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞膜上，這為探索該蛋白的細(xì)胞膜功能提供了依據(jù)。

研究表明，Remorin蛋白參與植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程，可增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫等的抵御能力。本研究利用qRT-PCR法分析發(fā)現(xiàn)SrnREM1.2基因受到鹽脅迫的誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，表明其可能參與調(diào)控丹參對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答。

本研究結(jié)果為探索SmREM1.2在丹參耐逆調(diào)控上的功能奠定了理論基礎(chǔ)，也為研究丹參中Remorin蛋白的作用模式提供了新思路。